水生植物凤眼莲的种内基因型差异与入侵模式

原产于亚马逊河流域的水生植物凤眼莲（Eichhornia crassipes）在花部结构上有三种花型（L、M和S），故其配殖系统（mating system）为典型的三型花柱（tristyly）。但在入侵地区，它却常只有M和L两种花型，其中尤以M型占据绝对优势，使有性繁殖水平大为下降。为了解释凤眼莲在入侵过程中，花型频率为何发生变化以及该变化对其在入侵地的适应性进化上有何影响，作者在中国西南的两个居群中连续两年开展了野外生长和人工授粉实验，对比分析水面和泥地两类不同生境中M和L在克隆生长、生物量积累以及有性繁殖水平等方面的异同，并利用RAPD、 ISSR片段比较了具M型和L型花植物个体间的遗传变异水平。对三型花柱这一长期引人注目的遗传模式的分子位点也尝试了连锁片段的克隆和测序。 克隆生长的对比实验发现，在2004年，漂浮生长的M个体平均克隆分株数为25.37，L为21.20，前者显示较强的克隆生长能力（t＝2.252， P< 0.05）;2005年的实验再次证实M（每个个体19.83个分株）比L（每个个体15.53分株）表现出了显著较强的克隆优势（t＝2.631，P<0.001）。M较L多产生克隆约24%。 但在岸边泥地上固着生长时，2004年L个体平均克隆分株为16.20，M 为10.17个分株。L表现出了更强的克隆生长能力（t＝4.788，p<0.001），与漂浮生长状况下的情形恰恰相反，暗示M与L个体可能存在一定的生态位分化。这种分化可能是在入侵过程中形成的，也可能反映了原产地亚马孙流域旱涝交替造成的固着生长与漂浮生长交替发生的种内适应性。 生物量（干重）的对比分析发现，M个体在漂浮生长和固着生长的情况下都比L有着更高的生物量积累（漂浮生长实验：t＝6.173，p<0.005（2004年）;t＝6.99，p<0.001（2005年）。固着生长实验：t＝4.029，p<0.001）。生物量对凤眼莲的竞争和过冬有着一定的作用，因此较大的生物量积累可能是M个体在当地气候和环境中逐渐适应的一个结果。 有性繁殖的实验包括了实验个体的花序数与花朵数、自交与异交人工授粉的结实情况以及种子萌发率等方面的对比分析。结果表明，虽然M和L个体在花序数和花朵数上不存在显著差异，但是M个体在自交和异交的种子产量上比L略高，尤其是自交的种子产量，M显著高于L（M平均每个蒴果的自交种子产量为139.8，L为76.2）。以各100粒种子进行萌发实验，发现两花型之间在种子萌发率上不存在显著差异。对于M而言，其自交种子产量远大于异交种子产量 （139.8 vs. 93.3），且种子萌发率也略大于异交的种子萌发率（自交种子萌发率45.47％，异交种子萌发率 30.73％）。结合以上的实验结果，本文认为M基因型优势的形成可能与M个体与当地环境长期适应导致的生长与繁殖 上的优势有关。M的本地适应性是建立在特定的遗传背景上时，异交反而会破坏这种遗传组合，造成远交衰退。 对40个M和30个L个体进行20个RAPD引物和20个ISSR引物的遗传分析时发现，所有个体在RAPD表型上没有区别，但是在M中出现了3个ISSR表型，在L中出现了2个ISSR表型。本文还尝试利用RAPD技术扫描与三型花柱的遗传位点连锁的DNA片段。在146个RAPD随机引物中，初步发现两个候选片段，一个750bp，另一个2 000bp;已对它们进行了克隆、测序。 这些初步实验表明凤眼莲在我国的入侵可能伴随着基因型的差异表现和居群遗传分化，这种基因型的差异表现对该植物的成功入侵具有作用。其中，花型为M的个体的优势生长解释了该花型在中国分布区内的主导地位。推测该生长优势的遗传基础可能来源于基因组内较高的杂合子水平和在入侵地较长的适应历史，但最终结论尚有待进一步的实验证据。

芹菜人工种子的初步研究

本研究建立了芹菜的悬浮培养系统。包括愈伤组织的诱导培养物的过滤及胚胎发生的诱导。此外还进行了胚状体的包裹以制造人工种子的实验。主要结果如下:①诱导芹菜的愈伤组织建立无性系以下胚轴为外植体效果最好，并且激素只用1m g/L的2.4-P即可。②对悬浮培养物用筛网过滤后继续培养可大幅度提高分生细胞(团)在总细胞中的比例，并使胚胎发生同步性提高③继代时间长短和温度对于球形胚的继续发育起重要作用。④用藻酸钙包裹胚状体或得的人工种子在培养基上以75%的频率长成植株。⑥碳源对于胚状体的萌发起重要作用。

水飞蓟原生质体培养形成愈伤组织及组织培养再生植株

本论文对药用植物水飞蓟Silybum marianum Gaertn 进行了原生质体培养和组织培养的研究，获得如下结果： 1、以水飞蓟叶片愈伤组织为材料，系统地研究了植物材料生理状态，酶液配比及酶的浓度、酶解时间长短等对原生质体产率的影响。探讨了原生质体培养过程中材料的生理状态、激素、附加物及培养方法对于原生质体分裂频率的影响，还比较分析了培养后期不加液及加各种细胞培养液对原生质体来源的细胞团的影响，最后进行了愈伤组织分化的诱导。选取继代一年的水飞蓟叶愈伤组织转代十天后挑选愈伤组织表面生长旺盛的细胞层置于Onozuka R-103% Macerozyme R-10 0.8%的CPW混合酶液（PH 5.6～5.3）中，30℃下酶解5小时后所得原生质体产率最高。适合于水飞蓟原生质体培养的基本培养基为TCCW烟草原生质体培养基~[18]。用低融点琼脂糖（0.3%）平板培养法培养得到的分裂频率显著高于液体浅层法。在培养基中加入羟脯氨酸（100mg/l）和谷氨酰胺（200mg/l）可促进原生质体分裂。在飞蓟原生质体培养中能获得最高分裂频率（35.4%）的激素组合为2.4-D、1mg/l Kn0.5mg/l。在培养过程中每隔二周必须加液，否则细胞团褐化并全部死亡，同时要求降低细胞培养液的Kn浓度（由0.5mg/l、降到0.1mg/l）才能使细胞团继续长大。从水飞蓟原生质体培养得到的愈伤组织色浅黄，结构疏松，转至MS附加NAA0.8mg/l、6－BA 2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上愈伤组织表面出现许多绿色芽点，但尚未得到再生植株。 2、以萌发两周后的水飞蓟种子无菌苗为材料，切取下胚轴于MS附加NAA0.8mg/l、6－BA0.5mg/l、水解酪蛋白200mg/l的固体培养基上诱导出愈伤组织，再转入MS附加NAA0.8mg/l、6－BA2mg/l、水解酪蛋白200mg/l的分化培养基后，愈伤组织表面分化出芽，再生苗的频率为75%，然后移至MS附加NAA0.5mg/l、IBA0.1mg/l、水解酪蛋白200mg/l的培养基上分化出大量的根，并得到了大量健壮的植株。

野大豆贮藏蛋白的基因的克隆及早期发育的基因表达的研究

豆科植物是动物获取植物蛋白的主要来源之一。豆类种子储藏蛋白作为一种多基因家族的产物专一性地积累于种子的发育过程。植物遗传工程需要深入地了解基因的特异性表达及调控。种子储藏蛋白基因为这类研究提供了一个理想的研究系统。在我国生长着大量的野生豆科资源，许多优良性状被期望应用于将来的植物遗传工程研究．本文选择了一种富含种子储藏蛋白高达50%的野生大豆品种Glycine soja 79-34作为材料进行了以下的研究： 1、大豆7s储藏蛋白基因同源片段的克隆。 以原生质体作为初始材料游离大片段染色体DNA，原生质体经低渗处理而破裂，方法简便，得到的DNA分子量大且重复率高。大片段染色体DNA经EcoRI酶切后，用32P标记的大豆a'-亚基基因作为探针进行分子杂交，得同源片段的杂交带。其中分子量大约为6.3kb的同源片段被克隆到Puc9质粒中，通过x-gal/IPTG培养基及原位杂交初步筛选出5个克隆。进一步的Sourthern分子杂交确认了一个克隆包含7s储藏蛋白a'-亚基基因的同源片段。其详细的序列分析尚需进一步进行。 2、种子储藏蛋白基因在体细胞胚胎发生中的表达。 以授粉20天左右的幼胚作为外植体，在含有2mg/l 2,4,5-T的B5液体培养基中直接诱导愈伤组织，一个月内得到了均一的野生大豆悬浮培养体系。悬浮培养细胞转至含有0.5mg／l萘乙酸，O.1mg／l 2,4-D，0.5mg／l BA，0.5mg/l玉米素的B5液体培养基中，得到了处于不同发育阶段的体细胞胚。分别从体细胞胚及悬浮培养细胞中提取总RNA，以种子储藏蛋白基因为探针，RNA斑点杂交首先证明种子储藏蛋白基因在体细胞胚中转录水平上的表达，而在末分化的悬浮培养细胞中则检测不到．从处于不同发育时期（球形胚，心形胚，鱼雷形胚及带有分化子叶的胚）的体细胞中分别提取盐溶蛋白，用大豆储藏蛋白的兔抗血清做Western blotting分析，发现最早在球形胚中即能检测到种子储藏蛋白的积累，大大早于合子胚发育过程中种子储藏蛋白积累的时期．随着体细胞的发育，储藏蛋白的积累略有增加，但总体水平上不如合子胚发育中的明显。本研究从几个方面探讨了种子储藏蛋白基因在体细胞胚及合子胚发育过程中表达的相似性及差异，并对其产生差异的原因作出了推测。 3、果蝇同源转化基因在植物基因组中的检测及表达的探讨。 果蝇同源转化基因(Homeotic gene)被认为是早期胚胎发育过程中形态发生的开关基因。在动物界中已有80多个同源序列从不同进化水平的动物中分离出来，是一个非常保守而与发育密切相关的基因。本研究以果蝇同源转化基因为探针，分别在野生大豆及土豆的基因组中都检测到了该基因同源序列的存在。用野生大豆染色体DNA的多种内切酶片段做分子杂交分析发现至少有一个拷贝的基因同源性非常高。进一步关于该基因表达的研究发现，在未成熟胚及浸泡过夜的种子中都能检测到该基因的表达，但在休眠种子，萌发5天以上的种子及成熟叶片中未能检测到。该基因的表达只局限于早期发育，因而推测其功能有与动物界中的一般性。

玉米原生质体培养、超低温保存和组织培养的研究

本文叙述了两个玉米基因型（小八趟×水白和白17）原生质体培养的植株再生;用基因型（小八趟×水白）为材料研究影响玉米原生质体培养的各种因素，并此基因型的原生质体经超低温保存后获得植株再生;以及用多种基因型玉米幼胚为材料诱导愈伤组织与植株再生。 影响玉米原生质体游离、分裂与植株再生的因素是多方面的。酶液组合0.2% Onozuka RS + 1% Hemicellulase + 0.1% Pectolyase，利用继代8-16天的愈伤组织，所获原生质体的数量与质量最佳。在原生质体植板率方面，结果表明：N6作为基本培养基是理想的;氮源中，NO3-具有明显的促进作用，而NH4+具有明显的抑制作用;有机氮源是不能缺少的，所使用的四种有机氮源中L-脯氨酸效果最明显。2,4-D浓度以1.0 mg/l最佳。原生质体培养后的渗透压浓度降低的时间以培养四星期后为宜。利用三步诱导，成功地获得胚胎发生的植株再生，并且还指出原生质体起始材料的保存年限大大影响原生质体所再生愈伤组织的分化。 采用上述筛选出的最佳游离、培养以及植株再生的方法，成功地培养了基因型（白17）的原生质体，并获得植株再生。原生质体再生细胞培养4-5天后开始一次分裂;培养15天后，植板率为3-4%。一个月后，原生质体所再生的肉眼可见的愈伤组织，分步转至分化培养基。最后，愈伤组织通过胚胎发生获得植株再生，频率约10%。 玉米原生质体，利用5%DMSO与0.55 M葡萄糖作为混合保护剂，经慢速（1 ℃/分钟）降至－40 ℃，停留二小时后直接投入液氮保存。保存3天后，原生质体在40 ℃的温水浴中快速化冻，成活率高达30-40%。成活原生质体培养后生长正常，植板率高达8-10%。培养5-6星期后，再生愈伤组织转至分化培养基;最后获得植株再生，频率为5-10%。 本文最后叙述了玉米七种基因型的幼胚诱导获得愈伤组织，再生植株频率可达70-80%。 上述各方面的研究结果，对玉米的遗传操作和细胞抗寒性研究、生理代谢的研究等都是十分有价值的。

玉兰花粉个体发育及绒毡层动态

苏联植物学家A．L．塔赫他间在<有花植物（木兰植物）分类大纲>(Ta-khtaian，1980)中认为广义的木兰目是最原始的和最古老的类群，由它产生被子植物所有其它主要分枝。根据这个观点，作者试图以木兰科玉兰(Magnol iadenudata Desr.)，花粉个体发育为主题，探讨它们的原始性状、特点及其在系统发育上的地位。 下面就其花粉个体发育顺序，扼要概括如下： 1．小孢子母细胞、减数分裂到四分体时期：细胞器发生重组，质体和线粒体发生脱分化与再分他的循环。在此期间，细胞中还有大量胞质小泡，高尔基体小泡参与胼胝质壁物质的形成，其他小泡与脂体物质的沉积有关。晚二分体时期，原外壁物质开始沉积，胞质小泡可能涉及原外壁的形成和未来萌发孔的位置。 2．游离小孢子时期：细胞器变得丰富而活跃，特别是粗糙内质网大量出现，它们与脂体的形成和运输有关。此时，外壁外层已形成，外壁内层和内壁开始发育。 3．两细胞花粉时期;质体出现极性分布，生殖细胞中不含质体。生殖细胞随着位置的推移，其形状和壁的结构、性质也发生变化，生殖细胞由凸透镜形变成球形以至梭形。同时，生殖细胞壁最初含纤维素和胼胝质物质，以后壁物质逐渐消失，当生殖细胞变为梭形时，在生殖细胞壁的双层膜间又出现亲锇物质沉积。有趣的是，在生殖细胞星球形时，营养细胞中的脂体紧挨并围绕生殖细胞，形成一层明显的脂体冠。 玉兰成熟花粉为远极单槽，营养细胞中造粉体里园球形，内部充满大量均匀小淀粉颗粒，生殖细胞形状特殊，在有丝分裂前两极具明显的细胞质延伸和突起。从花粉个体发育着，玉兰花粉壁带有若干裸子植物性状和原始特征。最重要的特点表现在：①外壁内层具片层状结构;②I柱：状层虽具稀疏小柱，但在孢壁分沁过程中，”在小柱之问还有大小不同的孢粉素颗粒;③在萌发孔处，外壁外层往往扩张、外折，形似穗花杉和香榧的残余气囊。玉兰花粉的内壁特殊，由内壁-l、内壁-2和内壁-3等三层形状和质地不同的结构组成。值得注意的是百合科的麝香百合内壁也呈明显不同的三层结构。 玉兰绒毡层为多层细胞，属分泌型。绒毡层细胞中细胞器很丰富，减数分裂期问达到高峰。细胞核明显地被质体和线粒体所包围。粗糙内质网常与膳体连在一起。四分体时期，原乌氏体排出，孢粉素在其上沉积。推测原乌氏体和孢粉素前体物质的形成与粗糙内质网活动和膳体形成有关，乌氏体有单个存在，也有以聚乌氏体或复合乌氏体形式出现。周绒毡层膜在二分体时期即开始形成，最初呈间断的薄膜小片，以后连续发育成膜。周绒毡层膜位于靠药壁细胞的绒毡层细胞四周及中层绒毡层细胞外切向面，而靠药室腔的绒毡层细胞则未见此膜。 总之，玉兰的生殖细胞特殊，附带脂体冠;后期呈梭形，两极具明显的胞质延伸和突起，不含质体。孢壁结构具明显原始性状，在某种意义上，一方面类似裸子植物，另一方面又有百合科的特点。绒毡层结构也有一些值得深入探讨的问题。

硬粒小麦（Triticum durum Desf.）单倍体诱导新技术单倍体原生质体植株的再生

硬粒小麦DR147授以超甜玉米(ss7700)的花粉后，83.4%的小麦柱头上的玉米花粉萌发，花粉管经由花柱抵达胚囊，受精率和成胚率分别为44.4%和42.6%。杂种合子核型高度不稳定，在细胞分裂过程中来自父本玉米的染色体逐渐被排除，最后形成硬粒小麦单倍体胚。尽管硬粒小麦×玉米存在较高频率的双受精(32.7%)，同时形成胚和胚乳，但由于胚乳发育异常及败育，最后难以获得有生活力的种子。 硬粒小麦授以玉米的花粉后用100ppm 2，4-D进行处理（浸蘸穗子或向穗茎节间注射），可以延长杂种胚在植株上的存活时间。授粉9-13天后将颖果表面灭菌后在实体显微镜下剥取不同发育时期的幼胚，分别接种于含或不含2.0mg／l2，4-D，3%蔗糖，200mg／l水解酪蛋白，146mgl谷氨酰氨，300mg／l天冬氨酸的MS固体培养基上进行胚拯救或诱导愈伤组织。结果表明，发育程度较高的胚（具盾片的胚，长度大于0.5mm）容易通过胚拯救获得单倍体植株或诱导出愈伤组织，而发育程序较低的胚（琏形胚，梨形胚，鱼雷形胚，长度小于0.3mm）不易获得单倍体植株或诱导愈伤组织而常常变褐，最后死亡。如果将这些胚预先接种子含0.1mg／l BAP，3%蔗糖，200mg/l水解酪蛋白，146mg/l谷氨酰胺，300mg/l天冬氮酸的MS固体培养基上预培养20天，再转移至愈伤组织诱导培养基上则易于产生愈伤组织，通过选择和继代培养可以获得淡黄色，结构致密的胚性愈伤组织。将这种愈伤组织转移至含1.Omg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS固体分化培养基上培养20天后即可分化出小植株和绿色芽点，将这些小植株和绿色芽点再在分化培养基上继代培养20天，形成大量根系发达的健壮植株及次生小植株。其中一个胚性愈伤组织系的分化频率高达70. 6%。从获得的100余棵植株中随机取6棵再生植株进行根尖细胞染色体计数发现它们均为单倍体。具发达根系的健壮植株移入实验田后成活率可达80％以上，并生长至成熟。 利用硬粒小麦×玉米建立的单倍性胚性愈伤组织系进行了原生质体培养的研究。胚性愈伤组织经液体悬浮培养4个月后形成了生长迅速的由大小不同(0.5mm至5mm)的愈伤组织块组成的混合悬浮愈伤组织系，酶解试验表明2.0%纤维素酶RS和0.5%离析酶Y-23组合效果最好，而液体悬浮培养物和固体培养的愈伤组织（在酶解时用锋利的解剖刀片切成1mm左右的块）都能释放出大量原生质体，但悬浮培养物释放出的原生质体状态较好，胞质更浓厚，用KM8p培养基以琼脂糖包埋培养方式培养时得到了较高的（5%左右）分裂频率。 原生质体再生的小愈伤组织经增殖、筛选后可获得胚性愈性组织，将其转移至分化培养基Ⅰ（0.2mg/l 2，4-D，1.0mg/l BAP，0.1mg/l NAA，3%蔗糖，200mg/l水解酩蛋白，146mg／l谷氨酸胺，300m8/l天冬氨酸的MS固体培养基）和Ⅱ（不含2，4-D，其它成份同I）上进行分步分化培养可再生出完整植株，分化频率约为20%。从获得的22棵原生质体再生植株中，随机取4株进行根尖细胞染色体计数表明，它们均为单倍体。

植物结构专题研究

1． 裸子植物次生韧皮部中晶体的分布类型及其意义 应用偏光镜检术和扫描电境一一能谱分析等手段对1 1科30种裸子植物次生韧皮部中晶体的形状、大小、分布类型和化学成分进行了系统研究。结果发现，所有的观察种类都具有晶体，钙是晶体的主要成分。在苏铁科、银杏科和松科，晶体存在于韧皮薄壁组织细胞的胞腔中：在其他各科，晶体则主要存在于韧皮细胞的胞壁上;通常胞腔中的晶体通常比胞壁上的大．苏铁科、银杏科和松科的晶体形状分别足棱形晶体、晶簇和柱状晶体或方形晶体．其他各科的晶体形状均为沙晶，但分布的部位各不相同。在杉科、柏科、和罗汉松科的韧皮部中，品体主要嵌埋在各类细胞的径向壁上：在三尖杉科的韧皮部，晶体主要存在于部分薄壁组织细胞的弦向壁上：在红豆杉科（澳洲红豆杉属除外），晶体嵌埋在韧皮纤维的外侧壁上;在麻黄科、买麻藤科，晶体主要存在于薄壁细胞间的胞间隙中，偶尔也在薄壁组织细胞的内侧，但在裸子植物的韧皮部，未见典型的针晶。根据晶体的上述变化，将晶体分布类型分成棱形晶体在薄壁组织细胞腔内、簇晶在溥壁组织细胞腔内、柱形晶体在薄壁组织细胞腔内、沙品在韧皮细胞壁上、沙品在韧皮纤维壁上和沙晶在韧皮薄壁组织细胞间的胞间隙内等六大类型，并依此讨论了它们在裸予植物各类群中的分类意义． 在红豆杉科中，晶体仪存在于厚壁组织细胞类的韧皮纤维上。根据该五属韧皮纤维．L晶体的比较观察，发现红豆杉属、白豆杉属的韧皮纤维具六角形和方形两种晶体，穗花杉属和榧树属仅具方形一种晶体，澳洲红豆杉属不具晶体．从晶体的有无和晶体的类型，讨论了它们在红豆杉科各属间的分类意义． 2． 长苞铁杉的结构及其系统发育的研究 长苞铁杉足我国特有的珍稀濒危植物。自发现以来，其分类位置曾几度变迁．1931年，郑万钧将其归属于铁杉属。1948年，Gaussen ＆van Campo-Duplan认为它是云南油杉和铁杉的杂交种，主张建立铁油杉属(Ts uga -Keteleeria). 1951年，胡先驌认为长苞铁杉与其他铁杉区别明显，提出建立新属- Nothotsuga. 1957年，喻诚鸿根据木材解剖的结果，认为长苞铁杉木质部缺乏正常树脂道，与铁杉属没有本质上的区别，建议将它归人铁杉属．<<中国植物志>>第七卷设长苞铁杉组(Sect. Heopeuce)，与铁杉组(Sect. Tsuga)平行，同归于铁杉属。 本课题对长苞铁杉营养器官的结构做了研究，发现长苞铁杉成熟部位的次生木质部具正常树脂道，创伤树脂道除切向连续分布外还有单个独生的现象，早晚材过渡不明显，射线管胞不发达，交叉场纹孔以杉木型为主，韧皮部中具树脂腔(Resin caviLy)。叶片气孔雨面生，维管束鞘明显，细胞大小均匀，树脂道1个边生。 上述特征都与铁杉属存在明显区别，因而作者支持胡先驌(1951)、Frankis(1989)、Faljon(1990)等关于建立长苞铁杉属的主张。 3． 白皮松的结构及其系统发育的研究 按<<中国植物志>>第七卷的分类系统，白皮松隶属单维管束亚属白皮松组，但其对分类位置曾有不同看法． 本课题通过白皮松营养体结构的研究，发现它在许多方面与单维管束亚属的其他种类有显著差异，白皮松针叶的气孔分布于背腹雨面，气孔间连结细胞的雨侧具石细胞，副卫细胞为近四方形且数目比较恒定，角质层内表面具深波浪状的胞间凸缘：次生木质部的射线管胞内壁具微锯齿状突起，交叉场纹孔松木型，管胞内表面及纹孔部分具明显的瘤层结构;树皮薄，其最外侧仅保留一层周皮，无内皮外皮之分，外侧的韧皮薄壁组织细胞与射线有明显的扩展与弯曲现象，韧皮薄壁组织细胞中的晶体有长柱形和短柱形雨种类型．依据上述结构特征结合前人从染色体、心边材抽提物化学成分析的研究结果，作者支持将白皮松从单维管束亚属中独立出来，成立白皮松亚属的主张。 4． C02浓度升高对植物生长的影响 大气中C02浓度的升高以及所引起的温室效应已成为了人们普遍关注的焦点。预计到21世纪下半叶，C02浓度将增加一倍(Gates，1983).由于C02是植物光合作用的重要原料， 它的变化将直接影响植物的生长和发育，进而引起生物圈乃至整个生态系统的变化。 本项目通过在人工气候室内增加C02浓度，观察大豆与黄麻的生长及其内部结构的影响。结果表明：在短期内，C02浓度升高对两种植物的生长有促进作用，对植物内部结构也有较明显的影响。其中包括种子的发芽率提高，幼苗生长加快，植株明显增高，叶面积增大，叶片加厚（栅栏组织层数增加），根系数量增多，气孔数量减少，茎干增粗、生长轮加宽，韧皮纤维和木纤维增长、大豆结实率增高。但C02浓度升高对两种植物的长期作用仍有待于进一步研究。 本项目还在进行之中。

菠菜硬脂酰ACP去饱和酶基因的克隆及其抗寒性转基因烟草的获得

低温是限制植物分布和生物产量的一个重要环境因子。低温的危害也是农业生产上经常遭受的主要自然灾害之一。改良作物的抗寒性是植物科学研究的一个重要课题。植物基因工程的兴起为此目的提供了有力的手段。 大量的研究证明，低温对植物的伤害，首先是使生物膜发生相变和相分离。因此，保持低温下生物膜功能性的液晶态是抗寒的重要机制。研究表明，生物膜这种具流动性的功能态的保持，是与其组成上的膜脂脂肪酸的不饱和度成正相关的。 已有几个关于通过提高膜脂脂肪酸不饱和度的基因操作而增加植物抗寒性的报道。在众多的植物脂肪酸去饱和酶中，硬脂酰ACP去饱和酶(SAD)是最为关键的酶之一。它催化脂肪酸的第一步去饱和反应：18：0-18：l¨。多不饱和脂肪酸是在1 8：1 中由其他去饱和酶再加入双键而生成的。因此，SAD的活性水平是决定植物膜脂不池和度的一个关键因素。 本研究以酸酚法提取的菠菜总RNA为材料，采用反转录一PCR的方法，克隆得到SAD基因，经定向缺失法获得一套该基因的缺失突变体后,用DNA 自动测序仪和双脱氧链终止法测序。获得的SAD基因序列与Nishlda(1992)等发表的菠菜sADcDNA核苷酸序列比较。两者的编码SAD的ORF都为ll97bp，核苷酸差异仅为8bp。但令人惊奇的是我们克隆到的基因，其5‘端上游还存在-个小的ORF，长30bp．编码10个氨基酸。其他报道的SAD基因中都没有这个ORF。 将克隆到的SAD基因构建成两个植物双元表达载体：正义的pB112-13和反义的pB112-6。用叶盘法转化烟草。DNA点杂交和Southern杂交筛选出转基因植株。抗寒性测定表明：当植株置于6'C40小时，转基因植株和对照的相对电导率比较一致，无明显改变;而在88小时，pB121-6转化植株和对照的相对电导率明显升高，以pB1121-6植株升高更多，但pB1121-13转化植株的相对电导率始终保持在较低水平。短暂冰冻处理（-20'C，4O分钟）后置室温下4天，pBl121-6转化烟草总叶绿素含量损失最多，对照次之，而pB1121-13转化烟草中多数植株总叶绿素损伤量都低于其他两种烟草。从这两个抗寒性测定实验，可判定pBl l 2 l—I 3烟株最抗寒，对照次之，而pB1121-6烟株最不抗寒。 由于pB1121-13是增强转基因烟草中SAD活性，而pB1121-6是削弱SAD基因的表达，因此．本研究首次证明通过SAD的基因工程可以改变植物的抗寒性。

火炬松体细胞无性系建立及其形态发生调控的研究

火炬松（Pinus taeda L.）原产美国东南部，是世界南方松中最重要的绿化和造林用速生针叶树种，现广泛分布于全球亚热带和部分热带地区，在我国的栽植面积居世界第2位，仅次于美国。目前，火炬松离体快速繁殖、遗传转化和品种改良研究中最大的障碍是没有获得良好的植株再生体系。本研究以火炬松的成熟种子为试材，建立了可调控的体细胞胚胎发生和器官发生植株再生系统，并对再生过程中的形态学变化进行了细胞学观察和扫描电镜观察;建立了胚性细胞悬浮系，测定了其重要生长参数的变化动态，优化了悬浮条件下体细胞胚胎发生的培养条件及悬浮细胞原生质体直接体细胞胚胎发生的培养条件。 进行了HA、HB、HC、MA、MB、MC、LA和LB等8种不同基因型的成熟合子胚在BMS、DCR、GD、LM、LP、MNCI、MS、SH及自行设计的TE等9种不同基本培养基上的愈伤组织诱导试验，筛选获得了愈伤组织发生频率较高的基因型HB、MA和MC，及基本培养基DCR和TE。激素组合试验表明，2,4-D和BA最有利于愈伤组织发生。两因子5水平等重复的愈伤组织诱导试验及方差分析结果证实，8 mg•L~(-1)2,4-D和4 mg•L~(-1)BA是愈伤组织诱导的最佳激素组合。诱导产生的愈伤组织经2次继代后，可明显分为4种类型，它们是1）白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织（WTGM）;2）淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织（YLGG）;3）淡绿色、疏松的颗粒状愈伤组织（GLG）;和4）浅白色、水浸状的粘性愈伤组织（WMM）。其中白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织有较强的体细胞胚胎发生能力，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织有较强的不定芽发生能力。这两种愈伤组织的最高诱导频率分别是28.1%和35.7%。 在附加2,4-D、IBA和BA的DCR体细胞胚诱导培养基上，白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织中的胚性细胞形成胚性胚柄细胞团和早期原胚。提高培养基中的渗透压后，早期原胚发育成后期原胚。在附加ABA、PEG和活性炭的DCR体细胞胚成熟培养基上，后期原胚发育成子叶胚。在无激素DCR培养基上，子叶胚萌发形成再生完整植株。体细胞胚转换成小植株的最高频率是18.4%。在直接体细胞胚诱导增养基和直接体细胞胚发育培养基的作用下，成熟合子胚的子叶和胚轴上直接形成体细胞胚。直接体细胞胚胎发生的最高频率是18%。 在附加NAA、IBA和BA的TE不定芽原基诱导培养基上，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织中的胚性细胞形成不定芽原基。在附加IBA和BA的TE不定芽分化培养基上，不定芽原基分化产生不定芽。用基因型HB、MA和MC的淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织进行的试验表明，不定芽分化的最佳低温（4 ℃）处理时间是5～6周，最佳蔗糖浓度是25～30 g•L~(-1)。分化产生的不定芽在附加IBA、GA_3和活性炭的TE培养基上，幼茎伸长。附加IBA、BA和GA_3的TE培养基上，伸长的不定芽生根形成完整植株。伸长不定芽的最高生根频率是46%。成熟合子胚在直接不定芽原基诱导培养基及直接不定芽分化培养基的作用下，从子叶和胚轴的不同部位产生直接不定芽。直接不定芽发生的最高频率是58.2%。 由成熟合子胚诱导愈伤组织形成过程中的形态学观察表明：在附加2,4-D和BA的DCR愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA主要在下胚轴形成愈伤组织，MC主要在子叶和胚根形成愈伤组织，HB主要在胚根形成体积较小的愈伤组织。在附加NAA和BA的TE愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA在单个子叶的顶端形成生长较快的愈伤组织，MC的所有子叶都形成愈伤组织，HB在所有子叶的顶端形成愈伤组织。 石蜡切片观察表明：4类愈伤组织的细胞组成不同．第1类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞及核呈柱状或新月形的体积较大的非胚性细胞组成;第2类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞组成，第3类愈伤组织主要由体积较大的棒状、葫芦形、新月形、盾片状细胞组成、第4类愈伤组织主要由体积较大的薄壁细胞和细胞壁加厚、细胞间连结紧密、无细胞核的分化细胞组成，第1类愈伤组织上形成的早期原胚的特点是：胚性头部由排列紧密、体积小的园形细胞组成，轮廓十分清晰、呈半圆形，胚柄由排列疏松的长形细胞组成，细胞体积大、细胞中有大的液泡，早期原胚在发育过程中和母体组织保持一定的隔离状态。第2类愈伤组织上形成的不定芽的特点是t结构上为单极性，其维管束和母体组织保持密切联系。扫描电镜观察表明;直接体细胞胚基部和母体组织保持较少的联系，其子叶是直立生长的．直接不定芽基部和母体组织保持较多的联系，其幼叶是向心卷曲生长的。 在培养周期内，基因型HB、MA和MC胚性细胞悬浮培养物的几个生长参数的变化动态相似。鲜重增长高峰在12—15 d，干重增长高峰在15～18 d，细胞体积增长高峰和胚数增长高峰在18—21 d。在培养的18—21 d，培养液中的pH值、电导率和蔗糖浓度接近或降到最低点。在悬浮培养条件下，体细胞胚形成的最佳起始细胞密度是5～6×103个／ml。继代培养时间延长，体细胞胚胎发生能力下降。热激处理促进基因型HB和MA体细胞胚的形成，抑制基因型MC体细胞胚的形成。在悬浮培养物中，观察到了裂生多胚。 对数生长期的火炬松胚性悬浮细胞，在以甘露醇作为渗透压稳定剂的酶混合液Cel-lulase“Onozuka”RS l%+Cellulase“Onozuka”R-10 2.5%+Pectolyase Y-23 0.2%的作用下，原生质体的产量和活力均最高。原生质体在DCR和KM8P两种培养基上形成了体细胞胚（包括胚性胚柄细胞团、早期原胚和后期原胚）．体细胞胚形成的最佳起始原生质体密度是7×l04个/ml，最佳ABA浓度是4 mg．L-I．

甘薯体细胞胚胎发生和原生质体培养及转化的研究

甘薯[Ipomoea batatm L.]胚性愈伤组织的诱导、生长及分化，受遗传背景、外植体来源、激素配比等多种因素的影响。以徐薯l8叶片为外植体，在Ms附加2mg／l2.4-D的培养基上，诱导、筛选出三种类型的愈伤组织（I型、Ⅱ型、IV型），虽然其来源和培养条件相同，但在外部形态、内部结构、分化途径、分化能力、同工酶酶谱、可溶性蛋白质组成以及DNA分子结构方面，都有显著差异。I型愈伤组织在Ms无激素培养基上分化出体细胞胚，其过氧化物酶及脂酶同工酶与Ⅱ型愈伤组织和lV型愈伤组织相比，酶带的数目、深浅不同，而与胚状体相类似，可以作为不回类型愈伤组织及其分化途径的生理指标。SDS-PAGE电泳分析表明：三种愈伤组织的总蛋白组成也有显著差异。I型愈伤组织与Ⅱ型愈伤组织相比，无论是酶带的数目，还是酶带的扫描高度，都占绝对优势，表明其具有相对较高的蛋白质合成代谢水平。RAPD分析表明，三种类型愈伤组织的遗传基础具有一定差异。在所用的10个随机引物中，引物G3(GAGCCCTCCA)扩增出了显著的多态性，在I型愈伤组织与胚状体中发现两个特异片段，有可能与体细胞胚胎发生过程特异相关。 以I型愈伤组织进行悬浮培养，建立了具有再生能力的胚性悬浮细胞系，并对其鲜重、干重、PCV体积、PH值等生长特性进行了测定，研究了在悬浮培养条件下，2.4-D浓度对体细胞胚胎发生的影响。在MS附加Img/12.4-D的培养基中，细胞呈园球型，细胞质浓厚，细胞核显著，分裂旺盛，转入不含2.4-D的分化培养基中，即可得到大量的游离胚状体：浓度过高（4-8mg／l）或过低（0.5mg/l），都不利于细胞的生长和分化。胞外同工酶研究发现：胞外过氧化物酶水平，随着2.4-D浓度升高、培养时间的延长、细胞生长速度的减缓而降低，随着体胚分化的开始而升高。这种变化趋势表明：2.4-D浓度、过氧化物酶及细胞的生长、分化之间，存在密切联系。蛋白质分析发现，2.4-D的浓度与细胞内可溶性蛋白质组成及含量也密切相关：在无激素培养基中的培养物，其蛋白质电泳图谱与在含有不同浓度2.4-D的培养基中的培养物相比，无论是谱带的数目还是谱带的峰值，都有深刻差异，表明在体胚分化和发育过程中，细胞内进行着旺盛的蛋白质合成代谢。 以胚性悬浮细胞为材料，进行原生质体培养。通过对游离条件的比较研究，发现采用PH值为6.0的E3酶液酶解2小时，可以得到大量具有旺盛活力的原生质体。采用液体浅层一固体平板双层培养方式进行培养，原生质体分裂旺盛，20天后形成肉眼可见的微型愈伤组织，在附加0.5mg/1 2.4-D的继代培养基中，出现根的分化，转入附加0.5mg/12.4-D和Img/16-BA的分化培养基中，有少量不定芽发生，并形成小苗，但无胚状体产生。 以来源于胚性悬浮细胞的原生质体为受体，通过与农杆菌共培养，将苏云金杆菌毒蛋白(Bt)基因导入甘薯细胞，经卡那霉素筛选，得到抗性愈伤组织，并有根的分化。经过PCR检测，证明了Bt基因在甘薯细胞染色体组中的整合。

青蒿的遗传转化及青蒿素生物合成的调控

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1601，1000，1500，15834，A4，均成功地转化了中药青蒿(Artemisia annua L.)并且建立了pRi1601，pRi15834，pRiA4诱导的发根培养。pRi1601，pRi15834的发根诱导率比其它质粒高。太老或太幼的叶片不利子发根的诱导;发根主要从叶脉的伤口处萌发;带顶芽或带侧芽的叶片容易诱导根，但不一定是发根。光照有利于发根的诱导和发根的生长。以每个发根的“绝对生长速率”(Gtowth Ratio，GR)和绝对“侧根”数量(Number of Side Roots，NSR），通过大量的发根系的筛选，建立了8个发根系，1601-L-1, 1601-L-2, 1601-L-3, 1601-L-4, 15834-L-1, 1601-P-I, 16 01-P-2，15834-L-2。Southern分子检测表明，160l-1-1，1801-L-2, 1601-L-3，1601-L-4，1601-P-1，1601-P-2均为转化子。8个建立的发根系之间无论生长或者QHS的合成存在明显的差异。比较光／暗(16/8hrs)，25℃条件下培养的16 01-L-1，1601-L-2，1601-L-3，1601-L-4，1601-P-l，和1601-P-2，其中16 01-L-3的生长最快，160l-L-1的生长最慢;但是，1601-L-1的QHS的含量最高（可达1. 048%），1601-1-3的QHS的含量最低。160Z-L-3，15834 -L-1和2583:1-L-2的生长速率相差不大。用盛有l000mLMS液体培养基的3000mL的锥形瓶扩大培养1601-L -3，15834-L-1和15834-L-2，转速为ll0rlpm，培养过程中发根容易形成发根球（Hairy Root Balis，HRB），HRB的形成严重影响发根的生长和QHs的合成，HpLC分析表明扩大培养发根中QHS的含量比较低。 改变MS基本培养基中的无机离子的浓度，研究不同无机离子对发根生长和QHS的合成的影响。 l、KN03为18.79×10-3M时有利于1601- L-1生长，为14. 84×10-3M时有利于QHS的合成。NH-4N0-3浓度在10.93-12. 49×10—3M范围内有利于1601-L-1生长，在0-20.62×10-3M范围内对QHS的合成影响不大，大于20. 62×lO-3M不利QHS的合成。培养基中NH-4+／N0-3-比值为0. 37-0. 4-0.52:1时有利于发根的生长，比值为0.52 - 0.58:1时有利于QHS的合成。 2、H-2P0-4-浓度为2.498×10-3M时有利于发根的生长在0-2. 498×l0-3M范围内，随着浓度的提高，促进发根的生长。培养基中的H2P4 -的浓度在0-1.249×lO-3M的范围内，随着浓度的提高，促进QHS的合成，为1.249×10-3M时QHS的含量最高。 3、培养基中最适16 01-L-1生长的Ca-2+浓度为0.198- 0.766×10-3M，大于或小于该浓度范围，显著地抑制发根的生长。但是，在0-3.695×10-3M范围内，随着培养基中Ca-2+浓度提高，促进QHS的合成，最适Ca-2+浓度为3.695×l0-3M。 4、培养基中不加Mg-2+时，完全抑制发根生长，在0. 142×10-3M-7.506×l0-3M浓度范围内，对发根生长影响没有明显的差别。但是，HPLC和UV分析发根中QHS含量，培养基中不加Mg-2+时，发根中QHS含量最高。 5、培养基中的Fe-2+浓度在0. 25 -1．0×10-3M范围内，同时有利于16 01- L-1的生长和QHS的形成。 6、培养基中最适合予16 01- L-3生长的KI浓度为2.5ppm，大于或小予该浓度均显著地抑制发根的生长，培养基中加入KI明显地降低发根中的QHS的含量。 7、H2BO3对l601-L-l生长影响不大，HPLC分析QHS的含量，培养基中的H3BO3浓度为100ppm和400ppm，QHS的含量分别为1.69mg/g和1.80mg/g(DW)。 8、Cu-2+对1601-L-3的生长影响显著，最适合1601-L-3生长的Cu-2+浓度为1.00ppm，在0 -1.00ppm的浓度范围内，随着培养基中的Cu+浓度的提高，发根的生物量不断增加。培养基中QHS合成的最适Cu2+浓度为0.05ppm，大于或小于该浓度均显著地抑制发根中QHS的合成。 比较光培养和暗培养对发根生长的影响，结果表明光照明显地促进1601-L-l的生长，暗培养明显不利于发根的生长。最适合于发根生长的温度为25℃，大于35℃显著地抑制发根的生长，影响发根的根尖细胞的正常分裂。 改变培养基中的蔗糖浓度和在发根培养的不同时期给培养基中添加蔗糖，试验结果表明蔗糖作为碳源对1601-L-3和1601-L-1的生长具有显著的影响。 (1)培养基中缺少蔗糖显著地抑制发根的生长。 (2)发根培养的前5天时间内，蔗糖浓度为30- 60glL昀培养基最有利于发根的生长，50glL的培养基中的发根生长最快，培养基中的蔗糖浓度大于60g/L小于30g／L时，发根的生物量增加较少。 (3)发根培养至第15天时，蔗糖浓度为60g/L的培养基最有利予发根的生物量的增加。发根培养至30天时，蔗糖浓度为60-90g/L的培养基，发根的生物量的增加相差不大，但是为蔗糖浓度为30-40g/L的培养基中的发根生物量一倍。 (4)发根培养过程中，分别于第5和15天给蔗糖浓度为30g/L的培养基中添加一次或二次蔗糖，使培养基中的蔗糖终浓度相当于60g/L或90g/L，培养至30天时，添加蔗糖的培养基中的发根的干重生物量相当于不添加蔗糖培养基中的发根生物量一倍，相当于初始蔗糖浓度为60g/L和90g/L培养基中发根的生物量。 (5)随着培养基中蔗糖浓度的提高，发根干重/鲜重比显著增加。培养基中的蔗糖的消耗量与发根生物量的增加呈正相关，蔗糖消耗越多，发根生物量的增加越大。 比较pH值对发根生长和QHS合成的影响表明，灭菌前pH值在5.O-6.5范围内的培养基适合予1601-L-1的生长，小于5.O不利于发根的生长，pH5.8有利于1601-1-1生长和QHS的生物合成。发根收获时培养基中的pH值一般为4.5-5.2. pH7.O抑制发根的生长，pHl0.O对发根具有强烈的致死作用。发根在培养过程中，对培养基中的pH值具有显著的调节作用，发根能在很短的时间内(24- 48hrs)使pl:l值为5.8、6.4、7.0培养基降低到pH4. 5-5.2，pH为5.8的培养基有利于QHS合成。 比较不同基本培养基对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明N6、DCR、Litvay培养基有利于1601-L-1的生长，WS、White、B5培养基不利于发根的生长。DCR培养基中的QHS含量最高。 根据三水平试验选用三水平正交表来安排试验的原则，选用三水平正交表L7(3-)，研究多因子效应对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明，Mg2+，Fe2+，Mn-2+，NH4NO3，KN03 ,KI,Ca-2+为发根生长的主要因子，NH4N03，KNOs，Mg2+，Ca2+，肌醇为QHS合成的主要因子。 通过TLC分析发根中QHS和其它化学成分，同时比较发根和无菌苗及野生植株的化学成分，发根和无菌苗均能合成包括QHS在内的野生青蒿叶片中的大部分非挥发性的化台 物。 研究青蒿植株在发育过程中QHS的含量的变化以及发根、无菌苗和野生青蒿中QHS的合成，HP分析结果表明，l、不同的单株青蒿之间的QHS量相差很大。2、同一植株幼 叶的QHS含量比老叶的QHS含量高。3、不同单株青蒿之间达到最高QHS含量的时间不一样，开花期或开花之前。4、无菌苗（带根）或者不带根丛生芽均能合成QHS，但是带根的无菌蕾的QHS量比丛生芽中的QIS的含量高。5、不同发根农杆菌转化的发根系1601-L-1和15834-L-1都能合成ＱＨＳ。

白杄体细胞胚胎发生及其植株再生的研究

本文以白杄的合子胚为材料，建立了体细胞胚胎发生及其植株再生系统．通过对影响体细胞胚胎发生的主要因素的系统研究，实现了体细胞胚的高频率发生。运用扫描电镜、整体染色封片及石蜡切片等方法全面观察了体细胞胚胎发生过程中的形态学、细胞学及组织化学变化。建立了胚性细胞悬浮系，测定了几个重要生长参数的变化动态，优化了体细胞胚的液体培养条件。采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳方法分析了体细胞胚胎发生过程中三种同工酶的变化。通过压片法观察了长期继代过程中胚性愈伤组织细胞及其再生植株根尖细胞染色体数目的变化。具体结果如下： 合子胚在4-6 ℃低温条件下保存1~3个月后，接种于LP+2mg/L2.4-D+lmg/L 6-BA的培养基上，黑暗条件下培养1个月后，产生浅黄色、褐色和白色半透明三种愈伤组织，其中白色半透明愈伤组织是胚性愈伤组织。黑暗中胚性愈伤组织在MS+lmg/L 2，4-D+lmg/L KT的继代培养基上可保持旺盛的增殖能力和分化潜力。当胚性愈伤组织转到MS+5mg/L ABA+50g/L PEG+5mg/L AgN03的分化培养基上，1个月后可产生大量正常的子叶期成熟体细胞胚。成熟体细胞胚在相对湿度为75%的条件下干化20天后，转到含0.5%活性炭的无激素1/2MS基本培养基上，约40天后长出1.5—2.5cm的根，约60天后长出真叶。光，ABA、蔗糖、AgN03 PEG浓度是影响体细胞胚胎发生的主要因素。 在相同的培养条件下，以新产生的子叶期体细胞胚为外植体，也可诱导体细胞胚胎发生。 胚性愈伤组织起源于合子胚子叶和下胚轴的表皮及表皮下的一些细胞。胚性愈伤组织中的一些单个胚性细胞经过第一次分裂产生两个细胞，即胚细胞和胚柄细胞，它们继续进行分裂几次以后形成胚性胚柄团结构。胚性胚柄团在分化培养基上可发育为成熟的子叶期胚。体细胞胚的成熟过程大致可分四个时期：胚性胚柄团、球形胚至鱼雷形胚、子叶前期胚和子叶期成熟胚。通过PAS反应研究后发现，在体细胞胚发育过程中，淀粉粒在胚性胚柄团时期开始积累，至心形胚时期达到积累高峰，子叶胚时期仅在器官原基及其附近细胞肉有淀粉粒分布。结果表明，淀粉是体细胞胚胎发生的一种重要能量来源。 在初始细胞密度为3.O%（鲜重）、摇床转速为150r/min的条件下，用与固体培养基成分相似的液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮培养，胚性愈伤组织的生长率大大提高。在悬浮培养过程中，培养物的鲜重、干重、紧实细胞体积及胚性胚柄团数目依次在6～10天内达到高峰。培养液的pH值和电导率分别在6—8天达到最低点。 胚性和非胚性愈伤组织的三种同工酶酶谱都明显不同;胚性愈伤组织的过氧化物酶和酸性磷酸酯酶活性较高，而非胚性愈伤组织的酯酶活性较高。体细胞胚发育过程中，三种同工酶酶谱都呈规律性变化;j活性都有逐渐增强的趋势，但酸性磷酸酯酶活性到了最后时期又突然下降。 胚性愈伤组织经过长期继代后，生长率和分化能力没有明显变化，但有些细胞内染色体数目发生了无规律的变化( 2n=7—24，2n>28)，而再生植株根尖细胞染色体数目比较稳定( 2n=28).

芦苇Phragmites communis Trin. 耐盐变异体的生物学鉴定和快速繁殖以及在海水生态养殖中的应用示范

本文以芦苇野生亲本和耐盐变异体为材料，比较了两者在形态、生理生化以及分子生物学特性上的差异，对耐盐变异体抗盐能力提高的机理作了初步的探讨。为了适应推广芦苇耐盐变异体的需要，进行了耐盐变异体快速繁殖的研究，建立了两种诱导丛生芽的技术系统。对耐盐变异体芦苇在滩涂上的利用作了有益的尝试。结果总结如下： 1．通过对芦苇野生亲本和耐盐变异体的基因组DNA用随机引物扩增分析，发现两者的基因组DNA在序列上存在着一定的差异，并克隆测序了几个对变异体而言是特异的标记序列。 2．生化分析发现，在盐胁迫下，两者在可溶性蛋白上存在着差异，芦苇耐盐变异体在胁迫下分别在20～30 kD和43～66．2 kD之间各有一条特异的蛋白带表达。而且变异体盐胁迫下在同工酶的表达上也与野生亲本有着显著的区别。 3．生理测定发现，芦苇耐盐变异体在200 mmol/L NaCl盐胁迫下光合作用要比野生亲本强，叶绿素测定的结果与此相吻合，在此浓度的胁迫下，变异体叶绿素含量受影响较小，而野生亲本的叶绿素含量明显降低。对两者胁迫前后的离子含量测定发现，虽然K+含量最多，但是植株内离子含量变化最大且增加最多的离子是Na+，而且变异体内Na~+增加的量比野生亲本高得多。另一个变化较大的是游离脯氨酸的含量，其变化情况类似于Na~+，在胁迫后脯氨酸含量增加明显，而且变异体内的增加量比野生亲本高。对变异体进一步的胁迫反应证实了Na+和脯氨酸含量变化与胁迫反应的密切联系。推测它们的这些变化与变异体抗盐能力提高密切相关。 4．将芦苇耐盐变异体的种子苗切去种壳和种子根，以此作为外植体，通过筛选大量的激素组合，最终建立了两种快繁技术系统（MP－A和MP－B）进行丛生芽诱导。两个系统都包含预处理和诱导两个主要步骤，其中预处理培养基激素组合是相同的（NAA 2～5 mg/L + 2,4-D 0.05 ～ 0.1 mg + BA 1mg/L）,而诱导处理的培养基激素组合不同，分别为：MP－A的诱导处理的激素组合是将预处理的激素组合中的2，4－D去除即可;MP－B诱导处理的激素组合为1mg/L NAA + 0.05 ～0.1mg/L 2,4-D + 2～5mg/L BA. 两个系统都获得显著的丛生芽诱导效果。 5．在滩涂水产养殖中引入芦苇种植、发现耐盐芦苇能有效地降低水体污染和病害，实验了两种模式的种养殖方式：围隔模式和混合模式，初步结果表明混合模式效果较好。这一初中初步验证了芦苇对海水养殖的价值，对开发滩涂具有很大的意义，具有创新性。

青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究-金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析

第一部分：青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究 青蒿素是从中药青蒿中分离出的倍半萜内酯化合物，目前是世界上唯一有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿植株中青蒿素含量在开花期最高，但是目前尚不清楚开花与青蒿素生物合成的关系。为此，我们用光周期（短日照）诱导青蒿提前开花，不仅同时获得了开花与不开花的青蒿植株，而且还成功地在同一植株上诱导部分分枝开花，另一部分分枝保持营养生长状态。这一实验体系为研究青蒿开花与青蒿素生物合成的相关性奠定了基础。实验结果表明，开花与不开花青蒿植株青蒿素含量有明显差异。开花植株的青蒿素含量在前2周内逐渐提高，第三周（开花期）达到最高，并保持一周左右，在随后的2周内下降。青蒿植株开花后，叶片便开始老化变黄，逐渐死亡。未开花青蒿植株的青蒿素含量动态在前三周内与开花植株类似，但是这种高青蒿素含量状态能保持较长时间，至少在随后的2周内没有下降。未开花植株的叶片依然保持绿色。这一结果表明，开花不是导致青蒿素含量提高的直接原因。 扫描电镜观察结果表明，幼嫩叶片上的毛状腺体( trichrome)结构是完整的，而在老化的叶片上，则观察到了相当比例(40-50%)破损的腺体。这可能是导致青蒿素含量下降的直接原因。 不同生态型青蒿对光周期的反应是不同的。在北京地区，本地青蒿在8月初便开始开花，而来自四川武陵的青蒿则要到9月份才能开花。根据这一特性，采用“南蒿北栽”的方法，能够使青蒿保持较长时间的营养生长状态，延长适于采收的时间。 第二部分：金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析 植物次生代谢物山屯酮( Xanthones)仅存在于龙胆科和藤黄科植物中。它们具有抑制单胺氧化酶，细胞毒素及抗肿瘤活性。 含有1 3个碳原子的二苯甲酮是山屯酮生物合成的中间产物，是由二苯甲酮合酶催化合成的，这一反应是山屯酮生物合成的关键步骤。二苯甲酮合酶已经在金丝桃和百金花细胞悬浮培养系统中检测到，并进行了细致的生化水平上的研究。本研究是在上述研究的基础上，进一步克隆该酶的基因，并进行异源表达及功能分析工作，以便更好地了解和调控山屯酮的生物合成。 用PCR和RT-PCR技术，从金丝桃cDNA文库和逆转录产物中分别克隆到一个基因HBPS1和HBPS2，从百金花cDNA文库中克隆到一个基因CBPS1。HBPS1含有1402个碱基，其开放阅读框架编码390个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为6.55。HBPS2含有1398个碱基，其开放阅读框架编码395个氨基酸，分子量为42.8 kDa，等电点为5.78。CBPS1含有1383个碱基，其开放阅读框架编码389个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为7.88。与GenBank中序列同源性比较结果表明：在氨基酸水平上，HBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性高达92%，HBPS2与萝卜（Raphanus sativus）查尔酮合酶的同源性为64%，CBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性为71%。HBPS1与HBPS2的同源性仅为62%。 将三个新克隆的基因的ORF整合到载体pGEX-G上的谷胱甘肽还原酶S基因下游，构建成转化质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，这三个基因的ORF片段均能被表达成约68 kDa的产物，这与期望的结果一致。 活性检测结果表明，HBPS1是查尔酮合成酶，其底物为香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：香豆酰辅酶A 2.8μM，丙二酸单酰辅酶A，11.2μM。最适反应条件是350C，pH7.0，DTT浓度10 μM。 HBPS2是二苯甲酮合酶，其底物是苯甲丙氨酰辅酶A，和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：苯甲丙氨酰辅酶A 2.4 μM，丙二酸单酰辅酶A 9.6μM。最适反应条件是350C，pH 6.5，DTT浓度50 μM。而CBPS1则没有检测到任何活性。从同一种植物中同时获得了查尔酮合酶和二苯甲酮合酶，对研究这两种十分相近的酶的差异表达，酶促反应机制等问题将非常有利。