玉米、谷子基因转化的研究

本工作用BT基因、PinⅡ基因和bar基因对青饲玉米、谷子进行了基因转化的研究，并且对转基因的受体、转基因的方法、转化后的筛选、检测及植株再生等问题进行了探讨。 玉米胚性细胞系，包括胚性愈伤组织和胚性细胞悬浮系，可作为基因转化的受体，它亦是原生质体培养的关键。玉米的基因型对胚性细胞系的获得有很大的影响。在相同的培养条件下，九个青饲玉米品系都得到了I型愈伤组织，但仅有两个品系(232和235)得到了胚性细胞系(L32和L35)。幼胚的长度及年龄也是影响诱导形成胚性愈伤组织的一个重要因素，最佳胚长是1-1.5mm，最佳胚龄是授粉后10-12天的幼胚。另外，适当提高蔗糖浓度对胚性细胞悬浮系的建立及保持均有好处。 从玉米原生质体培养获得了再生植株．在此基础上用电激法和PEG法将BT基因导入玉米原生体，发现在原生质体培养过程中，同对照相比，第一次细胞分裂及形成愈伤组织的时间往后推移． 诱导玉米I型愈伤组织没有基因型的限制，可以从大多数玉米品系中得到。并且玉米I型愈伤组织具有极强的分化能力．我们将玉米I型愈伤组织作为基因枪法转化的受体，获得了转基因工程植株。目前，尚未见这方面的报道． 基因枪法转化玉米胚性细胞系，得到抗性愈伤组织的效率约为1/40。用直径约3mm的玉米I型愈伤组织块作基因枪法转化受体，转化后经筛选平均每块可得到1-4个抗性愈伤组织系。用PEG和电激法转化玉米原生质体，转化后原生质体再生愈伤组织中，抗性愈伤组织的得率为9.3%和8.9%， 基因枪法适应完整的细胞和组织的转化，可较快得到抗性植株，在玉米基因转化研究中， 为了较快地得到转化植株，用基因枪法较电激法和PEG法更好，在玉米三种基因转化的受体中（原生质体、胚性细胞系和I型愈伤组织），以I型愈伤组织作受体最好，用它作受体可以避免原生质体培养的困难，克服获得胚性细胞系的基因型的限制。 胚性细胞系对抗菌素的耐受性随继代时间增长而增加．I型愈伤组织对抗菌素的耐受性 同愈伤组织块的大小呈正相关。 由于玉米愈伤组织对卡那霉素的本底抗性较高，所以需要用高浓度(800mg/L)的卡那霉 素进行筛选，过高的选择压力对芽的分化有抑制作用．用电激和PEG处理后的原生质体再生的愈伤组织，经卡那霉素筛选出的抗性愈伤组织未能得到再生植株。而对照则得到了再生植株。用PPT和Hyg筛选出的抗性愈伤组织得到了再生植株． 用PCR和Southern杂交对抗性愈伤组织和再生植株进行检测，证明外源基因已整合到 玉米基因组中。得到了携有BT基因、bar基因或PinⅡ基因的愈伤组织或工程植株。 用豫谷一号的幼穗诱导获得了胚性愈伤组织，基因枪转化后，经PPT筛选得到抗性愈伤组织。每个5cm的培养皿内装有谷子胚性愈伤组织约0.5g，经筛选后可得到5-10块抗性愈伤组织，此PPT抗性的愈伤组织用PCR和Southern杂交检测，证明bar基因已整合到了谷子的基因组中。从转化愈伤组织中已分化出了再生植株。

谷子体细胞无性系变异和抗除草剂基因转化研究

谷子是我国北方具有区域重要性的禾谷类粮食作物。谷子的体细胞无性系变异和外源基因转化相对其它作物研究较少。本研究利用谷子生产的育种中应用的多个优良品种为材料，分析了谷子体细无性系变异发生的影响因素、变异性和频率、DNA分子水平变异和育种应用等问题;采用基因枪法和花粉管通道法，进行了谷子抗除草剂基因转化研究。 主要结果包括： 1. 通过几种外植体的愈伤组织诱导分析,找到了小花分化期前后的谷子幼穗是愈伤组织诱导的最好外植体.提出谷子愈伤组织可按生长状态和结构划分为质密型、松软型和松散型三种基本类型的观点。前两种为胚性愈伤组织并可相互转换，松软型愈伤组织生长状态稳定，可塑性好，是继代培养和因基化的首选类型。供试品种中豫谷1号、高39、郑407和矮宁黄为易培养品种，矮88、豫谷2号、系238、冀14号、C445和青丰谷为相对难培养品种。这些结果为谷子组织培养和生物技术操作提供了基础资料。 2. 首次对多个谷子品种较大群体的无性系变异进行了分析。结果表明，以R_2株系为单位的谷子体细胞无性系表现型变异频率平均为13.0%，不同基因型的变幅为4.3～32.9%;变异涉及株高、抽穗期、穗粒重、出谷率、叶鞘色、育性、抗病性、米色、穗型等多个性状，多数变异为株高和抽穗期等数量性状，少数为矮秆等质量性状：变异的性状多数能在R_3稳定并遗传给后代。从谷子体细胞无性系变异中选出了一批农艺性状得到改良的新品系，其中系103已进入省区域试验，并提供给多家育种单位作为亲本应用。 3. 将RAPD分析技术引入谷子体细胞无性系变异研究。豫谷2号无性系的RAPD多态性变化既有亲本带的缺失，也有新带的产生。用RAPD多态性变化的SMC值度量无性系同亲本相比DNA水平变异的大小，表现型发生变异的无性系,其SMC值分别为0.905～1.0;表现型未发生变异的无性系，RAPD多态性也可能发生变化，其SMC值分布为0.953～1.0。 4. 通过Gus基因瞬时表达单位数的比较，优化了JQ－700基因枪转化谷子松型愈伤组织的操作参数：质粒DNA用量3μg/mg钨粉，CaCl_2农度1.5M，亚精胺浓度40mM，样品室高度7cm，粗弹头为微弹载体，每皿愈伤组织用量1～2g，每次轰击钨粉用量50μg，轰击前4小时和轰击后16～20小时，用含蔗糖150g/l的高渗培养基处理。利用该技术体系，以bar基因为目的基因转化豫谷2号愈伤组织。经选择培养和植株再生，首次获得了抗0.1% bialaphos的正常可育植株，经PCR和Southern blot分析，bar基因已整合到转化体的基因组中，为创造抗除草剂的谷子新种质提供了材料和技术基础。 5. 研究了花粉管通道法转化和花粉介导的基因枪转化谷子的可行性。花粉管通道法转化后代中，获得了抗0.1% bialaphos的抗性植株，经X-gluc组织化学检测，抗性植株叶片的Gus反应为阳性。初步说明该植株可能为转化体，在谷子上为花粉管通道法转化的可行性提供了佐证。花粉介导的基因枪转化未获得转化体。 本文对体细胞无性系变异形成的原因和应用、无性系变异的分子生物学分析、以及谷子的外源基因转化方法等问题进行了讨论。

黍子叶绿体光系统Ⅱ32kDa蛋白基因：psbA的分子克隆及其在不同光质诱导下的转录调节

本文以我国的一种古老作物也是一种C4植物一黍子(Pannicum miliaceum)为材料，克隆了其叶绿体光系统Ⅱ反应中心32kDa蛋白的基因—psbA，研究了不同光质对其表达的影响，并讨论了psbA转录调控的可能机理。 用无水法从黍子幼，苗分离其叶绿体，裂解后用常规的饱和酚抽提法制备cpDNA，并用于A-T含量测定，电镜观察和psbA的基因克隆．结果表明，黍子cpDNA的A-T含量(67%)与其它高等植物的A-T含量(61-67%)基本一致。根据电镜观察，其分子大小在36-40um之问，相当于79×l06Da或127kb。除了环状的大分子cpDNA外，我们也观察到了一些环状的小分子cpDNA。据此，我们认为，叶绿体基因组在体内可能是处于一种动态的变化过程中，这种变化或许是适应其功能的需要，也或许是内共生系统进化过程中遗留下来的叶绿体祖先的行为。 黍子cpDNA经EcoRI消化后，建立了专一性片段的克隆库，并从中筛选出了呈psbA杂交阳性的克隆．Southern杂交结合限制性内切酶分析表明，含黍子psbA的EcoRI的限制片段长约2.Okb，较水稻和大麦的短约0.2kb。 以白光、红光，兰光、远红光和黑暗五种不同的处理培养黍子幼苗，叶片采收后用于叶绿素积累，高分子量cpRNA积累和psbA的Northern Spot分析。结果表明，不同的光质促进叶绿素积累和高分子量cpRNA积累的效率是平行的，其中红光较兰光和远红光有效，而复合光（白光）的作用效果最好。当以白光的效率为100%时，我们可以分别求出不同光质对叶绿素积累和高分子量cpRNA积累的相对效率值，表明高分子量cpRNA的积累对光的依赖性要比叶绿素积累对光的依赖性大的多。psbA的Northern Spot分析表明，不同光质下psbA转录本的积累与高分子cpRNA的积累是一致的。据此我们推测，在黍子叶绿体的光诱导发育过程中，psbA的转录过程可能不受光信号的直接调控，而是受叶绿体发育状态控制的恒定变化过程。其表达的调节作用可能主要在转译或转译后水平上。

谷子（Setaria italical L.）叶绿体psbD基因的分子克隆

本文用改良的高盐pH方法提取了龙谷25、龙谷28的叶绿体DNA，用pTB20质粒上含有烟草叶绿体psbD基因的pstI/SacⅡ片段进行了鉴定。并初步发现龙谷25和龙谷28在其叶绿体基因psbD结构序列或附近3'下游区存在者多态性。以pUC19质粒为载体，E.coli HB101为宿主菌，克隆了谷子叶绿体DNA 4.8kb的SacⅠ片段，得到了重组质粒，命名为pSIBD，并对sPIBD重组片段进行了限制图谱解析。

谷子和甘蔗C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其转基因水稻光合效率的提高

水稻是我国重要的粮食作物之一，它是一种典型的C3植物。与其它C3作物不一样的是，水稻的生长需要相对较高的温度和充足的阳光照射。然而高温和高光强的生长环境更加适合于C4植物的生长，更加有利于发挥C4植物高光合效率的特点。因此本论文希望将C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入水稻，获得一种更加适合高温和高光强生活环境的“C4型”水稻，这对于提高水稻的产量，满足人口增长对粮食需求具有重大意义。 本论文从C4植物谷子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，获得了具有自主知识产权的基因克隆，并将它们导入粳稻品种中花8号，进而对转基因材料的光合生理特性进行了研究。结果如下： 首次从谷子中得到了ppc基因两个cDNA克隆，分别命名为Mppc1和Mppc2。前者是一个C3型的ppc基因，它可能属于在根中特异表达的C3-2型ppc基因;后者是在绿色叶片中大量表达的C4型ppc基因。它们所编码的蛋白的氨基酸残基数分别为961和964，序列同源性为82.5%。C4型PEPC多出的3个氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我们得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非编码区，2895bp的编码区和256bp的3'非编码区。 首次获得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名为Sppc。它包括95bp的5'非编码区、2886bp的编码区，和224bp的3'非编码区。 利用所克隆的基因，分别连上强组成型启动子Ubiquitin启动子和强光调控启动子Rubisco小亚基启动子后，再插入两个标记基因不同的表达载体pCB和pPCB的多克隆位点中，构建了八个含有外源ppc基因的植物表达载体pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C4型ppc 核基因的载体pCB-ZMppc，共有9个载体。利用农杆菌介导法进行了水稻的转化，各个载体都获得了大量的转基因植株。对标记基因潮霉素磷酸转移酶基因hpt和磷酸甘露糖异构酶基因pmi以及导入的目的ppc基因的PCR扩增检测，结果显示绝大多数转基因植株都能扩增出目的片段，而未转化的植株则没有扩增产物。对部分转基因水稻的Southern和Western杂交以及RT-PCR分析都表明，无论从DNA水平、mRNA水平，还是从蛋白质水平上都证明外源ppc基因都成功地导入了水稻，并获得了正确的表达。 对各载体转基因植株PEPC活性大规模的测定表明，转入玉米完整C4型PEPC核基因（有内含子）的水稻表现出极大的表达效率，大多数转基因材料的PEPC活性为对照的10-20倍，其活性最高可达到对照的44倍。转入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表达的效率很低，多数材料活性增加仅为对照的2-5倍，但也有极少数材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亚基启动子控制的ppc基因在水稻的表达活性要略高于Ubiquitin启动子控制的ppc基因。以上结果说明ppc基因的内含子在其转录或mRNA的稳定上起着重要作用。 对部分转基因材料气体交换特征的研究发现，随着转基因水稻PEPC活性的增加，净光合速率也有逐渐增加的趋势。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三个单株净光合速率比对照增加了39.8%、13.7%和28.6%，而它们的PEPC活性比对照分别增加了21.2、21.9和23.6倍。 转PEPC水稻的净光合速率与气孔导度具有显著的相关性。这说明表达的外源ppc 基因产物PEPC参与了转基因水稻的气孔运动，使气孔开放程度增加。更有意义的是过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率，这就增加了其耐旱能力。在光抑制条件下转基因水稻也具有更高的光合能力。这些特征表明转ppc基因的水稻比对照更加适合于水稻高温高光强和干旱的原生环境。

Rickettsia-like organism infection in a freshwater cultured fish Ophiocephalus argus C. in China

From 2001 to 2002, a new and emergent infectious disease of Ophiocephalus argus occurred in a fishery in Hubei Province, China, with an incidence of 60% similar to 70% and a mortality as high as 100 %. The diseased fish showed an enlarged abdomen, the millet-like nodules in internal organs, and the swollen kidney which was composed of 5 similar to 10 sarcoma-like bodies in cream or gray-white colour or ulcerated into beandregs-like substance. Light microscopic observation revealed the basophilic or acidphilic inclusions in cytoplasm of the cells and the granulomas, a diffusive chronic inflammation in internal organs. Further analysis under an electron microscope indicated that the intracytoplasmic inclusions were rickettsia-like organisms (RLOs) that are either spherical or coccoid, with variable size, ranging from 0.5 similar to 1.5 mum in diameter, and enclosed within membrane-bound cytoplasmic vacuoles. RLO had a central nucleoid region with some fine filamentous structures and an electron-dense granule. Its cytoplasm contained abundant ribosomal bodies. Occasionally, RLO appeared to be divided by binary fission. RLOs were also observed in the homogenized tissue of infected fish. The results suggested that the death of cultured O. argus was caused by RLO infection.

高产抗旱优质谷子新品种辐谷7号的选育与推广利

利用400Gy 60Co γ射线处理87070谷子品系干种子,选育出辐谷7号新品种。该品种具有株型紧凑、茎秆矮、高产抗旱优质并且适应种植地区广等特点。2002年2月通过陕西省农作物品种审定委员会审定,截止2008年在黄土高原地区累计推广10.8万hm2。

论高粱的抗旱性及在旱区农业中的地位

本文以笔者研究组多年研究结果为基础,以玉米为主要参比作物,就干旱逆境下高粱的产量表现、水分利用及抗旱特性进行了论述。认为高粱是一种综合抗旱能力很强的作物,尤其具有低耗水、高水分利用效率特性,其耐旱性显著高于玉米,也高于谷子和苜蓿,属于一种典型的模式抗旱作物,具有重要的生产和研究价值。指出高粱作为抗逆性很强的粮饲酿兼用作物,特别是作为一种能源植物,仍具良好的发展前景。建议今后在降水量低于450mm、热量可满足生长的地区扩大高粱种植面积,同时加强对其整体抗旱性机理及抗旱基因组的研究。

长期施氮磷化肥对不同种植体系土壤有效硫累积研究

以22 a定位试验为基础,在黄土高原旱地研究了长期施用氮磷化肥,对不同种植体系土壤有效硫在剖面上分布与累积状况。结果表明,在60-80 cm土层各处理出现第一个累积峰,累积峰值为:玉米-小麦(2 a)+糜子轮作27.07 mg/kg,豌豆-小麦(2 a)+糜子轮作25.42 mg/kg,小麦(2 a)+糜子-玉米轮作24.23 mg/kg,豌豆-小麦(2 a)+玉米轮作22.61 mg/kg,小麦连作16.56 mg/kg,红豆草-小麦(2 a)轮作15.14 mg/kg;在120-180 cm土层又出现有效硫的第二个累积峰,累积峰值为:小麦(2 a)+糜子-玉米轮作34.20 mg/kg,豌豆-小麦(2 a)+糜子轮作32.16 mg/kg,豌豆-小麦(2 a)+玉米轮作31.00 mg/kg,红豆草-小麦(2 a)轮作30.32mg/kg,玉米-小麦(2 a)+糜子轮作29.16 mg/kg,小麦连作26.22 mg/kg。0-200 cm土层有效硫总累积量玉米-小麦+糜子轮作高达559.64 kg/hm2,其次是小麦+糜子-玉米轮作为538.88 kg/hm2,豌豆-小麦+糜子轮作为514.34 kg/...

黄土丘陵区梯田谷子养分循环特征与生产力关系的研究

以新修梯田7年长期肥料定位试验为依据,研究了不同施肥条件下谷子各部位生物量、养分携出量、养分平衡以及耕层土壤养分时空变化。结果表明,有机肥与N、P肥配合施用可提高谷子的籽粒产量和生物产量。养分携出量的大小顺序为籽粒>叶>糠秕>茎,为同类地区农业生产及生态环境建设提供科学依据。

宁南旱地作物降水生产潜力及其适度开发研究

1997～ 1999年在宁南半干旱偏旱区国家宁南 (海原 )旱农试区设置了旱地糜子与春小麦降水生产潜力及其适度开发试验 ,采用肥力梯度法研究有限降水条件下旱地糜子与春小麦的最大产量与适宜开发度。研究结果表明 ,宁南半干旱偏旱区旱地糜子 3年 (3种降水年型 )平均降水生产潜力为 176 0 .5 kg/ hm2 ,水分利用效率 WU E为0 .6 47kg/ m3 ,潜力适宜开发度为 90 % ,适宜施肥量为氮 90 kg/ hm2、磷 45 kg/ hm2 ;宁南旱地春小麦 3年 (1998～1999年 ,有冬灌 )平均水分生产潜力和 WU E分别为 2 5 5 4.0 kg/ hm2 和 0 .90 3kg/ m3 ,1997年纯旱地降水生产潜力和 WUE分别为 115 8.0 kg/ hm2 和 0 .6 90 kg/ m3 ,潜力适宜开发度为 85 % ,适宜施肥量为氮 6 0 kg/ hm2 、磷 30 kg/hm2 。