嗜水气单胞菌感染的中华鳖主要器官差减cDNA文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的中华鳖(Trionyx sinensis)肝、脾、肾组织为材料,应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了嗜水气单胞菌感染组织的差减cDNA文库。以中华鳖管家基因-βactin作为差减指标检测该文库差减效率达210倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集。将获得的cDNA片段连接到pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。PCR阳性检测显示差减片段在150—800bp之间。该差减cDNA文库的构建为快速分离和鉴

金鱼Prox1基因cDNA的克隆及其在眼睛发育中的表达分析

脊椎动物的Prox1基因,与果蝇的转录因子prospero同源。为了探讨Prox1基因在金鱼眼睛发生过程中的表达图式,我们从金鱼眼睛SMART库中克隆了Prox1cDNA。它全长共2851bp,编码739个氨基酸。组织分布研究表明,Prox1主要分布于眼、脑、心、肝、脾和肾中。整体原位杂交显示,Prox1mRNA首先是在晶体期的晶体原基中有转录,心跳期则在未成熟晶体的细胞中和视网膜的幼芽区可以检测到。晶体纤维形成后,它主要定位于视纤维层和内网织细胞层。免疫组化显示,心跳期Prox1蛋白的定位与mRNA相同

鱼类谷胱甘肽转移酶基因cDNA克隆及其序列分析

采用RT-PCR方法,从鲢、鲤、鲫3种鱼类肝脏总RNA中克隆出了谷胱甘肽转移酶Pi型(GST Pi)cDNA序列,推导了其编码的氨基酸序列。3种鱼类GST Pi的ORF全长627bp,编码208个氨基酸。翻译起始密码均为ATG,终止密码子均为TGA。鱼类与哺乳动物、两栖类爪蟾以及节肢动物丝虫之间GST Pi氨基酸序列相似度平均值分别为50%、33%、15%左右。5种鱼类之间的氨基酸序列相似度较大,其中鲤科鱼类之间平均为85%左右。我们以GST Pi为分子标记,用最大简约数法(MP)构建了13个物种的系统进

银鲫Ran基因的cDNA克隆、表达特征及其在精核解凝中的作用

采用RACE-PCR技术结合SMART cDNA合成技术,从银鲫中克隆到Ran的全长cDNA并对其编码区全长进行了原核表达、相应抗体制备及其时空表达特征分析。RT-PCR结果表明,Ran基因除在脑组织的转录水平较低外,其它组织中的转录水平几乎相同;Ran基因在不同发育阶段的胚胎中都有mRNA转录,但其mRNA的量在原肠期以后呈下降趋势。Western blot结果表明,Ran在卵巢和精巢中均高水平表达,在心、脑、肝、脾、肾中有较低水平表达,在肌肉中则不表达。同时检测到Ran在不同胚胎发育阶段均有较强表达。

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库。以管家基因αtub lin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达210倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集。将获得的cDNA片段连接到pGEM T载体,PCR检测显示差减片段在250bp~2 000bp之间。该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进

银鲫种系细胞标记分子Vasa:cDNA克隆及其抗体制备(英文)

种系细胞始自胚胎发育早期,是动物生殖及生殖工程的基础。为研究鱼类的种系细胞提供标记分子,我们克隆并鉴定了银鲫的vasacDNA即Cagvasa。CagvasacDNA全长2771碱基(nt),编码的蛋白为银鲫Vasa即CagVasa,全长701个氨基酸(aa)。CagVasa蛋白与已知Vasa蛋白的结构特征一致:在N端有14个RGG重复序列,在C端Vasa所特有的8个功能域俱全。银鲫Vasa与鲤鱼、斑马鱼、陆生脊椎动物和果蝇的Vasa蛋白分别有95%,89%,61%-66%和50%的同源性。卵巢切片的RN

雌核发育银鲫四种孵化酶基因全长cDNA的克隆及其特征分析

用抑制性差减杂交结合SMARTcDNA合成和RACE PCR技术 ,克隆得到雌核发育银鲫 (Carassiusauratusgibelio) 4种孵化酶基因的全长cDNA。 4种孵化酶基因分别被命名为GHE1、GHE2、GHE3、GHE4。序列分析表明 ,4种孵化酶基因cDNA的开放阅读框均为 795bp ,都编码 2 6 5个氨基酸。它们推断的编码氨基酸序列同源性在 79 6～95 1 %之间。种系分析表明 ,GHE1、GHE2、GHE3、GHE4的进化地位位于日本鳗鲡(Anguillajaponica

斜带石斑鱼sox3基因cDNA的克隆及其时空表达特征分析

采用RACE-PCR方法从斜带石斑鱼的下丘脑SMART cDNA中克隆sox3基因,并研究其时空表达模式。研究结果表明,sox3 cDNA片段全长1152bp,共编码300个氨基酸。该基因在未受精卵和桑椹胚期仅可检测到微弱的转录本,从高囊胚期开始转录,一直到鱼苗1天,都维持着较高的表达水平。在肝和肾等6种组织中均检测不到转录本的存在,而在包括垂体和下丘脑等6种脑组织中可检测到不同强弱的转录本,呈现出很强的中枢神经系统的表达特异性。在未成熟卵巢中可检测到大量转录本的存在,在成熟卵子中可检测到微弱的转录本,而

银鲫两个蛋白合成相关基因全长cDNA的克隆及其特征分析

通过构建雌核发育银鲫心跳期SMARTcDNA质粒文库并从文库中随机挑选克隆测序 ,克隆得到银鲫翻译起始因子 3亚单位 2 (GTIF3 S2 )和翻译延伸因子 1亚单位α(GEF 1α)基因全长cDNA。银鲫翻译起始因子 3亚单位 2基因cDNA全长 12 80bp ,开放阅读框位于 117— 10 91bp之间 ,编码 32 5个氨基酸。其推断的氨基酸序列存在三个WD结构域。该基因在鱼类中为首次报道。银鲫翻译延伸因子 1亚单位alpha基因cDNA全长 1784bp ,开放阅读框位于82— 14 6 7

鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库的构建

紫外线灭活的草鱼出血病病毒 (GCHV)能诱导鲫囊胚培养细胞 (CAB)产生高滴度的干扰素 ,从而诱导宿主细胞基因表达的改变并处于抗病毒状态。提取灭活病毒诱导未经病毒诱导的CAB细胞mRNA ,利用抑制性差减杂交技术 ,成功构建了鱼类培养细胞抗病毒基因差减cDNA文库。以鲫管家基因α tubulin和 β actin作为差减指标 ,检测差减cDNA文库的差减效率分别高达 2 15和 2 7倍 ,表明经过病毒诱导后的细胞中 ,某些差异表达基因的富集效率也接近 2 15倍。鱼类抗病毒基因差减cDNA文库的建立

银鲫3个肌球蛋白轻链基因cDNA的克隆与特征分析

国家自然科学基金 ( 30 130 2 4 0 ) ; 中国科学院知识创新工程重要方向项目 (KSCX2 SW 30 3)资助

梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库的构建

以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料 ,利用抑制性消减杂交技术成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库。以管家基因G3PDH作为消减指标 ,检测梅山猪和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达 2 10 和 2 5倍 ,表明某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也分别接近 2 10 和 2 5倍。从两个消减文库中分别筛选到了 70 9和 6 73个有效阳性克隆 ,PCR鉴定插入片段长度主要分布于 15 0～ 75 0bp之间。不同猪种肌肉组织间消减cDNA文库的构建为进一步分离和鉴定与猪肌

彩鲫Ran基因全长cDNA的克隆及其组织表达特异性分析

根据Ran的保守区序列设计简并引物 ,结合SMARTcDNA合成及RACE PCR技术 ,克隆到彩鲫(Carassiusauratuscolorvariety)的Ran基因的cDNA全长 ,其编码区全长为 6 4 8bp ,编码 2 15个氨基酸。采用BLAST程序在NCBI数据库中对其进行同源基因搜索 ,结果表明 ,其推测的编码氨基酸序列与斑马鱼和鲑鱼的Ran基因编码的氨基酸序列的同源性分别高达 98%和 97%。还对其编码区全长序列进行了原核表达 ,以经纯化的表达蛋白免疫家兔 ,制备出了具有较高特异性

银鲫肌酸激酶M3-CK cDNA的克隆及其表达特征

用抑制性差减杂交结合SMARTcDNA合成和RACE PCR技术克隆到雌核发育银鲫 (Carassiusauratusgibelio)肌酸激酶M 3 CK基因的全长cDNA。银鲫M 3 CKcDNA全长 15 5 1bp ,编码 380个氨基酸 ,与普通鲤鱼(Cyprinuscarpio)M3 CK的氨基酸序列同源性高达 95 %。种系分析表明 ,银鲫M3 CK与其它脊椎动物的肌肉型肌酸激酶聚为较近的一支 ,与鲤鱼的M 3 CK聚在一起 ,与脑特异型肌酸激酶及线粒体型肌酸激酶分歧较大。虚拟Northern

人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达

经密码子优化的人工合成草鱼生长激素ｃＤＮＡ与表达载体ｐＥＴ－２８ａ（＋）重组，构建重组表达质粒ｐＥＴ－ＧＨ。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），筛选阳性克隆，ＩＰＴＧ诱导表达。１２．５％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的新增蛋白带，激光密度扫描，其产量约占菌体总蛋白的４０％。金属离子螯合层析柱亲和纯化，获得电泳纯的重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ和酶联免疫吸附受体法检测证实：重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合；复性后的重组蛋白有与天然草鱼生长