眼镜王蛇蛇毒金属蛋白酶的分离鉴定和分子克隆

蛇毒金属蛋白酶(SVMPs)被认为是出血性蛇毒中的重要成分，是一个包括多种类 型成员的家族，它们在结构上表现出较大的多样性，有的蛇毒金属蛋白酶除了含有酶结 构以外在羧基端还添加了更多的结构，如：去整合素样结构域、富含半胱氨酸结构域、 外源凝集素结构域，这种结构多样性导致了蛇毒金属蛋白酶生物活性上的多样性。眼镜 蛇科中的蛇毒主要以神经毒为主，对其金属蛋白酶成分的研究比较少，本文以眼镜王蛇 蛇毒中的金属蛋白酶为研究对象，探讨了它的生物活性、结构特点,为我们深入了解蛇 毒金属蛋白酶结构与功能的关系提供了新的研究信息。 首先，通过分子筛凝胶过滤、阴离子交换和肝素亲合层析，我们从梧州产眼镜王 蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒中纯化到一个表观分子量为55,000Da 的单链蛋白，测定 了其N 端序列为SQKKDFLEEKKYLELYIVADYVMFR，与其它蛇毒金属蛋白酶的N 端 序列相似性较高，命名为Ohagin。接下来我们研究了该蛋白对纤维蛋白原的作用，发 现Ohagin 能专一性地降解人源纤维蛋白原的α-链，其降解活性能被EDTA 完全抑制， 但不被PMSF 所抑制，说明该蛋白酶为金属蛋白酶。Ohagin 能抑制TMVA 诱导的血小 板聚集，并且这种抑制效应是剂量依赖性的。我们通过cDNA 克隆、蛋白质测序和肽 指纹图谱方法确定了Ohagin 的蛋白质序列，Ohagin 的cDNA 序列编码一个611 氨基酸 长度的开放阅读框，包括信号肽、前肽和成熟蛋白所含有的金属蛋白酶结构域、去整合 素样结构域以及富含半胱氨酸结构域，根据这一结构特点，把Ohagin 归为P-III 型蛇毒 金属蛋白酶。将Ohagin 蛋白质序列与P-Ⅲ型蛇毒金属蛋白酶家族中有代表性的22 种 毒素蛋白序列进行比对和进化树分析后发现Ohagin 与P-Ⅲa 型、P-Ⅲb 型和P-Ⅲc 型 的蛇毒金属蛋白酶的亲缘关系较远，而与眼镜蛇科已知的几种金属蛋白酶亲缘关系较 近，推测它们的生物活性也类似，有可能属于新的P-III 型蛇毒金属蛋白酶亚家族。