电化学发光及其在分析化学中的应用

电化学发光是指通过电化学方法来产生一些特殊的物质．然后这些电生的物质之间或电生物质与其它物质之间进一步反应而产生的一种发光现象；它是化学发光方法与电化学方法相互结合的产物。由于电化学发光分析法除了具有化学发光分析法所具有的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点外，它还能克服化学发光分析法中所存在的一些缺点，如一些化学发光试剂不易保存或在特定条件下不稳定、难以实现时间和空间上的控制、化学发光试剂难以重复使用和溶液混合不均匀所带来的重现性相对较差等问题，因此近年来，电化学发光分析法受到了许多人的关注。本文正是在这样的背景下，开展这方面的工作，力图克服电化学发光目前存在的一些问题和拓展电化学发光分析的应用领域，获得的主要结果如下：1 针对一些电化学发光体系工作电极容易中毒的缺点，设计了一套具有一定特色的电化学发光流动注射分析装置。该装置中首次采用了双垫片结构的电解池，它可以方便地改装为喷壁式电解池，适于酶修饰电极参与的流动注射分析。同时该电解池还可以作为静态池。2 对吡啶钌/EDTA电化学发光体系作了较为系统的研究。发现EDTA浓度的变化会影响到电化学发光机理，并对这一现象作了初步的解释。同时还发现亲氧离子对电化学发光无影响，而亲氮离子对电化学发光具有抑制 作用，而且在一定浓度范围内，亲氮离子的浓度与电化学发光的强度成线性关系。该结果对研究金属离子与吡啶钌电化学发光之间的相互关系具有一定的指导作用。3 提出了采用有机溶剂修饰电极实现一些体系在水溶液中进行电化学发光的新思路。利用碳糊电极这种最简单的有机溶剂修饰电极，成功地使吡啶钌/过硫酸体系在纯水溶液中发光。这种有机溶剂修饰电极可望用于实现其它一些体系在纯水溶液中发光，如邻菲咯啉/过硫酸休系。实验中我们还发现在没有过硫酸参与下．吡啶钌也能在负电位卜产生电化学发光现象。这说明采用修饰电极可望实现吡啶钌与过氧化氛之间的电化学发光。4 针对目前吡嗪钌电化学发光测定过硫酸需要较负的电位这个缺点，提出了采用吡啶铬电化学发光测定过硫酸的新方法，使电位正移+0.5V左右．取得了较好的测定效果。5 提出采用富集的方法测定氯丙嗪。经过富集后，使线性范围向低浓度移动了两个数量级左右。该方法可望用于大量药物的高灵敏测定。6 将碳糊这一电化学领域特殊的修饰方法引入化学发光分析领域，用于过氧化氢和鲁米诺的测定取得了较好的效果。碳糊修饰法具有以下优点。第一，它是一种本体修饰方法，表面更新容易，而且制作简单、价廉：第二，该方法具有提高酶的稳定性的作用，可用于酶参与下的化学发光分析；第三，该方法不需任何化学反应，就可用于难溶性的化合物的修饰，为一些金属离子的选择性测定提供了一种更为简便的方法。另外，鉴于溶解平衡是一种动态平衡的特点，我们提出了一种新的碳糊电极制作方法，该方法一方面保证了碳糊的均匀性，另一方面还可以避免使用超声或难以挥发的溶剂。

稀土对红细胞及带3蛋白胞质片段结构和生理功能的影响

稀土在农业和医学中的广泛应用使人们日益关心稀土的安全性问题。本论文以红细胞为研究对象，围绕稀土对红细胞形态的影响，稀土能否进入红细胞以及稀土对红细胞带3蛋白胞质片段结构和功能的影响三方面开展研究工作，主要研究成果如下：首先，在宏观上通过超高倍光学显微镜观察了稀土阳离子及其络阴离子对正常人红细胞形态的影响。结果表明当红细胞与硝酸悯作用后其体积发生膨胀，表面出现棘状凸起，细胞间发生聚集。而以往被人们认为毒性较小的柠檬酸悯则使红细胞呈现囊泡状凸起，随着与稀土作用时间的延长多数囊泡状结构可脱落。EDTA的加入可使部分在低浓度（10~(-7)M）稀土离子条件下变形的红细胞恢复原状，说明细胞形态变化主要是由环境中稀土的存在引起的。其次，根据稀土离子跨膜研究中存在的一些问题，在总结前人工作的基础上，建立一种方法测定了体外温育和静脉注射条件下红细胞中稀土含量。进一步证实文献报道含有络合剂的洗涤缓冲液能够将进入细胞内部的稀土带出，影响测定结果的准确性。本论文中应用不含络合剂的洗涤缓冲液洗涤与稀土温育后的红细胞，在10mMTris-HCl印H7.0）低渗缓冲液中溶胀，ICP-MS测定结果显示无论是稀土阳离子还是稀土络阴离子均可以跨膜，且稀土络阴离子跨膜速度较快。耳静脉注射稀土后仅在兔血浆及红细胞膜上检测到稀土，说明在短期静脉注射条件下存在于血浆中的稀土不能进入兔红细胞。最后，应用基因工程技术克隆、表达、纯化了带3蛋白胞质片段及其融合蛋白。计算机结构模拟、荧光光谱以及生物活性的测定证实重组带3蛋白胞质片段与天然蛋白具有相似的空间结构和生物活性。稀土离子对醛缩酶、醛缩酶与带3蛋白胞质片段相互作用的影响表现为：0-10μMLa~(3+) 对醛缩酶活性有促进作用，当体系中L~(3+)浓度达到6μM时，带3蛋白胞质片段基本完全失去对醛缩酶活性的抑制作用。蛋白质内源荧光和同步荧光光谱研究结果表明，La~(3+)对带3蛋白胞质片段与醛缩酶结构均具有一定影响。本论文实验结果表明，低浓度稀土可导致调节细胞内糖酵解速率的带3蛋白胞质片段失去活性，使糖酵解速率无序增强。由于红细胞主要碳源来自于血糖，糖酵解速率的加快很可能会引起生物体血糖浓度的降低。

纳米稀土发光材料的合成与表征

纳米稀土发光材料由于表面界面效应和小尺寸效应而具有特殊的发光特性已引起人们的注意。本论文我们从合成纳米粒子入手，以稀土离子为探针，探讨纳米化后稀土材料发光性能，得到了一些新的、有意义的结果。1．用燃烧法合成了G由03：E矿＋纳米晶，xRD和TEM结果显示经不同温度处理后的粒子的平均粒径为8一23nm。光谱的研究结果表明，来自于Eu3＋离子发射峰随粒子尺寸减少而呈现拓宽，而基质吸收相对于电荷迁移带的强度相对增强。这与E记＋的不同局域环境有关。Eu3＋离子的碎灭浓度为8％。荧光寿命随着纳米粒子尺寸的减小和E矿＋离子浓度的增加而缩短。通过分析发光强度与Eu3＋浓度的关系，认为产生发光碎灭为交换相互作用，并对燃烧法和501一gel方法合成的样品的结构与光谱进行对比。2，采用沉淀法在60℃合成了Yvo4：叮＋纳米晶，xRD和TEM结果表明经不同温度处理后纳米粒子的平均粒径为5一18nm，通过比较样品的光谱，发现V一O的吸收带的变化，发射光谱宽化的现象，均来自于较大的表面积／体积比，E记＋离子的碎灭浓度为12％。荧光寿命随粒径减小和E矿＋离子浓度的增加而降低。并与501一gel法合成的Yvo4：Eu3＋样品和纳米Gdvo4：E矿的光谱进行了对比分析。3．采用沉淀法在不同条件下合成了纳米GdP氏：E矿＋样品，研究结果表明纳米粒子的粒径、发射光谱和激发光谱与pH和EDTA的加入有关。较低的pH有利于形成分散性好，粒径小的纳米粒子。EDTA的加入易于形成棒状的纳米粒子。E矿＋离子的碎灭浓度为8％。纳米YP氏：Eu3＋样品xRD结果表明：低温有利于（200）晶面生长。酸性条件或低温下合成的样品中Eu3＋具有较低格位对称性。4．燃烧法，均相沉淀法和共沉淀法合成纳米G由03：E尸＋，孔3＋的上转换发光体，XRD和SEM结果表明：所有纳米粒子均为球形，而燃烧法合成的样品粒径较小。上转换发光光谱表明：由于不同数量ED护认的加入，使样品的红光和绿光的发射强度发生的明显变化，其原因同样与掺杂离子的局域环境是不同有关。

一种新型的用于ICP－AES的氢化物元素和非氢化物元素同时分析的氢化物发生雾化装置的研究

氢化物发生－高频感耦等离子体原子发射光谱分析（HY－ICP－AES），由于它的灵敏度高和多元素同时分析等特点，近年来受到越来越多的科学工作者的重视。本文对HY－ICP－AES的原理、发展及应用作了比较详细的综述，并根据氢化物元素和非氢化物元素同时测定的实际要求，提出了一种新型的氢化物发生－雾化系统。文献上已报导了两种氢化物元素和非氢化物元素同时测定的方案，并取得了令人满意的结果。但在这些方案中，存在一些问题需要解决，而且装置比较复杂，操作也比较麻烦。在我们的氢化物发生－雾化系统中，用一个同心玻璃雾化器将待测的样品溶液雾化，细雾滴形成气溶胶，较大液滴被收集在一个玻璃槽中，硼氢化钾溶液用蠕动泵从玻璃槽底部送入，与收集的样品溶液混合并发生化学反应，产生挥发性的共价氢化物。生成的气态氢化物和样品气溶胶以及载气一起进入等离子体，因而可以进行氢化元素和非氢化物元素的同时测定。砷、锑、硒和碲的检出限分别为0.0075，0.0006，0.008，0.003，0.002 μg/ml，比传统的气动雾化方法得到的检出限好20－30倍。而对非氢化物元素，检出限可与双简雾室雾化相当。本系统进样量小（约2 ml)，且样品的利用率大为提高，有利于小量样品的分析。但由于进样量较小，限制了灵敏度的进一步提高。本系统的另一个特点是不仅可以用于氢化物元素和非氢化物元素的同时测定，而且在需要的情况下，不需拆换雾化装置，不需灭火，即可在1－2分钟内转变成为普通的测定非氢化物元素的雾化系统。只要将蒸馏水取代硼氢化钾溶液把收集样品溶液的玻璃槽冲洗干净，即可作为普通的雾化系统之用。我们用这种氢化物发生－雾化系统研究了等离子体功率、载气流量、观测高度、样品介质酸度、硼氢化钾溶液和流量对待测元素信号强度、信－背比和检出限的影响以及硼氢化钾溶液的稳定性和硼氢化钾的引入量对等离子体稳定性的影响等。我们还研究了几种共存干扰元素对氢化物形成的干扰情况。为了消除或减小共存元素对氢化物生成过程的干扰，我们试验了EDTA，8－羟基喹啉，氨三乙酸，硫脲等对干扰元素的掩蔽作用，最后选EDTA作为掩蔽剂，对消除或减小共存元素的干扰起了明显的作用。我们用本雾化系统分析了一种甜菜颗粒粕样品和桃叶82301标准参考物质。分析结果与其它方法或标准值比较吻合。在甜菜颗粒粕样品的分析中，我们发现基体中大量镁、钙对砷等低含量元素的光谱干扰比较严重，利用元素间干扰比不能予以准确扣除。我们用标准和样品的基体相匹配的方法解决了镁、钙的光谱干扰问题。

冠醚修饰电极及其在分析化学中的应用

本论文较系统地研究了Naf:on聚合物薄膜冠醚修饰电极阳极溶出伏安法在分析中的应用。首次将Naf:on薄膜冠醚类化合物修饰电极应用于铊、银和铅三种离子的测定，得到了高灵敏度的分析方法亦用于实际样品测定。用涂层法制备了Naf:on聚合物薄膜冠醚（二环已基18－冠－6）化学修饰电极，用这种修饰电极测定金属离子的高灵敏度来源于将Naf:on对大阳离子的强离子交换能力、冠醚类化合物络合金属阳离子形成大阳离子的能力与溶出伏安法的高灵敏度三者的结合，冠醚化合物中性分子可与金属阳离子络合形成大络阳离子：M~(n+)＋qC=(MC_q)~(n+) Naf:on膜由于其具有的对大阳离子的强交换能力而将冠醚与和金属离子形成的大阳离子络合并吸附于电极表面，在溶出伏安法的富集过程中，电位置于是以令（MCq）~(n+)还原的位置以使（MCq）~(n+)还原：（MCq）~(n+)＋ne=M＋qC 析出的零价态的金属可在Naf:on膜内固定，同时又放出冠醚分子成为新的未被占据的络合吸附中心，继续捕获溶液中的阳离子从而起到富集作用。由于使用溶出伏安法排除电极表面络合吸附饱和的问题，从而使本方法灵敏度大大高于一般的使用化学修饰电极进行预富集的分析测定方法。提出了Naf:on薄膜冠醚修饰电极阳极溶出伏安法测定水溶液中Te(I)的方法，在电位为－1.30 Vvs.Ag/Ag ce处0.1高氯酸锂溶液中，用该修饰电极富集30分钟，检测下限可低至2×10~(-12)M（0.4 ppt）。溶液中Te(I)浓度在5×10(-12)M～1×10(-8)M范围内与溶出峰电流成良好的线性关系且通过原点，可以用标准加入法测定。常见共存元素Zn（II），Su（II），Cu（II），Fe（II），Co（II），Ni（II），In（III）等无干扰。Pb（II）与Cd（II）共存时对Te（I）有干扰，同1×10~(-3)M EDTA掩蔽可有消除干扰。测定了合成样品中的Te（I）含量，平行测定七组样品相对标准偏差4.2％。本文法是目前Te（I）的分析中最灵敏的电化学方法之一。提出了Naf:on薄膜冠醚修饰电极阳极溶出伏安法测定水溶液中Ag（I）的方法。在0.01MHNO_3 4～7×10~(-3)M Cl混合溶液中，检测电位在－0.30Vvs.SCE富集30分钟，检出下限可低至2×10~(-12)M，是迄今所见Ag（I）的分析中灵敏度最高的电分析方法。Ag（I）浓度在2×10~(-11)M～1×10~(-8)M范围内与溶出峰电流成良好的线性关系且通过原点。五到十倍量的Hg（II）和Au（II）有干扰。用本法测定了分析纯硝酸铵中的银含量为0.000048％，平行测定七组样品相对标准偏差为3.7％。提出用Naf:on薄膜冠醚修饰电极阳极溶出伏安法测定水样中铅的方法。在0.lMLiNO_3底液中，电位在－1.10Vvs.SCE富庥3分钟检测限达5×10~(-10)M，方法快速灵敏。Pb（II）浓度在1×10~(-9)～1×10~(-7)M范围内与溶出峰电流呈线性关系。1×10~(-6)以上Cu（II）存在使Pb（II）的峰电流时显增加。用本方法测定了自来水样中的铅含量，平行测定七组样品相对标准偏差8.0％。该修饰电极在K~+浓度为1×10~(-5)～1×10~(-7)M范围内对K~+有能斯特响应。本工作为铊、铅、银的痕量分析提供了高灵敏度的方法，为溶出伏安法摆脱汞污染的问题做出了贡献，为化学修饰电极用于分析化学领域提供了新的途径。

碱土金属与不对称变色酸多卤代双偶氮氯膦类试剂的新显色反应的研究及反应机理的探讨

本文研究了碱土金属锶、钙与新型显色剂2-(4-氯－2－苯膦酸)－7－(2, 6-二溴－4－氯苯基)－1，8－二羟基－3，6－萘二磺酸(简称DBC－偶氮氯膦)的显色反应及其在分析上的应用。研究结果提出了两种高选择性的测定锶、钙的新方法。本文研究出的新分析方法在实际样品的分析中收到了令人满意的结果。本文还研究了碱土金属元素与五种多卤代偶氮氯膦类试剂的显色反应性能，对反应的机理和配合物的结构方面的问题作了一些研究及探讨。通过对几种多卤代偶氮氯膦类试剂与碱土金属显色反应的研究。筛选出较好的显色剂，并对寻求更好的碱土元素显色剂提出了一些建议。本论文分五个部分，现分述如下：1. 一种新的测定锶的高选择性光度法的研究：本文利用武汉大学化学系最近合成的新显色剂DBC－偶氮氯膦进行了锶显色反应及其在分析上应用的研究。研究结果表明：锶与DBC－偶氮氯膦在酸性条件下可形成一种十分稳定的兰色配合物，该配合物在630nm波长处有最大吸收。摩尔吸光系数为ε＝6.0*10~4l·mol~(-1)·cm~(-1)配合物中Sr:DBC－偶氮氯膦=1:2。在丙酮、Na_2SO_4、EDTA等存在下，并采用双波等分光光度，有效地消除了钡、钙的干扰及在此条件下其他共存的三十余种离子的干扰。本文还进行了显色酸度，配合物稳定性的试验，利用本方法进行了海水，氧化镁试剂和硅铁锶合金中锶的直接测定，结果较为满意，与其他方法进行对照，结果相符，加入试验的回收率一般为99－102％。方法灵敏，简便，选择性好，快速和不需要任何分离过程。2. DBC－偶氮氯膦与钙显色反应的研究及其在高纯氧化钇中钙的测定的应用：本文利用DBC－偶氮氯膦进行了钙显色反应的研究。并将此显色反应于高纯氧化钇(Y_2O_3>99.99％～99.999％)中的ppm级的钙的测定。本文进行了钙与DBC－偶氮氯膦生成的配合物的吸收光谱，显色反应酸度范围，显色剂的用量，配合物的稳定性，配合物的组成及干扰组分的消除等方面的研究。研究结果表明：钙在弱碱性条件下可与DBC－偶氮氯膦形成一种兰色的配合物，该配合在625nm处有最大吸收。表观摩尔吸光系ε＝2.8*10~4l·mol~(-1)·cm~(-1)。配合物的组成是Ca:DBC－偶氮氯膦＝1:1。在DTPA－Zn存在下较大量的氧化钇和铁等三十余种离子不干扰测定。方法线性范围较宽。配合使用偶氮氧化BN－TBP(磷酸三丁酯)－环乙烷体系进行一次简单的粗分离后，成功地测定了高纯氧化钇中的微量钙，此方法是目前已见报导的分光光度法中，在测定高纯氧化钇中微量钙方面最简便的方法。用此方法测定的削钢中微量钙，也得到满意的结果，加入试验回收率较好。方法灵敏、简易、选择性较好。3. 新型显色剂DBC－偶氮氯膦的提纯和鉴定：本文提出了一种分离提纯新型稀土显色剂DBC-偶氮氯膦的方法。通过利用国产离心薄层层析仪。在硅胶G和CaSO_4做的薄板上，以甲醇和二氯甲烷作展开剂，分离了杂质。然后用PMBP环乙烷萃取了其中引入的钙，提纯后的试剂经过分析鉴定，纯度在94％以上，其中钙量低于空白值(原子吸收法测定)。方法产率在90％以上，用提纯后的试剂进行了红外光谱，元素分析，热失重分析，得到了试剂组成及结构，与试剂合成单位所提出的一样，并用层析法，光度法检查了纯度，比较了粗品与纯品的吸收曲线和对碱土的灵敏度。4. 碱土金属与多卤代偶氮氯膦类试剂的显色反应的研究：本文研究了钙、锶、钡分别与五种多卤代偶氮氯膦类试剂(2，6－二溴－4－氯偶氮氯膦，2，4，6－三溴偶氮氯膦，2，6－二溴－4－磺酸偶氮氯膦。2，4，6－三氯偶氮氯膦，2，6－二溴－4－硝基偶氮氯膦)显色反应。记录了各显色反应的吸收光谱。试验了各元素与各种试剂显色的酸度范围，测定了各种配合物的组成，进行了各种试剂对碱土元素的选择性的试验。比较了几种试剂对碱土的灵敏度。研究结果表明：TB－偶氮氯膦和DBC－偶氮氯膦是较好的碱土试剂，从灵敏度，选择性和显色酸度来看，这两个试剂都优于其他几种试剂。DBN－偶氮氯膦性能较差。研究还指出，钙只有在碱性条件下才能与这几种试剂较好地显色。酸性条件下碱土元素与几种试剂都形成1:2配合物。钙在碱性条件下与试剂形成的是1:1配合物。本文对试剂结构与其性能方面的关系进行了讨论。对进一步合成新的碱土试剂提出了一些看法。5.碱土金属与DBC－偶氮氯膦显色反应机理及配合物结构的探讨：本文研究了DBC－偶氮氯膦在不同酸度下的存在形式，质子化情况及反应中的质子释放情况。测定了钙、锶、钡与其形成的配合物的稳定常数。利用红外光谱、激光拉曼光谱、核磁共振谱等对所生成配合物的结构进行了研究。根据实验结果和有关的分子轨道理论。配位场理论对配合物的结构进行了讨论。提出配合物的结构式及空间构型。本文还对显色反应机理和配合物成键情况进行了初探。本文的研究工作。为进一步开展水溶液中配合物结构的研究和显色反应机理的研究起了抛砖引玉的作用。

溶液中制取稀土化合物超微粉末

超微粉末由它的大比表面、表面活性及光、电、磁、热等方面的特异性能而引起人们的极大重视。日本、美国等国家对超微粉末的制备、性质、应用等方面作了较详细的研究。我国近几年也开展了这方面的工作。主要是用物理方法制备金属、氮化物超微粉末。化学方法制备超微粉末还比较少，且方法还在探索之中，尤其是对稀土化合物超微粉末的研究鲜见报道。稀土在各种材料中有着广泛的用途。为提高稀土材料的性能，使其有新的、更高的应用价值，制备稀土化合物超微微粉末是完全必要的，超微粉末的制备也会给研究稀土元素的本征性质创造条件。本文首先合成了稀土陶瓷粉末Y_2O_2稳定的ZrO_2超微粉末，对其三种化学制备方法进行了研究比较。认为：水热法制备Y_2O_3稳定的ZrO_2超微粉末，其程度与溶液的pH值，NH_4OH的浓度和滴加速度有关。此法得到粉末产量较低，粒度较小，有轻微的因聚现象。沉淀法制备也需严格控制NH_4OH的浓度和滴加速度，沉淀物是体积庞大的凝胶，过滤、洗涤困难。水解法操作方便，得到的产品产量较高，粉末粒度较小、均匀、易分散。综合比较结果，水解法有可能成为大量工业生产的方法。用水解法制备了不同Y_2O_3含量(原始配料：3～30mol％）的ZrO_2超微粉末。Y_2O_3含量<10mol％时，得到的是部分稳定的氧化锆粉末；>10mol％时，得到的是全稳定的立方相氧化锆粉末。粉末粒径<0.01μm。用EDTA络合滴定法分析了产物中钇、锆含量。观察了温度对水解后的Y_2O_3稳定的ZrO_2淀淀的粒度、形状、结构等影响。200～800 ℃灼烧得到的粉末形状清晰、颗粒度小。温度低于400 ℃，为无定形粉末，800 ℃时基本完全晶化为微晶。此微晶X-ray衍射峰较宽，衍射峰出现位移，导致Y_2O_3稳定的ZrO_2超微要较纯四方相ZrO_2粉末的晶胞参数小。从热力学上，分析了影响Y_2O_3－ZrO_2超微粉末的核形成与核生长速度的因素。用醇盐法制备了系列稀氢氧化物、氧化物超微末，异对其形貌、粒度、结构进行了研究。以不同的衡土氢氧化物、氧化物超微粉末为例，做了热稳定性，表面活性，催化活性等方面测试比较。稀氢氧化物，氧化物超微粉末具有不同的形状，大部分粉末粒度均匀、分散好。轻稀土氢氧化物超微粉末大部分为结晶形，而重稀土氢氧化物大半为无定形。氧化物粉末，除La_2O_3为立方晶系外，其它全部为立方晶系的微晶。热分析仪测定了超微与普通Nd(OH)_3粉末的差热、热重情况吸热峰 面积超微大于普通粉，不同温度下的失重超微多于普通粉。证实了超微微粉末的比表面大、吸附量大。首次研究了超微粉末的表面光电压光谱，为探讨超微粉末性质又提供了一种手段。稀氧化物超微化皇，表面光电压谱相对强度增强。说明超微粉末面电子与表面空穴增多，由此使得表面活性增大。用La_2O_3粉末做了邻苯二甲酸二辛脂的合成的催化性能比较超微粉末的催化活性高于普通粉末。用醇盐法合成了复合氧化物La_2O_3－Al_2O_3超微粉末。

全差示分光光度法在环境分析中的应用

全差示分光光度法是八十年代初在我国发展起来的新技术由于它有灵敏度高，精密度好等特点，目前已在分析测试中逐渐得到推广和应用，并已取得了令人满意的结果。本论文从以下四方面探讨了全差示分光光度法在环境分析中的应用。一、全差示分光光度法测定水、土壤、沉积物中的全铁本文研究了Fe(II)-邻菲绕林体系测定全铁的全差示分光光度法的条件，提出了一个线性范围很宽的测定全铁的分光光度法。用于水中微量铁的测定，检出限比普通光度法降低近二十倍，可直接检测IO PPb以上的全铁。用于土壤、沉积物中常量全铁的测定，测量结果的精密度能和容量法相比拟。利用本方法分析江水和沉积物中全铁的含量，与原子吸收光谱法，2CP-AES法相比较，结果一致。二、铬（II）与N，N-二乙基-对二苯胺氧化显色反应的研究及全差示分光光度法测定自来水中微量铬本文在详细地研究铬（II）与N，N-二乙基-对二苯胺氧化显色反应的基础上，提出了一个测定微量铬的新方法。在Na4c-H4c缓冲溶液及40%的乙醇水溶液中，铬（II）与N，N-二乙基-对二苯胺形成稳定的紫红色产物，在λ=554nm处有最大吸收，ε = 32900L、mol~(-1), cm~(-1)。采用全差示分光光度法作检测手段，利用上述方法可直接检测水中X PPb以上的铬。三、测定微量硫化物的亚甲蓝（乙基蓝）方法的改进及全差示分光光度法测定水中微量游离硫化物我们详细研究了以k_2Cr_2o_7代替Fe~(3+)测定微量硫化物的反应条件，显色反应的最佳条件为：[H~+] = 0.08-0.23M, N, N-二乙基-对二苯胺用量为2.5ml(0.29/100ml)，0.0019/ml K_2Cr_2O_7用量为0.4ml。灵敏度比原方法提高近50%，显色反应迅速完成。利用上述方法采用全差示分光光度法作检测手段，可直接检测水中ax PPb-25PPm之间的微量游离硫化物。用于自来水、地下水、湖水中微量游离硫化物，结果令人满意。四、全差示分光光度法测定水中游离氰及总氰在蒸馏分离过程中，采取改变波蒸溶液的PH值及加入不介的介质于蒸馏并中，能使强铬合态的氰化物与游离氧化物分离。在PH = 7蒸馏时，只有游离氰及Zn~(2+)、Cd~(2+)的氰的络合物被蒸出；在PH=2的酒石酸十EDTA介质中蒸馏时，测定的总氰。采用全差示分光光度法与蒸馏法相结合的手段，对水中游离氰化物及总氰进行了测定，结果满意。

分光光度法测定单一稀土元素的研究

本论文主要对La、Ce、Eu的分光光度法的测定进行了研究，包括以下三部分内容：一、分光光度法同时测定包头矿和铝合金中的镧和铈详细研究了十五种稀土元素共存时分光光度法同时测定镧和铈的条件及应用。在一氯乙酸介质中，对乙酰基偶氮胂与稀土元素形成蓝绿色配合物，当加入适量掩蔽剂Zn-EDTA并控制显色剂用量时，可使铈以后的稀土元素不发色而只有镧和铈显色（镧、铈对其它稀土显色起抑制作用），此时可测得镧铈合量；当其它条件不变而仅改变En-EDTA用量情况下，体系的平衡受到了改变，镧和铈的吸光度亦随之改变；利用这一差异，根据吸光度的加和性原理，建立了同时测定镧和铈含量的二元方程组，简单、有效地解决了镧、铈单一含量的测定问题。首次建立了在十五种稀土元素共存条件下同时测定La、Ce单一含量的分光光度法，经对几种样品进行分析，得到了满意的结果。方法主要适于轻稀土为主的样品中的镧、铈含量的测定，简便易行。二、分光光度法测定龙南混合稀土氧化物中的少量镧铈含量为了解决以重稀土为主的龙南矿中少量镧铈含量的测定问题，在本工作中首次用EDTA和En-EDTA为掩蔽剂联合掩蔽了镧、铈以外的其它大量稀土，从而达到了选择性测定镧铈含量的目的，采用掩蔽剂提高了分析方法的选择性。本方法是先采取适量EDTA络合大量重稀土再以Zn-EDTA掩蔽镧铈以外的其它稀土，从而消除了主要来自在于重稀土（钆基）的影响，然后以对乙酰基偶氮肿显色，成功地完成了低至百分之几的龙南矿中的镧铈含量的测定。详细确定了适宜工作条件并对28种可能产生干扰的阴阳离子进行了试验，镧铈含量在1～35Mg/25ml范围内遵守比尔定律，工作曲线线性范围较宽，相关系数好（0.9992）。本法选择性、精度和分析结果均好，而且简便、快速、不需任何化学分离，因而比较实用。该法首次解决了以重稀土为主的样品中低含量镧铈含量的分析测定。三、流动注射-光度法测定包头矿和龙南矿中的痕量铕Eu(III)能被Jones还原剂选择性地还原为二价，生成的Eu(II)具有极强的还原能力，可使次甲基蓝试剂还原褪色，本工作基于此建立了铕的流动注射-光度分析法，使铕的含量分析实现了自动化。方法重点解决和克服了普通光度法测定铕时所存在的下述问题：在普通光度法中，由于还原产生Eu(II)极不稳定，易被空气中的氧气所氧化因而使体系不够稳定，必须在惰性气流如二氧化碳、氮气等保护下工作才能进行；这样除操作不便及分析条件难以控制外，而且分析的重现性较差，分析结果精度不好，使普通江度法难以实际应用。为了解决以上问题，本项工作把新兴的流动注射技术和光度分析法的优点集于一体，研究建立了有铕的流动注射-光度法，解决了以普通光度法测定肴时所未能解决的问题，建立了一个较为实用的测定铕的方法。本法具有简便、快速、操作方便，结果准确，自动化程度高等优点。

眼镜王蛇蛇毒金属蛋白酶的分离鉴定和分子克隆

蛇毒金属蛋白酶(SVMPs)被认为是出血性蛇毒中的重要成分，是一个包括多种类 型成员的家族，它们在结构上表现出较大的多样性，有的蛇毒金属蛋白酶除了含有酶结 构以外在羧基端还添加了更多的结构，如：去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域、 外源凝集素结构域，这种结构多样性导致了蛇毒金属蛋白酶生物活性上的多样性。眼镜 蛇科中的蛇毒主要以神经毒为主，对其金属蛋白酶成分的研究比较少，本文以眼镜王蛇 蛇毒中的金属蛋白酶为研究对象，探讨了它的生物活性、结构特点,为我们深入了解蛇 毒金属蛋白酶结构与功能的关系提供了新的研究信息。 首先，通过分子筛凝胶过滤、阴离子交换和肝素亲合层析，我们从梧州产眼镜王 蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒中纯化到一个表观分子量为55,000Da 的单链蛋白，测定 了其N 端序列为SQKKDFLEEKKYLELYIVADYVMFR，与其它蛇毒金属蛋白酶的N 端 序列相似性较高，命名为Ohagin。接下来我们研究了该蛋白对纤维蛋白原的作用，发 现Ohagin 能专一性地降解人源纤维蛋白原的α-链，其降解活性能被EDTA 完全抑制， 但不被PMSF 所抑制，说明该蛋白酶为金属蛋白酶。Ohagin 能抑制TMVA 诱导的血小 板聚集，并且这种抑制效应是剂量依赖性的。我们通过cDNA 克隆、蛋白质测序和肽 指纹图谱方法确定了Ohagin 的蛋白质序列，Ohagin 的cDNA 序列编码一个611 氨基酸 长度的开放阅读框，包括信号肽、前肽和成熟蛋白所含有的金属蛋白酶结构域、去整合 素样结构域以及富含半胱氨酸结构域，根据这一结构特点，把Ohagin 归为P-III 型蛇毒 金属蛋白酶。将Ohagin 蛋白质序列与P-Ⅲ型蛇毒金属蛋白酶家族中有代表性的22 种 毒素蛋白序列进行比对和进化树分析后发现Ohagin 与P-Ⅲa 型、P-Ⅲb 型和P-Ⅲc 型 的蛇毒金属蛋白酶的亲缘关系较远，而与眼镜蛇科已知的几种金属蛋白酶亲缘关系较 近，推测它们的生物活性也类似，有可能属于新的P-III 型蛇毒金属蛋白酶亚家族。

眼镜王蛇毒第X因子激活剂结构和功能研究

通过G-75（超细）凝胶过渡，快速蛋白液相色谱（FPLC）阴离子柱两步离子交换从眼镜王蛇毒中分离得到了一个特异的血液凝固第X因子激活剂。在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中均呈一条均一的带。纯化的眼镜王蛇毒第X因子激活剂不能作用于纤维蛋白原、凝血酶原、蛋白C、纤溶酶原，对6种人工合成小肽发色底物及BAEE的水解实验表明它不能水解大多数小肽底物，不具备水解BAEE的酯酶活性，表明了它对大分子及小分子底物作用专一性较高，同时表明了对FX的作用是较为专一的。抑制剂研究结果表明它对FX的激活活性被丝氨酸蛋白酶的抑制剂PMSF、TPCK等抑制，而金属离子螯合剂EDTA则无影响，表明眼镜王蛇毒血液凝固第X因子激活剂是一个丝氨酸蛋白酶。

菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶的研究

本论文结合生物化学与分子生物学手段对云南产菜花烙铁头蛇毒（几互刃eresrs户厂由刀打）的金属蛋白酶进行了系统深入的研究。从中分离纯化到两个新的蛇毒金属蛋白酶：二型蛇毒金属蛋白酶Jerdonit认和三型蛇毒金属蛋白酶jerdohagin。采用又卫PCR的方法得到了两个cDNA。通过蛋白质胰蛋白酶水解的内肚测序分析，其中一条为编码Jerdo址tin的，cDNA。序列分析发现，另外一条是一个含有RTS短链去整合素cDNA序列，命名为jerdos七atin，并对其进行了表达和活性鉴定。，Jerdonitin是一个表观分子量为为kDa的单链蛋白。它的c砚认全长1578bP，由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成，说明它是二型蛇毒金属蛋白酶。但是与其它二型蛇毒金属蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白由金属蛋白酶和去整合素结构域组成。与其它二型相比，Jerdonitin"多了两个半肤氨酸的（CysZ19andCys238）分别位于间隔区和去整合素区，Cys219可能和后面去整合素区的自由半眺氨酸残基Cys238形成一对二硫键，这对二硫键可能阻止了在后翻译加工过程中去整合素区的释放。通过Jerdonitin和其它二型蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列比较和进化分析，结合天然蛋白结构数据，说明Jerdonitin是二型蛇毒金属蛋白酶的一个新亚型。和其它蛇毒金属蛋白酶一样，Jerdon九in是a一纤溶酶，并且它的活性都能被金属鳌合剂EDTA完全抑制，而不受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF影响。像其独特的结构一样，Jerdonitin不仅具有纤维蛋白原降解的蛇毒金属蛋白酶活性，而且也有抑制ADP诱导的血小板聚集的非酶活性。Jerdohagin是一个表观分子量为96kDa单链蛋白。测定其内肤发现它有金属蛋白酶、去整合素样和富含半耽氨酸区组成，说明jerdohagig是三型蛇毒金属蛋白酶。像其它典型的蛇毒金属蛋白酶一样，jerdohagin的出血活性能完全被EDTA抑制，而不受R涯SF的影响。Jerdohagin是仪纤溶酶专一酶切人纤维蛋白原的。链。用氧化的胰岛素B链作底物，它可以水解仰r16一Leu17肤键。有趣的是，jerdohagin不激活人凝血酶原，但是它酶切人凝血酶原和凝血酶原激活后产生的激活片段F1。Jerdostotin的cDNA全长邹3bp，由信号肚、前肤和去整合素三个区组成，其与。btustotin和vieris七atin有较高的相似性（80％）。jerdostatin的序列是第一个报道的短链去整合素的cD以序列，它的产生机制和aCostatin一a有相似之处。值得注意的是，jerdostatin和obtus七atin八ipris，tatin不同的氨基酸残基（8／9）主要分布在含有整合素识别区的C末端。采用硫氧还蛋·白作为融合蛋白表达jerdostatin：，表达纯化后发现有两个j．erdostatin表达，，命名为：jerdo就。tin一1和'rjerdostotin一2。质谱分析显示它们的八个半肤氨酸都参与形成了四对二硫键，它俩可能是分别含有天然和非天然二硫键结构的多肚。但是jerdostatin一1的活性比rjerdostat还一2高两个数量级。和含有KTS的去整合素一样，重组jerdos七atin的异构体都选择性抑制整合素。lpl结合胶原IV，rjerdost就in一1的抑制活性分别是。b加stotin和viperistotill的1／1时和1／2500。氨基酸残基的组成不同尽管没有影响jerdost就in对整合素alpl的抑制选择性，但是它造成的化学环境不同可能导致抑制活性的差异。

圆斑蝰蛇毒磷脂酶A_2蛋白活性表现和分子进化探讨及菜花烙铁头、烙铁头蛇毒中Jerdonase、TmF的研究

磷脂酶AZ（PLA2）是蛇毒中含量较为丰富的一类作用于梭酷键的酶。迄今为止，己有多种形式的PLA2从不同地域、不同种属的蛇毒中得以纯化并进行了较为系统的研究。其中，以VipoXin为代表的异二聚体形式PLA2较为引人注目，原因在于这种形式不同于此类蛋白家族中的诸多其它个体。目前，己经有许多关于此异二聚体PL凡生物学特性的报道，包括对此类形式存在原因、活性变化、结构表现、系统进化等方面的讨论。然而至今，这种以异二聚体形式存在的PLA2仅发现于几种蛙亚科（ViperinaeSubfamily）蛇种的蛇毒中，其中就包括我国台湾岛的圆斑蜂蛇台湾亚种（Doboiarusselliiformosensis），而蝮亚科（CrotaiinaeSubfamil）蛇种的蛇毒至今却没有此类报道。我国大陆西南端接壤东南亚，存在于云南、福建一带的圆斑蛙蛇隶属圆斑蛙蛇泰国亚种（Daboiarusselliisiamensis），那么这种蛇毒中是否也含有异二聚体形式的PLA2呢？本工作就此疑问对云南产圆斑蛙蛇泰国亚种（D.r.siamensis）蛇毒中的PLA2进行了研究，结果得到三个新的PLAZ，分别命名为DRS-PLA2-I、DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III。其中，DRS-PLA2-I的分子量为13864.06Da，理论pI为4.56，PLA2活性为12.35μmol/mg/min；DRS-PLA2-II的分子量为13635.99Da，理论pI为8.74，PLA2活性为8.76μmol／mg/min；DRS-PLA2-III的分子量为13619.80Da，理论厂为4.61，无PLA2活性。这三个蛋白酶N端的30个氨基酸残基恰好和三个阳性克隆的cDNA序列推导的蛋白序列吻合，结合已经报道的PLA2蛋白家族蛋白序列的保守性表现，我们可以断定它们之间存在对应关系。分子系统学分析表明DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III在进化关系上和蛙亚科的异二聚体PLA2关系较近，并且二者酶活性分别与异二聚体PLA2的Normalchain和Inhibitorchain相一致，只是没有发现类似Vipoxin形式的异二聚体结合蛋白。这些分析表明DRS-PLA2-nORS-PLA2-III类似圆斑蛙蛇台湾亚种（D.r.forlnos翻s沽）中的PV-4/RV-7，是PLA2异二聚体的一种特殊形式，在进化上滞后于VinOXin。另夕卜本工作还相继从云南产菜花烙铁头（Trimeresrusjerdonii）蛇毒和湖南产烙铁头（Trimeresurusmucrosquamatus）蛇毒中分离得到Jerdonase和TmF。前者为一个丝氨酸蛋白酶性质的、具有纤维蛋白原水解作用和激肤释放酶原水解作用双重活性表现的、高分子量的份五brinogenase，其活性表现可以被PMSF彻底抑制，而EDTA对此却没有影响。其它的几种抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂、l-cysteine、DTT对Jerdonase的活性表现也有不同程度的影响。在Jerdonase的这些生化特性上中，分子量的大小和对纤维蛋白酶水解的特性这两方面有别于蛇毒中诸多其它来源的同类蛋白；后者T淤为一个舒缓激肚增强肤（BradykninPQtentiatingPePtide，BPP），电离质谱分析表明其分子量为1110.7Da。此小肚氨基酸序列为促进舒缓激肚（Bradki垃n，BK）诱导的豚鼠回肠纵行肌收缩的活力单位为（1.13±0.3）（m留L），T妊抑制血管紧张素转化酶（ACE）对BK水解的半数抑制剂量IC50为2μg。比较已报道的从Agkistrodon属和Bothrops属中纯化得到的BPP氨基酸序列发现：BPP的N端都是特征性的pGlu，C端为IIe-Pro-Pro，有高度的保守性。另外，TmF是Trimeresurus属中此类小肤的首次纯化。总之，本研究对国产的几种常见蛇毒中的几种常见蛋白多肤进行了一定程度的探讨和分析，和相同类别的其它蛋白、多肤比较可以看到，有许多相同的地方，也有许多不同的表现，研究结果为相应领域的深入研究提供资料和思路。

五步蛇出血毒结构和功能的研究

通过Sephadex-G-100分子筛层析，QAE-Sephadex-A-50阴离子交换层析和两次Poly-buffer-exchanger离子交换层析，分得两个出血毒蛋白，分别称之为HF-1和HF-2。通过碱性PAGE，等电聚焦（IEF），SDS-PAGE和线性密度梯度PAGE，证实两出血蛋白为电泳均一。它们均为三聚体蛋白，分别含有三个相同亚基。HF-1含3 x 113个氨基酸位点，而HF-2含3 x 104个氨基酸位点。EDTA可抑制两者的活性，而碘代乙酸部份抑制HF-2的活性而不抑制HF-1的活性。从氨基酸组成分析发现，HF-1不含有Cys，而HF-1的激光喇曼光谱也没有Cys的特征峰，这在出血毒中是少见的。HF-1和HF-2均属#alpha#－纤溶酶类，同时兼有出血活性和蛋白水解酶活性。还实验了出血HF-2对血小板聚焦的抑制活性，证实HF-2抑制血小板聚集依赖于其对血浆纤原的降解。

湖南尖吻蝮(D. acutus)蛇毒出血毒素的纯化、性质和溶液构象研究

通过Sephadex G-75凝胶过滤，QAE-Sephadex A-50和CM_Sephadex C-25离子交换的步骤，我们从湖南产尖吻蝮(Dienagkistrodon acutus)蛇毒中纯化出两个出血毒素，分别称之为DaHT-1和DaHT-2。在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中均呈单一蛋白带，显示两个出血毒素皆为电泳纯。DaHT-1和DaHT-2的分子量相同，都为23,500道尔顿，具有相似的氨基酸组成，其中酸性氨基酸(Asx和GLx)分别占23%和24%。经等电聚焦(IEF)测得它们的等电点分别为5.6和5.2。两个出血毒素具有较强的出血活性(MHD分别为0.5和0.8μg)，都具蛋白水解酶活力，无精氨酸水解酶和PLA~2活性，但蛋白水解酶活性与出血活性并非正相关。DaHT-1，DaHT-2的最适温度分别为35 ℃，40 ℃；最适pH为6-9。对热不稳定，温度变高于60 ℃，活性完全丧失。在中性和碱性条件下稳定，在酸性条件下不稳定，pH<3，出血活性丧失。EDTA完全抑制，半胱氨酸部分抑制它们的出血活性，表明两个出血毒素都是依赖金属离子的蛋白酶，且二硫键对其活性是必需的。金属离子的分析表明每摩尔毒蛋白大约含0.5摩尔的Zn，1摩尔的Ca，较多的Na，K。Mg，不含Co。两者是糖蛋白，含糖总量分别为11%和7%。用远紫外CD谱探讨DaHT-1和DaHT-2的溶液构象所得DaHT-1的α-螺旋，β-折叠和无规卷曲分别为36.9%，27.6%和31.4%；DaHT-2的α-螺旋，β-折迭和无规卷曲分别为23.4%，37.3%和45.3%。随着pH的增大或减少，DaHT-1和DaHT-2的峰位蓝移，在酸性条件下的变化比在碱性条件下大，计算表明：α-螺旋减少，无规卷曲增多，β-折迭基本未变。温度的影响和pH相似，50 ℃时峰位蓝移，α-螺旋减少，无规卷曲增多。EDTA对其影响很大，0.02M EDTA便导致两个出血毒素呈极度的无序状态。