几种固氮菌突变种固氮酶的特性及晶体生长

一，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白的晶体生长的研究进展 在一定的结晶条件下，缺失nifZ的棕色固氮菌突变种钼铁蛋白将从溶液中结晶出深棕色的短斜四棱柱晶体。PEG 8000、MgCl2、NaCl、Tris的浓度及缓冲液的pH对该蛋白的结晶及晶体生长影响的系统研究表明，它们的浓度和pH较低时，不出晶体;当pH高于8.0，随着前三种化合物浓度的逐渐提高，便在一周内出现大量小品体;再提高浓度后，便延长结晶时问但出质好、数少而个大的晶体;然后晶体随浓度的提高而又变小、变多、甚至晶质变差，直至不再出晶体。影响晶体生长的各因子的最适浓度随其它条件的改变而有所不同。当缓冲液的pH为8.2而PEG 8000，MgCl’、NaCI、蛋白质和Tris的浓度分别为1.86%、300 mmol/L、400 mmoUL、4.64g/L、53 mmo/L时，首次发现在一滴悬滴结晶液中只有一颗较大的优质晶体（最大两边线度均为0.16mm）。 二，从分别含Mn和Cr的培养基中生长的固氮菌突变种UW3中纯化的固氮酶的特性和结晶 缺失nifH基因的棕色固氮菌突变种UW3，在有钼环境中不能固氮生长，但能在无钼而含MnS01或Na2Cr01的无氮培养基中固氮生长。分别经超声破碎、加热除去部分杂蛋白、离子交换柱层析和Sephacryl S-200或S-300柱层析的分离纯化，分别得到二种固氮酶组分l蛋白。金属元素测定表明，这两种蛋白除含铁元素外还分别含有锰和铬元素。它们的吸收光谱、CD和AR谱互不完全相同，并都与OP-MoFe蛋白存在较大差异。含Mn固氮酶也能还原C2H2、质子和N2，对它们的还原的比活性都分别约为MoFe蛋白活性的50%。初步结果表明，这一突变种在这两种培养条件下都可能已表达了不同于已发现的三种固氮酶的新固氮酶组分l蛋白-MoFe、VFe和FeFe蛋白，分别为含Mn或Cr的固氮酶组分1蛋白，分别被称为uw3，-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白。通过对PEG 8000、MgCI2、NaCI和缓冲液的种类和浓度等结晶条件的大量优化组合实验，首次获得uw3-MnFe蛋白和UW3-CrFe蛋白的的晶体。最大晶体为21.4×14.3×2.1μm。

提高生物拮抗菌对果实采后病害的生防效力研究

摘要 　　"随着人们对身体健康和环境污染的日益重视，化学农药作为控制果实采后病害的主要方法受到了很大限制，科学研究者不得不寻求更加安全有效的防治果实采后病害的新方法。生物防治以其对环境和人类健康不造成危害的优点而逐渐受到人们的青睐。然而，由于生物防治是以活菌为基础，有其局限性和时效性，单独使用拮抗菌很难达到化学药剂完全控制果实采后病害的效果，因此，提高拮抗菌的生防效力成为当今生物防治领域的研究重点。本文主要研究了拮抗菌与不同外源物质配合使用的抑病效果及协同抑病机理;拮抗菌对采前田间和采后贮藏环境条件的适应能力;以及采前应用拮抗菌对果实采后贮藏期间病害的生物防治效力。研究结果表明： 　　1、酵母拮抗菌Cryptococcus laurentii与低浓度化学杀菌剂imazalil（25g/ml）和kresoxim-methyl（50g/ml）配合使用可以显著提高对冬枣果实采后黑霉病（Alternaria alternata）和褐腐病（Monilinia fructicola）的防治效果，杀菌剂并不影响拮抗菌在冬枣果实伤口的生长动态。 　　2、酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和C. laurentii 与钼酸铵（NH4-Mo，5 mmol/L）和碳酸氢钠（NaHCO3，2%）配合能够显著提高对甜樱桃果实采后褐腐病（M. fructicola）的抑病能力。通过in vitro和扫描电镜观察结果表明，NH4-Mo和NaHCO3能够显著地抑制病原菌M. fructicola在培养基和果实伤口的生长，具有杀菌作用。 　　3、酵母拮抗菌C. laurentii和Rhodotorula glutinis与硅酸钠（Na2SiO3）配合使用对甜樱桃果实采后青霉病（Penicillium expansum）和褐腐病（M. fructicola）以及对冬枣果实青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的防治效果更好。经in vitro和扫描电镜观察表明，Na2SiO3对病原菌在培养基和果实伤口的生长有明显的抑制作用。同时，Na2SiO3还能诱导果实苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）等抗性相关酶活性的提高。 　　4、酵母拮抗菌R. glutinis与水杨酸（SA，0.5mmol/L）配合可显著提高对甜樱桃果实采后青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的抑病能力。SA不影响拮抗菌在果实伤口的生长，in vitro实验中低浓度的SA对病原菌孢子萌发和芽管伸长也没有抑制作用。SA可能是通过诱导果实产生抗性来协同提高拮抗菌的抑病效果，而不是直接抑制病原菌生长。 　　5、酵母拮抗菌C. laurentii和R. glutinis在气调（Controlled atmospheres, CA）贮藏条件下对樱桃果实采后青霉病（P. expansum）和黑霉病（A. alternata）的防治效果显著提高。气调贮藏不抑制拮抗菌在甜樱桃果实伤口的生长。 　　6、采前应用酵母拮抗菌C. laurentii 和R. glutinis能够显著抑制甜樱桃果实在采后不同贮藏环境下的发病率。拮抗菌能够在田间果实表面生长并一直保持较高的数量。在试验的三种酵母拮抗菌中，C. laurentii的防病效果最好，该菌不仅能在果实表面迅速生长，也能适应低温和CA贮藏环境。"

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

意大利威尼托（Veneto）的刺叶栎林-植物社会学生物多样性研究

刺叶栎( Quercus ilex L．)是地中海的常绿树种，属于古老的第三纪植物区系成份。本文根据苏黎世——蒙特利尔学派的植被学基本原理，全面地研究了分布在整个威尼托(Veneto)大区的剌叶栎林，详细研究刺叶栎林的群落组成、结构及类型划分。同时，对威尼托的刺叶栎林同北京山区的栎林进行了比较研究。最后，着重研究了威尼托刺叶栎林的生物多样性。 威尼托的刺叶栎林主要分布在亚得里亚海沿岸（包括Foci del Tagtiamento和Bosco Nordio e Rosolina Mare两地）、Lago di Garda和Colli Euganei。 在气候上，亚得里亚海沿岸属于半地中海气候。加尔达湖区域(Laqo di Garda)则是接近欧洲中部的大陆性气候，且维持半地中海的气候特点。Co t l i Euganei是这两地气候的过渡类型，且更接近亚得里亚海沿岸的类型。 在亚得里亚海沿岸的刺叶栎林可以分为三类，第一类(I)是一些矮树丛，这是Fraxinus ornus和Quercus ilex混交林的前身，较干旱。第二类群落(II)缺少乔木层，灌木层是由一些盖度不大的刺叶栎代替，更干旱。第三类群落(Ⅲ)是一群在外貌上相同的成熟群落．Fraxinus ornus和Quercus ilex得到充分发展，较中生。 在加尔达湖区的刺叶栎林可划分为三类。第一类群落(I)代表一组耐旱、开敞的矮树丛，含有Sesterio Variae-Ostryelum群丛的特征种，这一类可划分为SesLerio Variae-Ostryetum群 丛，土壤贫脊和干旱。第二类群落(Ⅱ)代表一类较郁闭的矮树丛，含有较多的Prunetalia群落目的成份，土壤较贫脊。第三类群(Ⅲ)代表一类郁闭的群落，乔木具有很大的密度因而林下灌木不能充分发展。SesLerio Variae-Ostryetum群丛和Prunetalia群落目的成份均不多。 在Colli Euganei的刺叶栎林可划分为二类。第一类群落(I)是一些不郁闲的矮树林组成。大体上分为地中海旱生栎林和地中海假灌丛。第二类群落(II)代表了较中生状态的植被，刺叶标种群绝对郁闭。 北京地处华北大平原的西北部。北京山地的气候为温带陆地性季风气候，其地带性的落叶阔叶林是以栎林为典型。虽然这些栎林同意大利威尼托刺叶栎林是两种不同的森林类型，但两者之间是存在着一定的联系。其共有的科有20个，共有属有11个。他们在植物组成中，以禾本科，蔷薇科和豆科的植物种类为最多。在乔木层中，他们都是以壳斗科的栎属(Quercus)为优势，其中木犀科的白蜡属(Fraxinus)和槭树属(Acer)较多。 本文对威尼托大区刺叶栎林的物种多度分布格局进行了全面探讨，计算出刺叶栎林的几何分布模型、Broken-stick分布模型、Log分布模型、Log-normat分布模型等四种物种多度分布的理论模型，并将这些理论分布模型用“序列／多度”图解和“多度／频度”图解表示出来。其中，几何分布模型．Broken-stick1分布模型用“序列／多度”图解表示。Broken-stick2分布模型、Log分布模型、Log-normal分布模型用“多度／频度”图解表示。 对上述四个物种多度的理论分布同实际现察的物种多度分布进行X2分析，在5％的显著性水平上，对整个威托大区的刺叶 栎林，几何分布模型最能代表其物种多度分布，显著性最大;Log-normal分布模型也可以用来代表威尼托刺叶标妹的物种多度分布，其显著性次于几何分布模型的显著性。这表明威尼托的刺叶栎林尚处于演替的早期阶段，这些刺叶栎林曾受到严重破坏，现正在恢复。 通过比较Foci del Tagtiamento和Bosco Nordio加尔达湖区、Colli Euganei四个地方刺叶栎林的物种多度的几何分布模型和Log-normal分布模型，显示出Lago di Garda（加尔达湖区）的刺叶栎林生物多样性最好、Foci del Tagtiamento刺叶栎林生物多样性较好．Bosco Nordio的剌叶栎林生物多样性较差．Colli Euganei的刺叶栎林生物多样性最差。 再利用多样性指数计算全部威尼托大区剌叶栎林的生物多样性。计算的多样性指数有丰富度指数（包括Margalef指数、Men-hinick指数、Monk指数）、多样性指数(Shannon信息指数、Bri llouin个息指数、Gini指数、PIE指数、Mcintosh指数)、优势度指数(Berger-Parker指数、Simpson指数)、均一度指数(Pielou均一度指数、Brillouin均一度指数，PIE的V’均一度指数．PIE的V均一度指数，N2的V’均一度指数，N2的V均一度指数，Mclntosh均一度指数，Hill的F10均一度指数，Hill的E21均一度指数，Hill的F21的一度指数）。通过比较丰富度指数，多样性指数、均一度指数与优势度之间的关系，结果，Simpson优势度指数同Men-hinick物种丰富度指数、Shannon信息指数、Bril-louin信息指数、Pielou均一度指数，Brillouin均一度指数，Mcintosh均一度指数、PIE的V’均一度指数呈负相关关系，因此，上述生物多样性指数可以较好地反映威尼托大区刺叶栎林的生物多样性。反映出的结果是：加尔达湖区刺叶栎林生物多样性最好，Foci del Tagtiamento刺叶栎林生物多样性较好，Bosco Nordio的剌叶栎林生物多样性较差．Colli Euganei的刺叶栎林生物多样性最差。 生物多样性的研究显示出生物多样性同生境状况的密切联系。往往受人为干扰严重的群落生物多样性低、如Coli Euganei和亚得里亚海岸刺叶栋林;而受人为破坏较轻的群落其生物多样性高，如加尔达湖区刺叶栎。 生物多样性的研究还显示出生物多样性同群落演替的发展阶段密切相关，在群落演替初期，由于缺乏优势种，而又有大量物种侵入，物多样性相对较高。在群落演替中期，由于形成了一个或几个优势种，优势度的增加导致了生物多样性相对减低。如Foci del Tagtiamento刺叶栎林生物多样性高于Bosco Nordio刺叶栎林的生物多样性。到演替后期，随着更多物种的侵入，群落结构的复杂化、生物多样性又将逐步提高。

粘球藻固氨作用与某些能量代谢过程的关系

在无氮培养条件下，单细胞蓝藻粘球藻（Gloeocapsa sp.）可以将大气中的氮素固定利用，其固氮能力（以乙炔还原表示）经过合适的条件（照光并有乙炔气分）诱导可以有所提高，从而打破光暗交替培养出现的固氮作用周期性变化规律。试验结果证实了这种蓝藻整体细胞的固氮作用根本上是依赖于光的。光合作用过程的能量代谢对控制固氮作用具有关键作用。虽然暗呼吸可以通过分解光合产物为固氮作用提供部分能量，但在光下的固氮是主要的。在光下无其他还原底物情况下，粘球藻细胞可以将能用于固氮的能量的70-100%用于固氮酶催化的放氢反应，这种放氢一般认为是能量浪费过程。而在有N2或C2H2等还原底物存在时，这部分能量就极少以放氢的形式消耗。说明细胞内进行的固氮或乙炔还原反应对能量的竞争力比质子还原为分子氢的反应强。在暗中无光合作用发生时，固氮作用所需要的能量由有氧分解过程提供。使用不同的抑制剂抑制光合和光下氧化磷酸化反应，都能不同程度地降低固氮活性。但光系统II水光解反应抑制剂DCMU却能意外地促进乙炔还原反应。表明固氮作用可以不从光系统II获得能量，而阻止细胞内放氧反应可能减轻固氮酶的氧损伤。粘球藻细胞具有较低的吸收分子氢的能力，但未发现能通过回收利用分子氢而对固氮作用有所推动。其具有较高的固氮相对效率是由于伴随固氮的放氢活性很低。 在无细胞体系中，固氮酶极易见氧发生不可逆失活。经过一段时间的厌氧保温处理，会出现较高的氢酶放氢活性，这种氢晦活性的出现受蛋白质合成抑制剂的阻止。

固氮蓝藻与非固氮蓝藻谷氨酰胺酶的基因克隆、表达及其特性分析

蓝藻是唯一可以进行有氧光合作用的原核生物，是水生食物链主要的初级生产者。氮素是蓝藻细胞必需的大量营养元素之一，揭示蓝藻如何应对环境中氮素的变化、维持自身碳氮平衡的分子机理，对深刻理解蓝藻与环境的相互作用、有效促进或控制蓝藻的生长与繁殖，有重要的理论和实践意义。已有的研究发现，蓝藻细胞的碳氮平衡主要是通过调控氨同化途径中的关键酶类实现。但先前的研究主要集中在固氮蓝藻谷氨酰胺合成酶（GS）-谷氨酸合成酶(GOGAT)循环的特性分析方面，而对催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸和氨的主要酶之一谷氨酰胺酶的报道极少，其分子特性及生理学意义尚不明了。因此，本论文以模式固氮蓝藻鱼腥藻7120 和非固氮蓝藻集胞藻6803 为材料，采用分子生物学和生物化学方法，对蓝藻谷氨酰胺酶进行体外研究，并对其生物学功能进行了初步探讨，获得了如下主要结果：1）对体外重组蛋白的酶活性检测发现，两类蓝藻基因组编码的假定性谷氨酰胺酶，均具有谷氨酰胺酶催化活性，表明基因组注释是准确的；2）固氮蓝藻重组酶（All2934、All4774）与非固氮蓝藻重组酶（Slr2079）酶学特征差异显著，具有不同的最适pH、温度及底物亲和力；3）固氮蓝藻重组酶All2934 催化活性受磷酸盐的激活，而非固氮蓝藻重组酶Slr2079 在高Na+浓度下活性更高；4）RT-PCR 分析结果表明，在正常培养条件下，两类蓝藻的谷氨酰胺酶基因在细胞内均有表达；5）在缺氮培养条件下，固氮蓝藻谷氨酰胺酶基因all2934 的表达水平发生明显变化，而all4774 保持相对稳定，表明前者可能在这类细胞应对氮饥饿过程中起重要作用；6）在正常培养条件下，非固氮蓝藻谷氨酰胺酶基因的缺失突变体(Δslr2079)与野生型表型相似，但在盐胁迫条件下，突变体生长速率及光合放氧活性均高于野生型，表明该基因可能在提高非固氮蓝藻细胞高盐耐受力方面起负调控作用。上述重要发现，不仅初步揭示了光合自氧生物谷氨酰胺酶体外重组酶的分子特征，也为进一步研究谷氨酰胺酶在蓝藻细胞内的专一性功能奠定了重要基础。

树突状细胞与HIV-1 辅助蛋白相互作用的体外研究——新的实验体系的建立与应用

树突状细胞（DC）是免疫系统中具有多种免疫功能的关键细胞，但在HIV/AIDS 患者 体内，虽有大量病毒及抗原存在，却不能有效地激发特异性免疫应答。最新的研究显示， HIV/AIDS 血源和性传染的途径虽有不同，但DC 均是早于T 细胞而最先遭受感染的“第一 靶细胞”。已知辅助蛋白（Nef、Rev、Tat、Vif、Vpr 和Vpu）是HIV-1 在宿主细胞内复制 和致病的根本因素。而哪种辅助蛋白、如何影响DC 功能，至今研究结果甚少，结论杂乱 不一。 本论文作为HIV-1 影响DC 功能研究的实验体系部分，旨在为系统比较研究6 个辅助 蛋白对DC 功能的调节和机理奠定基础。采用分子生物学和免疫学技术方法，把辅助蛋白 基因从DNA 和mRNA 水平导入目的细胞DC，在DC 前体及其分化、成熟的各个时相， 连续、动态地分析辅助蛋白对DC 特征性表面标志及免疫相关基因的表达水平、摄取和处 理抗原、激发和调控免疫应答等功能的影响，以期揭示HIV/AIDS 患者DC 功能明显异常 和失调的原因。 首先，分别将6 个辅助蛋白基因克隆到pEGFP-N2 和pCS2+表达载体，得到具有绿色 荧光蛋白融合基因的表达载体，将分别用于DNA 和mRNA 水平转染DC。再以K562 细胞 为模型建立mRNA 转染细胞的基本方法；以人外周血CD14 单核细胞为前体，建立了体外 “2＋2”快速诱导DC 的方法。最后，利用Amaxa 转染系统，从DNA 水平研究辅助蛋白对 DC 前体（单核细胞）的功能影响。发现单核细胞转染辅助蛋白与GFP 融合基因5h 后，胞 内蛋白大量表达，且能维持表达48h；其中Nef、Tat、Vpu、Rev、Vif、Vpr 表达效率分别 为35.42%、34.42%、43.42%、 17.07%、13.65%、10.29%；单核细胞转染基因后，表型 CD14、HLA-DR、CD80、CD83、CD86、DC-SIGN 没有明显的表达变化；转染Nef、Vpu、 Rev 辅助蛋白后，单核细胞有10％凋亡；Vpr 能抑制单核细胞IL-10 的分泌，Nef 能促进分 泌IL-6。 总之，通过构建辅助蛋白的表达载体，优化DC 的体外培养过程以及mRNA 转染方法， 并成功将辅助蛋白导入DC 前体，鉴定其表型和功能变化。为研究辅助蛋白影响DC 的功 能和机制建立了稳定而可行的实验系统。

Lentivirus介导分泌神经营养因子-3的基因工程神经干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究

神经干细胞(NSC)是中枢神经系统中具有自我更新能力和多种分化潜能的细胞,是脊髓损伤(SCI)后再生修复的理想材料和基因载体。我们探讨了Lentivirus介导分泌神经营养因子-3(NT-3)的基因工程NSC移植治疗SCI的可行性,以期为SCI后功能恢复的实验研究以及进一步临床研究提供基础资料。材料与方法一、实验材料1.试剂与来源:DMEM/F12、B27、N2(Gibco公司),bFGF(Sigma公司),Nestin抗体、NF-200抗体、GFAP抗体(武汉博士德公司),羊抗鼠NT-3抗体(USB公司),超信号West Pico化学发光底物试剂盒(Pierce34079ZZ)、人胚肾293T细胞购自武汉大学保藏中心,携带NT-3和绿色荧光蛋白(GFP)的Lentivirus的各种质粒由美国迈阿密大学Oudega M教授提供。2.实验动物:Wistar大鼠由成都军区昆明总医院实验动物中心提供。二、实验方法1.NSC的分离培养:取孕14d的Wistar胎鼠皮层组织,分离筋膜和血管,反复剪碎,再用200目细胞筛过滤,转入DMEM/F12,加B27添加剂、bFGF(20ng/ml);6~7d传代。

降低立方氮化硼薄膜应力的方法

一种降低立方氮化硼薄膜应力的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:步骤1:取一硅衬底;步骤2:将硅衬底置于离子束辅助沉积系统上，用高纯硼靶作为立方氮化硼薄膜沉积的溅射靶，硅靶作为掺杂源;步骤3:将衬底加热;步骤4:离子束辅助沉积系统采用两个能够独立调节考夫曼宽束离子源，主离子源采用Ar+离子轰击硼靶与硅靶，同时以Ar+及N2+的混合离子束作为辅助离子源轰击衬底，使衬底上沉积形成立方氮化硼薄膜;步骤5:在离子束辅助沉积系统中将衬底降温;步骤6:取出制备后的衬底，进行应力参数测试，完成制备。

Effect of CO on characteristics of AlGaN/GaN Schottky diode

Pt Schottky diode gas sensors for CO are fabricated using AlGaN/ GaN high electron mobility transistor ( HEMTs) structure. The diodes show a remarkable sensor signal (3 mA, in N-2; 2mA in air ambient) biased 2V after 1% CO is introduced at 50 degrees C. The Schottky barrier heights decrease for 36meV and 27meV in the two cases respectively. The devices exhibit a slow recovery characteristic in air ambient but almost none in the background of pure N2, which reveals that oxygen molecules could accelerate the desorption of CO and offer restrictions to CO detection.

Metal alloy and monoelemental nanoclusters in silica formed by sequential ion implantation and annealing in selected atmosphere

The preparation of metal alloy and monoelemental nanoclusters in silica by Ag, Cu ion sequential implantation and annealing in selected oxidizing or reducing atmosphere is studied. The formation of metastable Ag-Cu alloy is verified in the as-implanted samples by optical absorption spectra, selected area electron diffraction and energy dispersive spectrometer spectrum. The alloy is discomposed at elevated annealing temperature in both oxidizing and reducing atmospheres. The different effects of annealing behaviors on the Ag Cu alloy nanoclusters are investigated. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.