紫黄质脱环氧化酶在烟草中的过量表达和反义抑制研究

叶黄素循环被发现具有热耗散的作用后，已引起人们广泛的关注。目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上，在跨膜质子梯度（ΔpH）形成后，玉米黄质（zeaxanthin;Z）和环氧玉米黄质（antheraxanthin;A）能够从叶绿素中吸收过多的激发能，并以热能的形式耗散到体外，从而保护光合器官免受强光的破坏。紫黄质脱环氧化酶（Violaxanthin de-epoxidase;VDE）是叶黄素循环的关键酶，存在于植物类囊体内腔中，它催化紫黄质（violaxanthin）脱环氧化生成环氧玉米黄质(A)和玉米黄质(Z)。本文利用过量表达和反义抑制技术获得两种转基因烟草植株，并用于研究紫黄质脱环氧化酶在叶黄素循环中的作用。 首先我们从烟草中克隆了编码VDE酶的基因，分别以正向和反向插入到具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，构建了Tvde基因的过量表达载体pCBTO和反义抑制表达载体pCBTA。然后通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)，获得了过量表达和反义抑制两种转基因植株。PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Southern杂交检测结果表明，Tvde基因已整合到转基因烟草的基因组中，外源基因在转基因烟草基因组中以1个拷贝的形式存在。VDE酶活性测定表明，在反义抑制转化体中VDE酶活性被抑制60%，而在过量表达转化体中VDE酶活性提高了75%。通过色素的HPLC分析和荧光动力学测定结果表明，强光处理后，在反义抑制转化体和过量表达转化体中，Z的含量，DES，NPQ和Fv/Fm等数据说明转基因烟草中VDE含量与植物非光化学猝灭能力有直接关系，进而说明叶黄素循环具有热耗散的功能。