调节性T细胞在SIVmac239感染中国恒河猴中的变化及其机制的初步研究

CD4+CD25+调节性T细胞是1995年才发现的一个具有免疫抑制功能的T细胞亚群，主要通过细胞与细胞间直接接触和分泌抑制性细胞因子发挥作用，在维持机体免疫自稳、防止自身免疫以及肿瘤免疫、移植免疫等方面起着重要作用。有关Treg HIV/SIV病毒感染及AIDS的进展关系密切，但却有两种不同的观点。一种认为Treg的数量和功能受到损伤，从而导致宿主免疫系统过度活化。另一种则认为Treg在早期抑制了针对HIV/SIV的特异性的免疫反应，从而导致机体无法清除感染的病毒。本文利用动物模型对CD4+CD25+调节性T细胞在SIV感染后的数量和功能做了动态的检测，并对其中的机制做了初步的探讨。我们首先建立了SIVmac239病毒株对中国起源的恒河猴感染的动物模型，建立了前病毒的检测方法、血浆病毒载量的测定方法、血浆病毒特异性抗体的测定方法，以及病毒的分离方法，并获得了早期感染的相关数据。在研究中我们发现，SIV感染后的1周后即可在恒河猴外周单个核细胞DNA中检测到前病毒。病毒血症也在1周后出现，并很快达到高峰。不同的个体对病毒感染的体液免疫不尽相同，血浆抗体很快出现，但是99003猴抗体下降很快，而99083猴则保持了一定数量的抗体。同时，伴随SIV的感染进程的还有T淋巴细胞的数量变化，CD4+T细胞数量持续下降，而CD8+T细胞数量则在增加，出现CD4/CD8倒置的现象。以上说明恒河猴被SIV所成功感染。在该动物模型的基础上，我们利用体内传代的SIVmac239病毒株，对4只健康恒河猴进行了感染，并对CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）亚群在数量上的变化进行了检测，并对其中的机制做了初步探讨。我们在研究中发现，外周血中的Treg在SIV感染后无论是绝对数量还是在占CD4+T细胞中的相对数量均有增加，而且Treg仍然保持了对靶细胞的抑制功能。对腹部淋巴结的分析显示，SIV感染后的一段时期内，该部位FoxP3 mRNA的表达水平也在上升，TGF-β、IL-10的转录也显著增加。前者可以通过抑制树突状细胞间接抑制效应细胞，而后者则是一个抑制性的细胞因子，可以直接作用于靶细胞。因此，我们推测SIV引起免疫系统的过度活化可能不是由于Treg功能的受损，其中的机制需要深入研究。 Treg表达CCR5表面分子（HIV辅助受体之一），同时也有CD4分子的表达，因此推测HIV/SIV可以感染Treg。但是国内外这方面的文献很少。我们对Treg中前病毒的检测发现，SIV可以感染Treg，而且对Treg的感染比例高于CD4+CD25－T细胞。这个结果与Treg绝对数量的上升的结果说明，SIV感染Treg但可能却没有杀伤Treg，因此Treg在数量上有所增加。不过，其中的机制仍有待于进一步的研究。在对SIV引起的体液免疫的研究中还发现，机体针对SIV不同抗原的抗体有不同的模式。部分抗原很快就产生了比较强的反应，但是却不能维持高水平的表达。而针对p27蛋白的抗体产生比较晚，但却长时间维持在比较高的水平。是否这样高水平的抗体有助于控制病毒复制是个值得探讨的问题。

树突状细胞亚群在SIVmac239感染中国恒河猴中数量、表型和功能变化及其机制的研究

本论文主要由3 个相对独立的部分组成：中国恒河猴单核细胞来源的树突 状细胞的表型及功能研究；外周血DC 亚群在SIVmac239 感染的中国恒河猴中 数量及细胞因子的变化以及急性感染期SIVmac239 对中国恒河猴外周血DC 亚 群的凋亡和免疫表型的影响。 非人灵长类动物是人类的近亲，由于在组织结构、免疫、生理和代谢等诸 多方面与人类高度近似，科学界较普遍地利用非人灵长类作为动物模型来进行 艾滋病（AIDS）的发病机制和疫苗研究。中国恒河猴发病缓慢，更适合于HIV 感染的相关研究。在本研究中，我们在体外成功培养了中国恒河猴单核细胞来 源的树突状细胞（monocyte derived dendritic cells，MDDC），并测定其表型和免 疫刺激功能。通过GM-CSF 和IL-4 共同刺激培养单核细胞6 天以后便获得了未 成熟MDDC，随后加入IL-1β、PGE2、LPS 和TNF-α 联合刺激MDDC 成熟。 成熟的MDDC 上调了共刺激分子和CD83 的表达，具有很强的刺激T 淋巴细胞 增殖的能力并分泌大量的IL-12。本研究为后续的DC 疫苗研究奠定了基础。 我们实验室建立了SIVmac239 感染的中国恒河猴动物模型。以该模型为依 托，我们研究了外周血中DC 亚群在急性感染期以及慢性感染期的数量、表型 及功能变化。DC 作为最重要的连接先天免疫与获得性免疫的抗原递呈细胞， 在AIDS 发病进程中扮演着重要的角色。研究发现AIDS 患者血液和淋巴结中 髓样DC（myeloid DC，mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）会随 着感染的进程而减少，并且伴随着功能损伤。本论文通过研究发现，中国恒河 猴的DC 亚群数量在感染后尽管波动十分剧烈，但并没有显著性地增加或减少， 中文摘要 2 在后期DC 数量能够回升到正常的范围之类，这种回升不同于印度恒河猴，很 可能是中国恒河猴缓慢发病的原因之一。进一步通过研究体外刺激DC 亚群分 泌的细胞因子，我们发现在急性感染期，pDC 分泌的IFN-α 显著提高，并很可 能刺激mDC 成熟并促进了IL-12 的分泌。早期大量细胞因子的分泌有助于控制 病毒复制，但同时也激起了整个免疫系统的活化，促进了疾病进程。而在整个 感染阶段，IFN-α 与CD4+ T 细胞呈正相关，而与病毒载量呈负相关，表明了 IFN-α 对于延缓疾病进程具有重要的意义。 我们测定了急性感染期DC 亚群受病毒影响而发生的表型变化，发现pDC 更容易受到病毒影响而发生凋亡，这可能与pDC 高表达SIV 受体CD4 和CCR5 有关。在感染过程中，尽管mDC 和pDC 都显著地下调了CD4 表达，而上调了 CCR5 的表达，不过仅发现pDC CD4 的表达与病毒载量呈负相关，而CCR5 的 表达与病毒载量呈正相关。在此过程中DC 亚群都会因为病毒的影响而活化， 继而提高CCR7 的表达。同时无论mDC 还是pDC，其表达的CD80 和CD86 都与病毒载量呈正相关。在早期感染中，DC 的活化促使整个免疫系统针对病 毒发挥免疫反应，对于控制疾病发展具有重要意义。

猕猴多潜能成体肝前体细胞及猕猴ES 定向分化为胆管上皮细胞的研究

为解决供体器官的不足，以细胞移植为基础的替代疗法已成为治疗不可逆肝 脏疾病新的希望。 肝前体（干）细胞（Hepatic progenitor cellS，HPCs）和 胚胎干细胞（embryoic stem cells, ES）由于其特殊的细胞特性已成为细胞替 代治疗理想的种源细胞。 然而一方面包括人在内的灵长类动物的正常成体肝来 源的HPCs 的分离依然是很困难的；另一方面，ES 细胞来源的肝细胞和胆管细胞 的生成效率依旧很低。因此有必要建立稳定的高效的灵长类动物HPCs 细胞分离 培养体系及ES 细胞的肝细胞或胆管细胞分化体系以满足供体细胞的不足；这种 体系的建立还有利于研究肝细胞生物学如分化机制、自我更新机制等方面的重要 基础问题。 本研究以猕猴为实验模型，研究了正常成体肝来源的猕猴HPCs 分离、纯化 的条件，系统地鉴定了猕猴HPCs 的细胞特性和体内、外分化潜能，并评价了体 内移植效果。 同时以rES 为材料，建立了rES 高效分化为限定性内胚层 （definitive endoderm cells, DE）和胆管上皮细胞的分化体系。主要实验结 果包括：1）： FBS、EGF、HGF 及rat tail collagen (鼠尾胶原)是分离培养正 常成体猕猴来源的肝上皮前体细胞(rhesus monkey liver epithelial progenitor cells, mLEPCs)所必需的，mLEPCs 在此培养体系中至少可以扩增20 代或5 个月以上，并仍然保持原有的细胞特性；mLEPCs 呈现典型的上皮细胞形 态，并表达HPCs 细胞特有的表达模式即同时表达肝细胞和胆管细胞相关基因 （ALB，APOH，CX43，IB4）或蛋白（CK7，CK8，CK18）；在适宜的分化体系下， mLEPCs 可分化为功能性的肝细胞，形成具有胆管上皮细胞的胆管样结构，并能 转分化形成肌肉样细胞、肌样成纤维细胞及少突样细胞；移植入肝损伤的免疫抑 制的小鼠体内后，mLEPCs 能参与受体肝组织的再生，并能分化成ALB 阳性的肝 细胞；体内定位发现mLEPCs 与胆管区的细胞有相似的免疫原性，提示mLEPCs 可能来源于胆管区。2）：rES 在高浓度的acitvin A（100ng/ml）和低浓度的血 清(1%)单层诱导体系下可定向分化得到高比率的限定性内胚层细胞（definitive endoderm cells，DE 细胞）(约80%)； 高比率的DE 细胞的得到还与rES 细胞的接种密度相关；BMP4 和FGF1 可诱导DE 细胞高效向胆管上皮细胞分化（约90%）， 但并不能得到肝细胞；而Notch 信号通路可维持DE 细胞的存活，并决定着DE 细胞向胆管细胞分化，在Notch 信号通路失活的情形下，即使存在BMP4 和FGF1 都不能促使DE 细胞向胆管细胞分化。 本实验首次成功建立了正常猕猴成体肝HPCs 分离培养体系，证实了分离得 到的猕猴肝上皮前体细胞不但具有正常HPCs 的增殖活力和参与受体肝组织的再 生能力，而且还具有三个胚层的分化潜能，这一结果将为以HPCs 为基础的细胞 替代治疗人类肝脏疾病的实现提供了可能，并首次证明了HPCs 也可以像某些少 数成体干细胞一样具有三个胚层得分化潜能。 此外，本研究建立了rES 高效定 向分化为DE 细胞和胆管细胞的分化体系，这一方法的建立将促进灵长类动物的 DE 细胞的发育机制研究，同时也可为高比率的内胚层功能细胞（如胰岛细胞、 肝细胞、肺细胞）的获得提供丰富的种源细胞和平台。

猕猴胚胎干细胞无饲养层、无血清培养及诱导分化成O2A 胶质前体细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（ES 细胞）不仅能为研究生殖发育生物学基础理论提供良好的 模型，而且可为细胞替代治疗提供大量的供体细胞，因此具有重要的研究价值。当前 灵长类ES 细胞研究还有很多问题需要解决，如分离建立更多的胚胎干细胞系，优化培 养体系，提高ES 细胞定向分化为特定细胞的比例，研究ES 细胞自我更新和分化的机 制等。本文一方面概括了灵长类ES 细胞的研究进展，另一方面并对制备抗体，免疫外 科手术法分离灵长类胚胎内细胞团，建立猕猴ES 细胞的无饲养层、无血清培养体系和 诱导猕猴ES 细胞分化成高纯度的O2A 神经胶质前体细胞进行了研究。主要结论如下： 1）分别以猕猴脾脏淋巴细胞和人外周血单个核细胞作为免疫原，免疫日本大耳白兔， 得到免疫血清。在补体介导的细胞毒作用下，兔抗人和兔抗猕猴免疫血清可以裂解人 和猕猴囊胚滋养层细胞，从而分离出内细胞团，用于分离培养人和猕猴胚胎干细胞。2） 猕猴ES 细胞在以层粘连蛋白（laminin）为胞外基质，含转化生长因子beta1（TGFβ1） 的无血清培养基（SFM）中可以稳定的增殖至少22 代，保持不分化，并具有分化成三 个胚层细胞的能力。进一步的研究发现去除TGFβ1 后，猕猴ES 细胞出现分化，整合 素表达降低，推测TGFβ1 可能通过促进猕猴ES 细胞整合素的表达，加强其与胞外基 质的相互作用，从而维持ES 细胞的自我更新。然而猕猴ES 细胞不能在纤粘连蛋白 （fibronectin）和明胶上生长。3）无饲养层、无血清培养体系中长期培养的猕猴ES 细 胞，分化出拟胚体，14 天的拟胚体在血清中分化培养一周后，在含碱性成纤维生长因 子bFGF、表皮生长因子EGF 和胰岛素＋转铁蛋白＋亚硒酸钠ITS 的培养基中培养， 获得97％的O2A 胶质前体细胞，得到的O2A 细胞能够稳定增殖，并且可以自发分化 为II 型星型胶质细胞和少突胶质细胞。本实验的结果有助于猕猴ES 细胞分离建系和培 养系统的优化、推动猕猴ES 细胞自我更新和诱导为神经胶质细胞机制的研究，便于建 立ES 细胞替代治疗的猕猴模型，从而为人类ES 细胞的临床疾病治疗提供参考。

猕猴胚胎干细胞培养以及定向分化成神经细胞的研究

灵长类胚胎干细胞（Es）的研究不仅对理解生殖发育生物学的基础理论、而且对实现细胞替代治疗具有重要意义。当前灵长类ES细胞还有很多问题需要解决，如ES细胞培养体系的改进、ES细胞定向分化成高纯度特定组织细胞的可能性、有效性以及分化机制等问题。本文一方面概述了灵长类ES细胞相关领域的研究进展；另一方面，以称猴胚胎干细胞（rEs）为材料，在改善rES细胞的培养体系、提高其定向分化成神经前体细胞（NPs）和少突细胞的比率进行了研究。实验采用同源称猴细胞系作为饲养层培养rES细胞，并在此基础上利用肝生长因子（HGF）和GS诱导rES细胞定向分化成高纯度的NPs和少突细胞，并评价了NPs是否具有移植功能。主要结论如下：1）四种称猴细胞系（MOF、MESF、MFG和CMESF）可作为饲养层支持rES细胞的生长，保持ES自我更新的能力和分化的多能性。而且这几种称猴饲养层支持ES细胞生长的能力存在明显的差异，进一步的研究表明这些差异主要是由于基因表达种类以及表达量上的差异而导致的。2）采用HGF和GS作为诱导因子添加到NDCM液中，诱导rES细胞分化成可移植的NPs。实验结果如下：单独的HGF或GS仅能诱导ES细胞分化成65±8.3％和69±14％NPs，而HGF和GS的联合使用NPs的比率达到88.3±8.1％，进一步纯化后获得98±1.2％的NPs。获得的NPs能在体内、外分化成三个谱系神经细胞，并能整合到大鼠脑部，发生迁移和分化。25％的NPs细胞8周后仍保持存活状态，其中65-80％的细胞发生了不同程度的迁移，而且细胞在脑部的分化种类以及数目与细胞在体内所处的微环境具有重要的关系。亚克隆实验也进一步证明采用HGF＋GS获得的部分单个NPs具有神经干细胞的特性，也能在体内、外分化成三个谱系的神经细胞，而另外的却只能分化成其中的一、两种谱系的细胞。3）利用五步法，ES细胞能分化成75±6.8％的少突祖细胞和81土8．6％的成熟少突细胞。HGF通过抑制NPs的凋亡和缩短NPs的复制周期，共同促进NPs的增殖。HGF也能诱导HGF+G5获得的NPs分化成少突祖细胞和成熟少突细胞，并且促进少突细胞成熟。而且HGF促进NPs分化成少突细胞的能力受到GS的调控，单独HGF作用将导致ES细胞分化成神经元。本实验的结果为促进rES细胞相关领域的研究，以及ES细胞在神经系统疾病临床应用上提供信息，也为研究NPs和少突细胞的发育提供典型的细胞模型。

猕猴精子冷冻保存方法的改进及活率检测

精液的冷冻保存对家畜繁殖、人类辅助生殖以及濒危物种保护有着重要意义。然而目前精子冷冻的研究很大程度上是经验性的，并且要使用含卵黄、脱脂乳等复杂成分的稀释液。这些复杂成分不仅是潜在的污染源，也使精子冷冻中的质量控制及分析特定物质的功能变得困难。即便如此也仅有约50％的精子能够存活下来，而且存活精子的受精能力也有所下降。称猴是生物医学研究中使用广泛的灵长类动物，开展赫猴精子的冷冻保存有利于该物种的繁殖并促进基础胚胎学的研究，成功的称猴精子冷冻方法还可以为其它珍稀濒危灵长类动物所借鉴。但是目前成功的称猴精子冷冻的报道仍然很少，且精子质量检测方法并不完善。因此本文致力于建立简单有效的称猴精子冷冻方法和活率检测方法。主要结果如下：1）建立了一种用单一紫外激光同时激发Hoechst33342和碘化丙锭结合流式细胞术检测称猴精子活率的有效方法，并将此方法用于称猴精子冷冻研究。2）发现甘油的一步加入或去除与分步加入或去除对称猴精子冷冻效果没有明显影响，在此基础上发现各种糖类稀释液之间的作用差异很小，但不含糖的化学成分确定的TT稀释液对精子冷冻保护作用显著高于糖类稀释液。这可能是因为TT的渗透压（138mOsm/kg）较好地适合于猫猴精子的冻存，高渗毒害作用可能是导致称猴精子用TEST冷冻存活率低的重要原因。3）以TT为基础稀释液，探讨了精子冷冻中一些关键因素，以期进一步改进冷冻方法。结果表明精液一步稀释于含5％甘油的一倍浓度TT，平衡0.5h可得到最佳效果，总体上复苏精子的运动度可达到55％以上，质膜完整性能达到6D％左右。这种方法与传统的以含有卵黄的TTE为稀释液的称猴精子冷冻方法效果相当，复苏精子还能够成功地进行体外受精。另外，用液化精液1：2直接稀释于防冻液还能进一步提高冷冻效果。本研究建立的用化学成分确定稀释液冷冻称猴精子的简单方法，有利于提高称猴精子的冻存效率，并有助于分析特定成分在精子冷冻中的作用。而Hoechst33342和碘化丙锭双染方法，是一种简单有效的精子活率检测方法，并在多参数精子功能的流式检测中有很高应用价值。

猕猴精子的冷冻保存以及影响冷冻复苏精子功能的因素

自从1949年Polge等研究者发现甘油的冷冻保护作用，开创了低温生物学的里程碑以来，精子冷冻保存已经逐渐成为治疗人类不育、家畜繁殖和生物多样性保护的重要手段。然而目前人类对多数物种的基本生殖生物学及其种质冷冻保存的低温生物学知识仍很缺乏。哺乳动物精子冷冻的研究很大程度上是经验性的，即使运用最现代的低温冷冻程序和仪器设备，也仅有约50％的精子能够存活下来。灵长类动物的精子对冷冻非常敏感，迄今为止应用称猴冷冻精子人工受精仅产生过一个后代。为了提高冷冻保存精子的功能和受精能力，本论文以称猴为动物模型，以冷冻复苏精一的运动度、精子质膜和顶体的完整率以及体外受精作为精子功能的检钡l指标，探讨影响动物精子冷冻保存的因素。通过研究1）建立了适合称猴精子冷冻保存的适宜方法以及冷冻复苏精子功能的检测方法，并首次成功地运用冷冻称猴精子体外受精；2）检测了不同甘油浓度和二甲亚飒浓度对冷冻复苏精子运动能力、精子质膜、精子顶体结构和受精能力的影响，确定了称猴精子冷冻保存的适宜甘油浓度；3）对比研究了不同类型渗透性防冻剂在精子冷冻保存中的作用以及对冷冻复苏精子功能的影响，发现对于称猴精子，除了甘油外，乙二醇也是一种优秀的渗透性防冻剂，而丙二醇和二甲亚矾对精子产生了较大的毒害作用，并不适合称猴精子的冷冻保存；4）研究了单糖、二糖和二糖在精子冷冻复苏过程中的保护作用，发现不同类型糖类的冷冻保护作用存在显著差异，单糖和二糖对精子的冷冻保护作用优于二糖，二糖在冷冻复苏过程中对于精子的顶体产生了破坏作用，不同类型的糖类配合使用可以提高对精子的冷冻保护效率。本研究的结果有利于优化灵长类动物精子冷冻保存的方法，包括调整防冻液的成分和冷冻降温程序，从而有助于提高精子冷冻保存的存活率。此外，还有利于深入研究哺乳动物精子冷冻损伤的机制和探讨防冻剂的冷冻保护机理.

猕猴胚胎干细胞自我更新机理及WNT 信号通路在猕猴胚胎早期发育中作用的研究

尽管大部分动物实验是在啮齿类动物上开展的，我们仍然相信涉及人类的许多问题，如胚胎干细胞的体内功能、调亡和肿瘤形成等只有在非人灵长类模型上才能得到最好的回答。猕猴(标准的非人灵长类动物模型)在解剖、生理和代谢方面都和人类非常相似。人类很多神经疾病，如阿尔茨海默氏病、帕金森病，只能在非人灵长类模型上才能精确建模。所以研究猕猴胚胎干细胞自我更新的原理及猕猴胚胎早期发育，对研究免疫排斥，检测基于胚胎干细胞的治疗的可行性，安全性和有效性具有重要意义。本文一方面对胚胎干细胞维持自我更新和多潜能性的机理研究进行了综述，另一方面对以下两个方面的内容进行了研究： 1）运用寡核苷酸芯片和定量PCR 验证的方法来分析五株猕猴饲养层细胞的表达模式，期望发现在支持性和非支持性的饲养层细胞中差异性表达的基因。我们着重定位于饲养层胞外空间和细胞膜上的细胞因子，因为这些因子可以通过直接接触或通过膜结合受体激活下游信号通路，并最终促进猕猴胚胎干细胞的自我更新。我们发现在支持性的饲养层中有八个基因是高表达的，他们是GREM2， bFGF，KITLG，DKK3，GREM1，AREG，SERPINF1 和LTBP1； 经定量PCR 验证的SCF，bFGF 和GREM2 的表达情况都和芯片数据吻合。 2）为了描述在IVF (in vitro fertilized, 体外受精)，ICSI (intracytoplasmic sperm injection, 单精注射)，SCNT (somatic cell nuclear transfer, 体细胞核移植)和孤雌生殖猕猴囊胚中WNT 信号通路的表达情况，我们运用了信号通路特异性PCR Array 系统及免疫细胞化学来检测mRNA 和蛋白表达水平。其中，ICSI 作为IVF 胚胎的参照组，以排除显微操作对胚胎质量的影响。结果，我们发现非经典WNT/JNK 信号，而不是经典WNT 信号通路，在IVF 正常胚胎发育中起作用。而体细胞核移植和孤雌生殖的胚胎的WNT 信号通路基因表达明显高于正常胚胎。WNT 信号通路基因的表达模式可以作为胚胎质量的一个指示标准，有助于回答为什么猕猴 SCNT 和孤雌生殖胚胎发育异常。

猕猴胚胎干细胞的神经谱系分化及胶质祖细胞迁移机理研究

由于伦理和材料来源的限制，目前对灵长类早期神经发育缺乏深入地了解。与啮齿类动物相比，猕猴在遗传和生理上与人类更接近，因此猕猴胚胎干细胞(rESCs)研究具有重要的研究价值，不仅能为研究发育生物学基础理论提供良好的模型，而且可为细胞替代性治疗提供大量的供体细胞。本文以rESCs为主要研究对象，在rESCs定向分化为神经细胞的基础上着重研究神经谱系分化及调控胶质祖细胞迁移的机理。主要结论如下：1) rESCs来源的神经上皮干/前体细胞(NEPs)主要变为辐射状胶质细胞(RG)后再通过中间类型的祖细胞——神经元祖细胞(NPs)和胶质祖细胞(GPs)——分别分化为神经元和胶质细胞。同时，NEPs/RG细胞群具有早期神经管背-腹和前-后轴空间特性。NEPs/RG的维持受Notch和FGFR信号作用。此外，实验中还纯化和鉴定了猕猴胶质限定性前体细胞(GRPs)。结果表明，rESCs的神经谱系分化能够模拟体内发育过程，并与啮齿类动物早期神经谱系变化过程相似。2) 气体信号分子NO(由10μM—250μM SNP供体释放)促进rESCs来源的A2B5+/Nestin/PSA-NCAM胶质祖细胞迁移。进一步研究发现Netrin-DCC信号通路介导了NO启动的细胞迁移过程。同时，Ca2也参与调控胶质祖细胞的迁移。此外，细胞外基质和整合素α6亦可能与Netrin-DCC相互作用调控细胞迁移。结果显示，NO通过激活一个复杂的信号网络系统调控胶质祖细胞迁移。本实验的研究结果有助于揭示灵长类中枢神经系统发育的机理，同时也能为治疗神经系统退行性疾病提供阶段特异性的供体细胞。

猕猴胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立

与啮齿类动物相比，猕猴（Macaca mulatta）在遗传和生理上与人类更接近， 因此猕猴胚胎干细胞具有重要的研究价值，不仅是研究发育生物学基础理论的良 好材料，而且可为细胞替代性治疗提供很好的同种异体移植模型。猕猴胚胎干细 胞常规培养于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）上，这极 大地限制了对猕猴胚胎干细胞的研究和应用，因此，需要建立猕猴胚胎干细胞的 无饲养层培养体系。 本文以猕猴胚胎干细胞系IVF3.2（本实验室自主分离建系，来源于猕猴体 外受精胚胎）为研究对象，研究了在以Matrigel (growth factor reduced, BD)作为 胞外基质，以MEF 条件培养基为培养基，以trypsin 消化传代的无饲养层培养体 系中，猕猴胚胎干细胞的生长及分化能力，并比较了猕猴胚胎干细胞IVF3.2 在 无饲养层和有饲养层两种不同培养条件下的细胞周期分布及冻存复苏效率。主要 结论如下：1）经过鉴定，在本研究建立的无饲养层培养体系中，猕猴胚胎干细 胞IVF3.2 能够保持胚胎干细胞的两个基本特征，即分化的多能性和自我更新的 无限增殖能力；2）两种培养体系下的IVF3.2 的细胞周期分布没有显著差异，均 具有胚胎干细胞独特的细胞周期结构之一，即大部分细胞处于S 期（>50%的细 胞）；3）无饲养层培养的IVF3.2 冻存后能高效复苏，采用常规慢速冷冻法冻存 无饲养层培养的IVF3.2，复苏后的细胞存活率高达83%，明显高于常规培养的 IVF3.2 的冻存效率。

1. 大鼠海马-前额叶回路在学习记忆中的作用2. 芬克罗酮改善恒河猴空间工作记忆的谷氨酸机制

一、大鼠海马-前额叶回路在学习记忆中的作用 解剖学研究证实大鼠和猴的海马结构（hippocampal formation, HF；本文‘海马 (hippocampus, Hip)’一词即指海马结构）和前额叶 (prefrontal cortex, PFC) 之间存在一条单向、同侧和单突触的神经回路，即海马-前额叶回路（Hip-PFC回路）。Hip和PFC均参与学习记忆等多种认知功能，PFC是工作记忆的关键脑区，而Hip是空间参考记忆的关键脑区。虽然人们已经对PFC和Hip进行了广泛深入的研究，但对Hip-PFC回路参与哪些认知功能还知之甚少。本研究的目的就是通过暂时阻断Hip-PFC回路，探讨其在学习和记忆中的作用。 在大鼠，Hip-PFC回路中的纤维主要从Hip腹部 (ventral hippocampus, VH)发出，投射到PFC的前边缘皮质(prelimbic cortex, PLC)、下边缘皮质 (infralimbic cortex, ILC) 和外侧前额叶 (lateral prefrontal cortex) 等亚区，其中PLC是Hip-PFC主要投射的区域。我们通过给动物安装慢性导管向脑内注射GABAA受体激动剂muscimol (MU) 阻断Hip-PFC回路。注射位点包括 ①双侧PLC，②双侧VH，③一侧VH和对侧PLC (VH-PLC)。我们首先观察了在PLC或VH局部注射MU对自由活动大鼠PLC和VH脑电功率的影响，并以此确定在行为实验中所用蝇蕈醇的剂量。然后采用T-迷宫空间交互延缓作业 (spatial delayed alternation task) 测试Hip-PFC回路被阻断的动物的空间工作记忆功能；采用被动回避作业 (passive avoidance task) 测试其情绪相关记忆的能力（训练前给药；24 h后重测试）；采用Morris水迷宫作业 (Morris water maze task) 测试其空间参考记忆的能力（每天训练前给药；训练期（3 d）结束24 h后重测试）。结果表明：在大鼠PLC或VH局部注射0.5 μg/0.25μl MU后30 min显著抑制VH 和PLC的脑电功率 (VH, p < 0.01; PLC, p < 0.05 vs. PBS/baseline)。注射MU (0.5 μg/0.25μl) 到 ①双侧PLC、②双侧VH、③VH-PLC均显著降低动物在空间交互延缓作业 (All p < 0.001, vs. PBS) 和空间Morris水迷宫作业中的成绩 (All p < 0.05, vs. PBS)，表明Hip-PFC回路在空间工作记忆（空间短时记忆）和在空间参考记忆（空间长时记忆）中均起重要作用。在空间交互延缓作业中，双侧PLC被抑制的大鼠的成绩显著低于双侧VH或VH-PLC被抑制的动物，说明PFC在空间工作记忆功能中占有主导地位。在被动回避作业中，双侧VH被抑制动物的回避反应的潜伏期显著短于对照动物 (p < 0.05 vs. PBS)，说明双侧VH被抑制动物的情绪记忆受损；而双侧PLC或VH-PLC被抑制的动物其回避反应的潜伏期与对照动物无显著差异 (PLC, p > 0.9; VH-PLC, p > 0.3 vs. PBS)，表明双侧PLC或VH-PLC被抑制的动物情绪记忆正常。被动回避作业的结果说明VH参与情绪记忆的形成，但Hip-PFC回路在情绪记忆形成中不起重要作用。 以上结果表明，大鼠Hip-PFC回路参与空间工作记忆和空间参考记忆而不是情绪记忆功能。情绪记忆的关键脑结构是杏仁复合体 (amygdala complex, AMC)，VH与AMC有密切的纤维联系。VH被抑制的大鼠情绪记忆受损，说明情绪记忆可能与AMC-Hip回路有关。情绪记忆与空间记忆（参考记忆和工作记忆）在解剖上的分离说明，对于不同类型的记忆来说，其在脑内的信息加工过程是并行的。神经回路内部的信息加工过程则是串行的，回路上任何一个结构的破坏均可导致回路功能的损伤。本研究的结果为学习记忆的“多重记忆系统”理论和记忆信息加工的串行并行机制提供了新的实验证据。 二、芬克罗酮改善成年恒河猴空间工作记忆的谷氨酸机制 芬克罗酮是中科院昆明植物所郝小江等合成的取代吡咯烷酮类化合物。中科院昆明动物所蔡景霞等发现芬克罗酮能改善东莨菪碱、育亨宾等导致的多种动物的不同类型的学习记忆障碍，提高老年动物的学习记忆能力，尤其是老年猴的空间工作记忆。已证实芬克罗酮为部分钙激动剂，可使脑缺血沙土鼠脑内升高的谷氨酸降低，而使正常的沙土鼠海马胞外谷氨酸释放增加。那么芬克罗酮能否提高正常动物的学习记忆，其对正常动物学习记忆的提高是否与其增加谷氨酸的释放有关？本研究采用空间延缓反应作业和谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK-801在正常成年猴恒河猴上探讨了以上问题。 结果表明，口服芬克罗酮可显著提高成年猴的空间工作记忆，其量效曲线呈倒‘U’形，符合许多促智药的量效特点。0.25 mg/kg和0.5 mg/kg为芬克罗酮的最佳有效剂量 (p < 0.05 vs. 安慰剂)。肌注MK-801 (0.1 mg/kg) 显著降低成年猴的空间工作记忆 (p < 0.01 vs. 安慰剂)，而口服2.0 mg/kg和4.0 mg/kg的芬克罗酮则显著改善MK-801导致的工作记忆障碍 (p < 0.05 vs. MK-801)。芬克罗酮的所有测试剂量不影响猴在作业中的反应时 (p > 0.05 vs. 安慰剂)，表明芬克罗酮在该剂量范围不影响动物的运动能力。 本研究结果提示，芬克罗酮可能通钙激动作用促进谷氨酸的释放，在一定剂量范围内提高胞外谷氨酸水平，提高正常动物的空间工作记忆等认知功能。 关键词：芬克罗酮，恒河猴，空间工作记忆，空间延缓反应作业，谷氨酸，MK-801

1、吗啡成瘾及吗啡对其他学习记忆的影响 2、老年猕猴初级视觉皮层细胞时间及空间特性的改变

一、 药物滥用是一种慢性、复发性脑疾病。药物滥用将导致药物成瘾（addiction），其主要表现有药物依赖、药物耐受、药物敏感化以及药物停用后的戒断症状（withdraw symptom）。药物成瘾的核心特征是强迫性觅药和用药行为。药物成瘾会导致药物滥用者认知功能的损伤和认知偏差，并会造成滥用者情绪异常。药物成瘾是一个复杂的生物学过程，有着及其复杂的机理。对药物成瘾机制的解释有很多种，主要认为成瘾过程是一种学习记忆过程，学习记忆的机制在药物成瘾过程中起到了非常重要的作用。首先，学习记忆和药物成瘾过程都受到了相似的神经营养因子以及神经递质系统的调控，例如：它们都受cAMP，CREB等调控因子的调控。其次，研究发现与成瘾相关的线索，如用药有关的人物、地点或暗示等，在药物戒断很长时间后都会恢复吸毒者的用药行为。并且，当把与成瘾相关的线索呈现给毒品戒断中的人时，这些人会出现心率、呼吸加快，血压升高等现象，甚至表现出明显的渴求行为。药物对学习记忆的影响是复杂的，虽然重复使用药物会导致药物成瘾，并且这个过程需要学习记忆机制的参与，但同时使用吗啡却会对其他类型的学习记忆（如：恐惧性学习记忆、一次性被动回避学习记忆和水迷宫空间学习记忆）造成破坏。学习前给予吗啡可以剂量及状态依赖地破坏被动回避试验以及空间辨别试验的记忆获取过程。学习过程结束后立即给予吗啡可以破坏一次性被动回避试验、主动回避试验和恐惧条件化试验的记忆巩固过程。测试前给予吗啡可以破坏空间辨别试验的记忆提取过程。本研究的目的在于更进一步地了解使用吗啡导致吗啡成瘾以及使用吗啡导致学习记忆的各个阶段受损的机制。为此我们采用了药理学以及多种行为学的方法，1、用PTZ诱发的癫痫持续状态干扰吗啡成瘾的学习记忆过程，进一步比较了吗啡成瘾的学习记忆与其他学习记忆，例如：空间学习记忆以及食物奖赏学习记忆的机制有何异同；2、研究了β-肾上腺素系统与阿片系统在空间记忆巩固过程中的相互作用；3、我们还研究了NMDA受体的激动剂和拮抗剂在吗啡破坏空间记忆提取过程中的作用。研究结果发现： 1．戊四唑诱发的癫痫持续状态，对吗啡建立的条件化位置偏好没有任何影响，动物仍然对阳性箱（吗啡匹配箱）表现出明显的偏好。但是癫痫持续状态破坏了食物建立的条件化位置偏好，并且还破坏了水迷宫和Y迷宫检测的空间记忆。癫痫持续状态破坏了食物建立的条件化位置偏好，原因不是由于其影响了动物的食欲。此外，癫痫持续状态也没有持续地破坏动物的活动能力，因此，对动物活动量的影响也不是造成其他学习记忆破坏的原因。这些结果说明，吗啡成瘾的学习记忆和普通的学习记忆在机制上可能存在不同之处。为了说明这个问题，我们还需要进行其他更深入的研究。 2、训练后立即单独注射吗啡（0.25和2.5 mg/kg）或心得安（2，10和20 mg/kg）都不会破坏动物Y-迷宫空间记忆的巩固过程，动物仍然能识别新异环境，并在里面停留较长时间。但是，训练后同时注射吗啡和心得安却可以破坏动物空间记忆的巩固过程。并且，较高剂量的吗啡（2.5 mg/kg）加上较高剂量的心得安（10和20 mg/kg）对记忆的破坏更严重，实验组动物在新异环境停留的时间显著低于对照组。这说明阿片系统和去甲肾上腺素系统在破坏记忆巩固的过程中可能有协同作用。 3、记忆提取前30分钟注射吗啡（1和10 mg/kg）可以剂量依赖地破坏Y-迷宫空间记忆的提取。单独注射NMDA受体的激动剂NMDA（1，2和4 mg/kg）对动物的空间记忆提取没有影响，但是，单独注射NMDA受体拮抗剂MK-801（0.05，0.1和0.2 mg/kg）剂量依赖地破坏了空间记忆的提取。同时注射吗啡（10 mg/kg）和NMDA（2 mg/kg）可以阻断吗啡对空间记忆造成的破坏作用。相反，共同注射吗啡（1 mg/kg）和MK-801（0.05 mg/kg）可以加重吗啡对空间记忆造成的破坏作用。这说明谷氨酸系统可以干扰吗啡对记忆提取过程的影响。 二、衰老严重地影响了人们的视觉功能，然而眼睛光学系统的老年性改变并不能完全解释清楚这种视觉功能衰退。一般认为是神经系统的退化导致了这种老年性功能降低。但是，研究显示视网膜（retina）和外膝体（dorsal lateral geniculate nucleus, dLGN）在衰老的过程中神经元的数量和体积以及神经元的功能特性，如对比度敏感性、空间分辨率等，都没有明显的变化，因此，人们推测老化导致的神经系统的变化发生在更高级的视觉皮层。过去几年的研究发现老年动物视觉皮层细胞发生了一系列反应特性的改变，如：老年动物皮层细胞的方向选择性和方位选择性降低以及细胞反应的潜伏期延长。这些细胞水平的变化被认为是老年性视觉功能衰退的神经机制。为了更全面地了解衰老过程对视觉皮层的影响以及细胞反应改变与整体功能降低之间的关系，本研究采用活体动物细胞外单位记录的方法，比较了青年和老年猕猴初级视觉皮层细胞时间反应特性和空间反应特性的差异。研究结果发现：老年动物初级视觉皮层细胞的时间频率和空间频率敏感性明显比年轻动物降低。表现为老年动物初级视觉皮层细胞的最优时间和空间频率、空间分辨率（spatial resolution, SR）和较高时间截至频率（high temporal frequency cut-off, TF50）都显著低于年轻动物初级视觉皮层细胞，同时伴随着这些功能的降低，老年动物初级视觉皮层细胞的自发放增加，对视觉刺激的反应增加，但是信噪比却显著降低。这些结果表明，老年动物初级视觉皮层细胞的功能在老化过程中都普遍降低。这可能是导致老年人视觉功能降低的原因。

1.老年猴视皮层神经元对图形对比度的反应及其潜伏期特征; 2. 极低频磁场对脑功能的影响及眶额叶认知功能的研究

1.老年猴视皮层神经元对图形对比度的反应及潜伏期特征: 在正常衰老过程中人类的视觉功能受到严重影响，例如空间和时间对比度敏感性下降以及信息处理时间的延长。虽然部分视觉功能的退化与眼睛的光学系统老化有关，但是它并不能解释所有视觉功能的下降。此外，我们以前的研究和别人的研究结果都表明衰老过程中视觉中枢系统功能的改变可能是视觉功能下降的主要原因。因此，利用单位放电记录技术（single-unit recording technique），我们比较了年轻猕猴和老年猕猴的初级视觉皮层（primary visual cortex，又称V1）神经元对比度反应之间的差异，以及V1和内侧颞叶（medial temporal cortex，MT）视觉区神经元反应潜伏期及其变异性之间的差异。结果显示，与年轻猴相比，老年猴V1区神经元对比度敏感性降低，同时伴随着神经元活动信噪比下降；老年猴V1区和MT区神经元反应潜伏期及其变异性显著增加。然而，两个年龄组MT区神经元平均潜伏期之间差异小于V1区神经元平均潜伏期之间的差异，说明MT区神经元能够自我调整老化带来的影响。另外，两个年龄组V1区神经元潜伏期和变异性都具有正相关关系，但是MT区神经元则没有这种相关性。这些结果表明，在老化过程中皮层神经元的对比度和潜伏期反应特性发生了改变。我们推测这种改变可能与视觉皮层内抑制系统功能的降低有关，但是具体的分子机制和神经环路还不清楚。总之，本实验的研究结果为更好的理解老年人在视觉信息处理中时间和空间对比度敏感性及处理速度下降提供了新线索。2.极低频磁场对脑功能的影响及眶额叶认知功能的研究: 实验目的：（1）研究极低频磁场(20 Hz, 14 mT)照射对长期吗啡处理引起的大鼠背侧海马神经元多巴胺D2密度降低的影响；（2）小鼠青春期长期极低频磁场(50 Hz, 2 mT)照射对空间学习记忆的影响；（3）初步探讨了眶额叶在大鼠新异性探索行为中的作用。实验1，我们用免疫组化的方法检测了大鼠背侧海马神经元多巴胺D2受体密度的变化。结果显示，在长期吗啡处理后戒断早期背侧海马神经元多巴胺D2受体密度相对于对照组减少，磁场和吗啡共同作用会强化这种适应，但是这种变化很快恢复正常。这些结果表明长期吗啡处理会引起海马多巴胺系统产生适应；磁场强化了长期吗啡处理对背侧海马多巴胺系统的影响,这为我们先前发现磁场照射延缓了大鼠条件位置偏好消退的研究结果提供了一个内在神经基础。实验2，我们分别用Y-迷宫（two-trial Y-maze）和Morris水迷宫两种行为装置研究了青春期早期磁场暴露对小鼠短时空间识别记忆和长时空间参考记忆的影响。结果显示，磁场暴露并没有影响小鼠Y-迷宫作业，但是提高了水迷宫任务的学习以及记忆保持。这些结果表明磁场对空间记忆的影响是任务依赖性的。实验3，我们用旷场和Y-迷宫两种行为装置研究了眶额叶电损伤对大鼠新异性探索行为的影响。结果显示，眶额叶受损并没有影响大鼠的神经运动能力，但是降低了大鼠在旷场中的行走距离和直立次数以及降低了在Y-迷宫新异臂中的探索时间和穿梭次数。这些结果表明，眶额叶的完整性对大鼠探索新异环境行为是必要的，这可能与眶额叶参与记忆或行为决策功能有关。