Proteomic detection of changes in protein expression induced by cordycepin in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells

The nucleoside analogue cordycepin (3'-deoxyodenosine, 3'-dA), one of the components of cordyceps militaris, has been shown to inhibit the growth of various tumor cells. However, the probable mechanism is still obscure. In this study, the inhibition of cell growth and changes in protein expression induced by cordycepin were investigated in BEL-7402 cells. Using the MTT assay and flow cytometry, we found that cordycepin inhibits cell viability and induces apoptosis in BEL 7402 cells. Additionally. the proteins were separated using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, and eight proteins were found to be significantly, affected by cordycepin compared to untreated control; among them, two were downregulated and six were upregulated. Of the eight proteins, six were identified with peptide mass fingerprinting using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) after in-gel trypsin digestion. These proteins are involved in various aspects of cellular metabolism. It is suggested that the effect of cordycepin on the growth of tumor cells is significantly related to the metabolism-associated protein expression induced by cordycepin. Copyright 2008 Prous Science, S.A.U. or its licensors. All rights reserved.

Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells

Rhein, an anthraquinone derivative of rhubarb, inhibits the proliferation of various human cancer cells. In this paper, we focused on studying the effects of rhein on human hepatocelluar carcinoma BEL-7402 cells and further understanding the underlying molecular mechanism in an effort to make the potential development of rhein in the treatment of cancers. Using MTT assay and flow cytometry, we demonstrate a critical role of rhein in the suppression of BEL-7402 cell proliferation in a concentration- and time-dependent manner. The increase of apoptosis rate was observed after incubation of BEL-7402 cells with rhein at 50-200 mu M for 48 hours, and the cells exhibit typical apoptotic features including cellular morphological change and chromatin condensation. Moreover, rhein-induced cell cycle S-phase arrest. Additionally, after rhein treatment, expression levels of c-Myc gene were decreased, while those of caspase-3 gene were increased in a dose-dependent manner by using real-time PCR assay. The results demonstrate for the first time that cell cycle S-phase arrest is one of the mechanisms of rhein in inhibition of BEL-7402 cells. Rhein plays its role by inducing cell cycle arrest via downregulation of oncogene c-Myc and apoptosis through the caspase-dependent pathway. It is expected that rhein will be effective and useful as a new agent in hepatocelluar carcinoma treatment in the future.

Compensation for self-focusing by use of cascade quadratic nonlinearity

We demonstrate theoretically and experimentally compensation for positive Kerr phase shifts with negative phases generated by cascade quadratic processes. Experiments show correction of small-scale self-focusing and whole-beam self-focusing in the spatial domain and self-phase modulation in the temporal domain. (C) 2001 Optical Society of America.

A novel anti-tumor protein extracted from Meretrix meretrix Linnaeus induces cell death by increasing cell permeability and inhibiting tubulin polymerization

Discovery and development of new pharmaceuticals from marine organisms are attracting increasing interest. Several agents derived from marine organisms are under preclinical and clinical evaluation as potential anticancer drugs. We extracted and purified a novel anti-tumor protein from the coelomic fluid of Meretrix meretrix Linnaeus by ammonium sulphate fractionation, ion exchange and hydrophobic interaction chromatography. The molecular weight of the highly purified protein, designated MML, was 40 kDa as determined by SDS-PAGE analysis. MML exhibited significant cytotoxicity to several cancer cell types, including human hepatoma BEL-7402, human breast cancer MCF-7 and human colon cancer HCT116 cells. However, no inhibitory effect was found when treating murine normal fibroblasts NIH3T3 and benign human breast MCF-10A cells with MML. The cell death induced by MML was characterized by cell morphological changes. The induction of apoptosis of BEL-7402 cells by MML was weak by DNA ladder assay. The possible mechanisms of its anti-tumor effect might be the changes in cell membrane permeability and inhibition of tubulin polymerization. MML may be developed as a novel, highly selective and effective anti-cancer drug.

文蛤抗肿瘤多肽的分离纯化及其作用机理的研究

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病。目前的抗肿瘤药物存在选择性差、毒副作用大等缺点，寻找高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当前肿瘤研究的重要内容。近年来，海洋来源的具有抗肿瘤活性物质的研究取得了很多成果，获得了多种高活性、毒副作用小、作用机制新颖的活性化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供了新思路。 文蛤又名花蛤，属帘蛤科、Veneridae文蛤属。在我国大部分海域都有分布。文蛤有清热利湿、化痰、散结的功效，对肝癌有明显的抑制作用。从传统海洋药物文蛤中筛选具有抗肿瘤活性物质，并探讨其抗肿瘤机制，为开发新型抗肿瘤海洋药物提供理论依据与实验基础，并可进一步开发海洋贝类的药用价值。本论文通过离子交换、凝胶过滤等方法从文蛤中提取分离抗肿瘤活性多肽；并通过基质辅助激光解吸技术、电镜技术、流式细胞仪技术，研究了文蛤多肽对人肝癌BEL-7402的增殖作用及体内外抗肿瘤活性作用，探讨了其抗肿瘤作用的机理。通过研究发现文蛤多肽的抗肿瘤作用方式可能是通过改变肿瘤细胞膜通透性，进而破坏微管蛋白聚合、阻滞细胞周期，产生抑制肿瘤细胞增殖的活性。通过裸鼠动物实验发现，该多肽在剂量在25mg/kg、50mg/kg和75mg/kg时的抑瘤率分别为42%、57%和72%（P<0.01）。 关键词: 文蛤、多肽、MMT、人肝癌BEL-7402细胞、裸鼠

三种红藻活性物质的发现及松节藻醇提物抗糖尿病药理研究

海藻是海洋生物中的一大类群，由于其特殊的生活环境，能够代谢产生大量结构独特多变和活性特殊多样的代谢产物，是化学和生物活性多样性研究的重要对象之一。我国海域辽阔，海藻资源丰富，为寻找结构新颖、生理活性独特的先导化合物，加强对海藻资源的开发利用，本论文对中国沿海的三种海洋红藻进行了化学成分和生物活性研究，同时对山东青岛海域生物量丰富的一种海洋红藻松节藻进行了动物体内抗糖尿病活性研究。 利用正相硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱以及反相HPLC和重结晶等现代分离手段，对山东青岛沿海的红藻扇形叉枝藻（Gymnogongrus flabelliformis）进行了系统的化学成分研究，从中得到单体化合物26个，通过波谱学方法（IR、MS、NMR等）鉴定了他们的结构，分别为(3R,6R,7E)-(+)-3-O-phenylacetyl- 4,7-megastigmadiene-9-one（1），(3R,7E)-(-)-3-O-phenylacetyl-5,7-megastigmadiene -9-one（2），(3S,6R,7E)-(+)-3-hydroxyl-4,7-megastigmadien-9-one（3），(3S,5R,6S,7E)- (-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（4），(3S,5S,6R,7E)-(+)-3-hydroxy- 5,6-epoxy-7-megastigmene-9-one（5），Dehydrovomifoliol（6），(3R)-(-)-4-[(2R,4S)-4- acetoxy-2-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexylidene]-3-buten-2-one（7），2,3,3′-三溴-4,4′,5,5′-四羟基-1′-乙氧甲基双苯基甲烷（8），2,2′,3,3′-四溴-4,4′,5,5′-四羟基双苯基甲烷（9），3-溴-4,5-二羟基苯甲醛（10），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲基甲醚（11），2,3-二溴-4,5-二羟基苯甲醇（12），N, N-二甲基酪胺（13），4-羟基苯甲酸乙酯（14），4-羟基苯甲基乙醚（15），4-羟基苯乙基乙酯（16），4-羟基苯乙酸甲酯（17），4-羟基苯甲醛（18），豆甾-4-烯-3-酮（19），胆甾-4-烯-3-酮（20），胆甾醇（21），尿嘧啶（22），尿嘧啶核苷（23），腺嘌呤核苷（24），丁二酸（25），5-羟基-4-甲基-5-戊基-2,5-二氢呋喃-2-酮（26）。其中化合物1、2为新化合物，化合物3为新天然产物，所有化合物均为首次从该属海藻中分离得到。通过 MTT 法对部分单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选, 结果表明，化合物8、9、10、12对筛选的所有细胞株均有较强细胞毒活性，化合物11对人肺癌细胞株（A549）、人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）有一定细胞毒活性。通过研究单体化合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌的影响，对其进行抗炎活性筛选，结果表明，化合物8、9、11、13、17、23、24、25对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-分泌表现出明显的抑制作用。 从采自山东荣成镆铘岛的红藻小珊瑚藻（Corallina pilulifera）的乙酸乙酯萃取物中分离得到16个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构14个（另外2个正在鉴定中），分别为2α-乙氧酰基-2β-羟基-A-降胆甾-5-烯-4-酮（27），胆甾-4-烯-3-酮（28），胆甾醇（29），3β-羟基-胆甾-5,24(28)-二烯-7-酮（30），2α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（31），6α-羟基-胆甾-4-烯-3-酮（32），3β-羟基-胆甾-5-烯-7-酮（33），(E)-phytol epoxide（34），Phytenal（35），3,7,11,15- tetramethyl-hexadec-2-en-1-oll（Phytol）（36），Loloilide（37），(3S,5R,6S,7E)-(-)-3-hydroxy-5,6-epoxy-7- megastigmene-9-one（38），Dehydrovomifoliol（39），4-羟基苯甲醛（40）。其中，化合物 31为新天然产物，化合物27为首次从植物中分离得到，所有化合物均为首次从该种海藻中分离得到。通过 MTT 法对分离得到的单体化合物进行了肿瘤细胞毒活性筛选,化合物27和化合物32对筛选的所有肿瘤细胞株均有细胞毒活性，且化合物27对人胃癌细胞株（BGC-823）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）具有中等强度抑制活性。化合物28、化合物31和化合物33对人肝癌细胞株（Bel 7402）、人结肠癌细胞株（HCT-8）和人卵巢癌细胞株（A2780）有一定细胞毒活性。 从采自广西北海涠洲岛的多管藻Polysiphonia sp.的乙酸乙酯萃取物中分离得到6个单体化合物，通过波谱学方法鉴定化合物结构5个（另外1个仍在鉴定），分别为胆甾醇（41），3,7,11,15-tetramethyl-hexadec-2-en-1-ol（Phytol）（42），3-吲哚甲醛（43），4-羟基苯甲醛（44），4-羟基苯甲酸（45）。 对山东青岛沿海的松节藻 (Rhodomela confervoides) 乙醇提取物进行了初步的体内抗糖尿病活性研究，采用链脲佐菌素诱导的2型糖尿病（STZ-DM）大鼠模型对其进行体内降糖实验，结果发现，松节藻乙醇提取物在糖尿病大鼠体内不仅具有显著的降血糖作用，且呈现良好的量–效关系，而且能够纠正糖尿病引发的物质代谢紊乱，增加体重，提高试验动物的成活率，因此具有良好的应用开发前景。

壳寡糖及其新型衍生物的制备和抗肿瘤活性初步研究

壳聚糖具有多种生物活性且无毒、无污染，可生物降解，但分子量大，水溶性差，其应用受到很大限制。壳寡糖具有良好的水溶性，其制备方法和应用近年来成为研究的热点。本论文详细研究了酶法和化学法制备壳寡糖的工艺条件，并对酶降解和化学氧化降解的产物进行了比较，结果表明氧化降解的壳寡糖氨基含量有所下降，而酶法降解的产物氨基含量基本没有变化。研究发现在木瓜蛋白酶中加入Vc可以一定程度上降低降解产物的粘度。对几种酶联合降解效果进行了研究，结果表明三种酶的联合降解可得到分子量为1800左右的壳寡糖产物，同时可获得较高产率。 本论文还制备了三种新型壳寡糖衍生物，并研究了壳寡糖和三种衍生物的抗肿瘤活性。通过在壳寡糖上引入胍基乙酸，首次合成了壳寡糖胍基乙酰衍生物(N-2-胍基乙酰-壳寡糖)；引入烟酰氯、烟酰异硫氰酸酯合成了(N-2-烟酰-壳寡糖、N-2-烟酰异硫氰酸酯-壳寡糖)。 通过对BEL•7402肝癌细胞进行了抑制肿瘤活性研究表明：烟酰壳寡糖衍生物的抗肿瘤活性较其他两种衍生物和壳寡糖的活性要好(1mg/ml浓度下抑制率为21.54%)，在较低浓度下有一定的抑制活性（50ug/ml浓度下抑制率为3.57%）。随着浓度的升高，抑制活性也随之提高。烟酰异硫氰酸酯壳寡糖衍生物和胍基乙酰壳寡糖衍生物在低浓度条件下对肿瘤细胞基本没有抑制活性，在高浓度条件下有一定的抑制活性。

孔石莼主要化学组分的提取分析及多糖生物活性的研究

孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）是一种大型经济海藻，除了可直接食用外在医药方面也有广泛的应用。在古代医书上便记载有多种药用活性，我国民间也流传用孔石莼治疗中暑、水肿和小便不利等病症。本论文比较全面地分析了孔石莼多糖和类脂等主要化学组合，探讨用红外和核磁光谱来解释多糖结构，并首次研究了孔石莼多糖的体外抗肿瘤的体内降血脂活性。为进一步开发孔石莼资源做了部分基础性的工作。通过对提取扎石莼多糖和类脂的方法研究，确定了两种主要组仇的提取方法，得到了多糖样品WPS、APS、DWPS、DAPS和类脂样品。用化学和仪器分析方法对多糖样品进行了水分、灰分、硫酸基含量、总糖含量、特性粘度、元素分析、单糖分析、氨基酸分析、红外和核磁光谱分析等。结果表明：用乙醇脱脂后的脱脂孔石莼水提物（DWPS）得率最高，含硫酸基量和总糖量最高，特性粘度最小；孔石莼水提物（WPS）得率和含硫酸基量次之；孔石莼碱提物（APS）因深解性不好未能按常规方法测定其总糖含量，且未检测出水解硫酸根。孔石莼多糖的单糖要有鼠李糖、葡萄糖、木糖、糖醛酸等，并检测到少量的甘露糖和阿拉伯糖。谷氨酸、天冬西氨酸是多糖样品蛋白质中的主要氨基酸，D－3－OH－半胱氨酸含量亦较高。IR谱图中出现了硫酸基的吸收峰：~H－NMR及~(13)C－NMR谱图中出现了鼠李糖和糖醛酸的特征峰。类脂样品中，非极性类脂与极性类脂的比例约为1：2；GC－MS 分析结果表明，不饱和脂质含量达61.37％，其中多不饱和脂类占44.17％，n-3系列高度不饱和脂类占39.90％。三个多糖样品WPS、DWPS、DAPS进行抗口腔上皮癌（KB）和肝癌（Bel）肿瘤细胞体外实验，结果表明在5μg/ml的剂量时三个样品抑制率均在10％以下，无明显活性表现。以烟酸肌醇为阳性对照药，蒸馏水为空白对照，对孔石莼水提多糖WPS进行了三个剂量的降血脂动物实验。实验结果表明：脂蛋白改善情况有明显的剂量依赖性；中高剂量组可显著降低胆固醇、甘油酸三脂，明显改善脂蛋白胆固醇的含量分布：高剂量样品组（500mg/kg·d~(-1)）的药用活笥最高，与相同剂量的阳性对照药烟酸肌醇结果相比，药效理佳。并对孔石莼多糖血脂的机理进行了讨论。

两种海藻提取物的化学成分和生物活性的研究及其应用

本论文的研究工作由两部分组成，第一部分研究了海带（Laminaria japonica）水提取物中的活性物质，并研究了提取物对蔬菜促生长的影响及其作用机制。第二部分对三列凹顶藻(Laurencia tristicha)乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选和化学成分研究，并对其中分离得到的单体化合物进行了生物活性筛选。 第一部分主要以中国人工养殖的海带为原料，使用与海藻多糖生产相结合的提取技术并浓缩其中的有效成分。对浓缩提取物进行了蔬菜的农田效果实验，并对作物抗旱性能的增加、作物硝酸盐积累的减少、作物品质的改善、以及作物抵抗病毒病的能力等影响进行了作用机制方面的研究。海藻浓缩提取物进行的农田效果实验表明：作物抗旱型相对含水量RWC值在92%~94%之间；病毒病的防治效果最高可达到91%；作物的品质有明显的改善，最重要的是首次发现海藻提取物有降低蔬菜中硝酸盐的含量（硝酸盐的含量是与有机蔬菜区别的重要指标之一）的作用。该部分研究工作的创新性主要体现在：（1）首次在国内外提出和采用与海藻多糖生产相结合的提取技术。该技术的应用不但减少了提取成本，使工业化生产成为可能,更重要的是使我国的海藻工业生产可能实现高值化和开辟综合利用的新途径。（2）首次发现海藻中的小分子海藻多糖具有和细胞激动素、甜菜碱、植物生长素等活性物质同样的生物活性。 第二部分的研究是在查阅了大量的近20年来国内外有关红藻凹顶藻中化学成分研究的相关文献的基础上，对凹顶藻中的次生代谢产物进行了综述。该论文主要是通过对红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行化学成分分析和生物活性筛选以期能够发现具有药用前景的活性先导化合物。 为了寻找具有生物活性的化合物，我们对采自我国南海硇洲岛海域的红藻三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相进行了活性筛选。采用MTT法对其在KB细胞株、Bel-7402细胞株、PC-3M细胞株、MCF-7细胞株、Ketr-3细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用酶模型对其进行了Na+,K+-ATPase的抑制活性测试；采用MTT法对其在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，三列凹顶藻的95%乙醇提取物的乙酸乙酯相对Na+,K+-ATPase和犬血管平滑肌细胞增殖具有一定的抑制活性。 利用正相和反相色谱、Sephadex LH-20色谱以及反相HPLC等手段进行分离纯化，从我国南海海域的红藻三列凹顶藻中分离得到33种化学成分，通过波谱学方法（IR、MS、NMR）以及X-ray单晶衍射试验对其化学结构进行了确证，其中化合物L1~L8为新结构化合物，化合物L5为具有新骨架的全新结构化合物，化合物L9~L13为新天然产物，化合物L18和L22系首次从海洋生物中获得，所有化合物均为首次从该属海藻中得到。新化合物L1~L8均为倍半萜类化合物，命名分别为：(1R,3R)-(-)-3-(3-hydroxy-4-methylphenyl)- 1,3-dimethyl–2-methylidene cyclopentanol (L1), (1R,3R)-(-)-3-(4-methylphenyl)-1,3-dimethyl-2-methylidenecyclopentanol (L2)， (1R, 3R)-(-)-3-(2-hydroxy-4-methylphenyl)-1,3-dimethyl–2–methylidenecyclopentanol (L3)，(+)-(1S,2R)–2-(3–hydroxy–4–methylphenyl)-1,2-[3.1.0]bicy-clohexane (L4)，()-(1S,2R) -5-hydroxy–6–methyl-spiro-dihydrobenzofuran-2(3H),2-{1-methyl-[3.1.0]bicyclohexane} (L5), (+)-6-methyl-2-(p-tolyl)hept-4-en-2,6-diol (L6)，(3R,3aS,8bS)-(-)-2,3,3a,8b–tetrahydro–7-bromo – 3 a– hydroxymethyl - 3, 6, 8b - trimethyl-1H- cyclopenta[b] benzofuran (L7 )，(3R, 3aS, 8bS) - (-) - 2,3,3a,8b–tetrahydro–3 a–hydroxymethyl-3,6,8b -trimethyl -1H – cyclopenta [b] benzofuran (L8)。25个已知结构化合物确定为：(+)-(1R,2R)-4-bromo-1,5, 9–trimethyl–12– methylidene–8–oxa-tricyclo[7.2.1.02]dodeca-2,4,6-triene (L9)，(3S,3aR,8bS)-(-)-2,3,3a, 8b– tetra -hydro–7-bromo–3–hydroxy-3,3a,6,8b-tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofu- ran (L10 )，(3R, 3aR, 8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro – 7 - bromo – 3 – hydroxy - 3,3a,6,8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta [b] benzofuran (L11 )，(3S,3aR,8bS) - (-) - 2, 3, 3a, 8b – tetrahydro –3–hydroxy -3, 3a, 6, 8b - tetramethyl-1H-cyclopenta[b]benzofuran (L12 )， ( 3aR, 8bS) - (-) - 3a,8b –dihydro–7 - bromo – 3, 3a, 6, 8b - tetramethyl - 1H - cyclopenta[b]benzofuran (L13 )，aplysinol (L14 ) ，aplysin (L15)，laurebiphenyl (L16)，johnstonol (L17)，gossonorol (L18)，7,10-epoxy-ar- bisabol-11-ol (L19)，10-epi-7,10-epoxyarbisabol-11-ol (L20) 3β-hydroxy- 5α, 6α-epoxy- β- ionone (L21 )，3β-hydroxy-5β,6β-epoxy-β-ionone (L22 )，胆甾醇 (L23 )，胆甾-5-烯-3β,7α二醇胆甾-5-烯-3β,7α二醇 (L24)，β-谷甾醇 (L25)，叶绿醇 (L26 )，玉米黄素 (L27 )，对羟基苯甲醛 (L28 )，3-吲哚甲醛 (L29 )，1-O-十六烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇(L30 )，1-O-十八烷酰基-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-丙三醇 (L31 )，丙三醇-1-软脂酸单酯 (L32 )，正十六碳酸 (L33 )。 采用MTT法对其中23个单体化合物在Bel-7402细胞株、BGC-823细胞株、A549细胞株、A2780细胞株、HCT-8细胞株和HELL细胞株模型上进行了细胞毒活性测试；采用MTT法对其中13个单体化合物在犬主动脉血管模型上进行了血管平滑肌细胞增殖抑制活性测试；结果表明，部分单体化合物显示出一定的生物活性。

文蛤体液抗肿瘤蛋白的分离纯化与作用方式研究

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，目前的抗肿瘤药物虽然具有一定疗效，但存在选择性差、毒副作用大等缺点，药物治疗期待着新的突破。因此，寻找高效低毒的抗肿瘤药物已经成为当前肿瘤研究的重要内容。传统抗肿瘤天然药物的来源局限在陆地，近年来在海洋来源的具有抗肿瘤活性物质的开发上取得了很多成果，获得了多种高活性、毒副作用小、作用机制新颖的活性化合物，为新型抗肿瘤药物的研发提供了新思路。 本研究采用硫酸铵分级沉淀、弱阳离子交换层析、疏水层析、强阴离子交换层析等分离技术，结合MTT活性追踪方法，从海洋软体动物文蛤体液中纯化得到单一蛋白组份MML，SDS-PAGE检测其分子量约为40kD。该蛋白在体外具有显著的抗人肝癌细胞BEL-7402的活性，其IC50达到52µg/mL。相差显微镜下观察发现，MML起效较快，细胞处理半小时后，形态开始发生改变，细胞膜逐渐与胞内物质分离，最终形成明显的空泡状结构。 为进一步研究MML的作用方式，分别从细胞膜毒性、细胞周期阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡的角度开展了相关研究。在细胞膜毒性方面，采用扫描电镜观察、Hoechst33342/ PI双染色和乳酸脱氢酶漏出率检测的方法，初步证明了MML对BEL-7402具有细胞膜毒性。结合流式细胞仪、微管蛋白免疫荧光检测技术，研究了MML作用后的细胞周期及微管蛋白的变化情况，结果发现MML的抗肿瘤作用方式可能是通过改变肿瘤细胞膜通透性，进而破坏微管蛋白聚合、阻滞细胞周期，产生抑制肿瘤细胞增殖的活性。DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳分析发现，MML作用后的细胞出现一定程度的凋亡，这种凋亡现象的产生是由于MML的直接诱导，还是间接作用产生，尚有待于深入研究。

鲨鱼软骨抗血管生成多肽的分离纯化及其生物活性

以血管生成为靶点的抗肿瘤策略是抗肿瘤领域的研究热点，目前已经发现许多天然和化学合成的抗血管生成药物。鲨鱼软骨作为抗新生血管生成因子的重要来源的研究已有20多年的历史，很多研究显示鲨鱼软骨提取物有抗血管生成活性。但鲨鱼软骨活性多肽的完整分子结构一直未见报道；鲨鱼软骨活性多肽干扰血管生成通路的信号途径尚不明确。 本文应用盐酸胍抽提、丙酮分级沉淀、超滤、凝胶层析等分离技术，从青鲨（Prionace glauca）软骨中分离纯化并鉴定了一种新的具有抗新生血管生成活性的多肽。经SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析显示，该多肽分子量为15500 Da，采用蛋白数据库分析表明该多肽是一种新发现的鲨鱼软骨多肽（Polypeptide from Prionace glauca，PG155）。 体外实验显示，PG155抑制内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell ，HUVEC）迁移和管腔形成，并呈剂量依赖关系。200 μg/ml PG155对牛主动脉内皮细胞（Bovine Aortic Endothelial Cells，BAECs）和HUVECs及以下癌细胞，包括人肝癌细胞（human hepatoma Bel-7402 cells，Bel-7402）、 口腔上皮癌细胞（human oral epidermoid carcinoma KB cells ，KB）、人结肠癌细胞（human colon cancer HCT-18 cells，HCT-18）和人乳腺癌细胞（human breast MCF7 cancer cells ，MCF7）的增殖均无抑制作用，说明PG155无细胞毒作用。20 μg/ml PG155显著抑制HUVEC的迁移和管腔形成；40-80 μg/ml PG155 对VEGF 介导的HUVEC的迁移和管腔形成几乎完全抑制。 体内实验显示，PG155显著抑制斑马鱼胚胎模型新生血管生成，并呈剂量依赖关系。形态学观察表明PG155显著抑制斑马鱼胚胎肠下静脉（subintestinal vessels， SIVs）的生长，随着浓度的升高SIVs的生长可受到完全抑制。碱性磷酸酶染色分析显示，在一定浓度范围内，PG155随着浓度的升高对斑马鱼胚胎整体血管生成抑制作用依次增强。160 μg/ml PG155会引起斑马鱼胚胎心脏功能障碍。 由海洋生物中发现新的肿瘤新生血管生成抑制剂国内外的报道较少，我们的工作表明鲨鱼软骨可作为血管生成抑制剂的重要来源，鲨鱼软骨活性多肽PG155由于具有极低的细胞毒作用，并能抑制VEGF介导的血管生成过程，有希望成为一类新型抗肿瘤药物。

Sesquiterpenes from the red alga Laurencia tristicha

Seven new sesquiterpenes (1-7), together with seven known sesquiterpenes, aplysin (8), aplysinol (9), gossonorol (10), 7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol (11), 10-epi-7,10-epoxy-ar-bisabol-11-ol (12), johnstonol (13), and laurebiphenyl (14), have been isolated from the red alga Laurencia tristicha. The structures of new compounds were established as laur-11-en-2,10-diol (1), laur-11-en-10-ol (2), laur-11-en-1,10-diol (3), 4-bromo-1,10-epoxylaur-11-ene (4), cyclolauren-2-ol (5), laurentristich-4-ol (6), and ar-bisabol-9-en-7,11-diol (7) by means of spectroscopic methods including IR, HRMS, and ID and 21) NMR techniques. Compound 6 possessed a novel rearranged skeleton. All compounds were tested against several human cancer cell lines including lung adenocarcinoma (A549), stomach cancer (BGC-823), hepatoma (Bel 7402), colon cancer (HCT-8), and HELA cell lines. Laurebiphenyl (14) showed moderate cytotoxicity against all tested cell lines, with IC50 values of 1.68, 1.22, 1.91, 1.77, and 1.61 mu g/mL, respectively. Other compounds were inactive (IC50 > 10 mu g/mL).

Crystallographic and NMR studies on sterols from green alga Chaetomorpha basiretorsa Setchell

Chemical investigation of the ethanol extract of the marine green alga Chaetomorpha basiretorsa Setchell led to the isolation of a new sterol stigmast-4,28-dien-3 alpha 6 beta-diol 1 in addition to the five known sterols of beta-lawsaritol 2, saringosterol 3, 24-hydroperoxy-24-vinyl - cholesterol 4, beta-stigmasterol 5, 29-hydroxystigmasta-5, 24(28) -dien-3 beta-ol 6. Compounds were isolated by normal phase silica gel and Sephadex LH - 20 gel colum chromatography, reverse phase HPLC and recrystalization. Their structures were elucidated by spectroscopic methods including MS, IR 1D/2D NMR and X-ray analysis. Cytotoxicity of compounds was screened by using the standard WIT method. All these compounds were isolated from the green alga Chaetomorpha basiretorsa Setchell for the first time and they were inactive (50% inhibitory concentration was greater than 10 mu g /cm(3)) against KB, Bel -7402, PC - 3M, Ketr 3 and MCF - 7 cell lines.

Steroids from green alga Chaetomorpha basiretorsa Setchell

Six steroids have been isolated from ethanolic extract of green alga Chaetomorpha basiretorsa Setchell by a combination of repeated normal phase silica gel and Sephadex LH-20 gel column chromatography as well as recrystallization. Using spectroscopic methods including MS and NMR, their structures were determined as beta-lawsaritol (1), saringosterol (2), 24-hydroperoxy-24-vinyl-cholesterol (3), beta-stigmasterol (4), stigmast-4-en-3 alpha, 6 beta-diol (5), 29-hydroxystigmasta-5, 24 (28)-dien-3 beta-ol (6). All these compounds were obtained from this genus for the first time and they were inactive (IC50 > 10 mu g /ml) against KB, Bel-7402, PC-3M, Ketr 3 and MCF-7 cell lines.