两种红树林植物黄槿和长梗肖槿化学成分研究

由于红树林植物的重要药用价值及其特殊的生长环境，越来越多的学者关注于红树林植物的活性成分及其作用机理的研究。本论文对两种药用红树林植物黄槿（Hibiscus tiliaceus L.）和长梗肖槿（Thespesia populneoides (Roxb.) Kostel）的化学成分进行了系统研究。对从其中分离得到的部分化合物进行了初步的抗菌活性筛选。 黄槿和长梗肖槿均采自海南岛，干燥粉碎的样品用90％的乙醇水以及1：1氯仿-甲醇混合溶液室温浸泡提取得总浸膏，将总浸膏悬浮于水中，分别用石油醚和乙酸乙酯萃取，获得石油醚相和乙酸乙酯相萃取物。 采用常规的硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、以及重结晶等手段，从黄槿和长梗肖槿的乙酸乙酯相中共分离得到43个化合物。利用各种现代波谱技术（IR、UV、MS、HR-MS、1D-NMR、2D-NMR等）确定了38个化合物的结构。其中，从黄槿的乙酸乙酯相中分离得到22个化合物，鉴定了其中19个化合物的结构，包括3个新的三萜类化合物(H1*-H3*)以及15个首次从该种中报道的化合物。从长梗肖槿的乙酸乙酯相中分离得到21个化合物，鉴定了其中19个化合物的结构，这些化合物皆为首次从该种中报道，其中1个为新的倍半萜类化合物T1*。本文为首次报道长梗肖槿的化学成分。 对分离得到的部分样品进行了抗菌活性测试，仅T1*表现微弱的抗金黄色葡萄球菌活性，抑菌圈直径为8mm（阳性对照氯霉素的抑菌圈直径为20mm），其余各样品在测试浓度下对测试菌株均未表现出活性。

转基因海带配子体的制备与高效增殖

海带具有很高的营养价值和经济社会价值。自20世纪90年代以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，根据海带自身特点，建立了海带遗传转化体系（海带孢子体表达系统），它的基本原理是利用基因枪法转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后，用氯霉素筛选幼孢子体获得转基因海带，然后进行海上安全栽培和转基因产品的检测与提取。目前该表达系统已成功实现报告基因（β-半乳糖苷酶基因，lacZ）和功能基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）的稳定表达。 由于海带孢子体表达系统需经孢子体再生和海上栽培等阶段，周期较长，而且转基因安全性问题也在一定程度上制约其研究与应用。因此，我们在海带孢子体表达系统的基础上又建立和优化了海带配子体表达系统，并成功实现了报告基因（绿色荧光蛋白基因，GFP）的瞬间表达和功能基因（瑞替普酶基因，rt-PA）的稳定表达。虽然海带配子体表达系统能避免转基因安全性问题，周期较短，但在表达量和生物量积累方面，与孢子体表达系统相比还有较大差距。 本文首先在海带配子体表达系统中成功实现了人酸性成纤维细胞生长因子基因（hafgf）和鲎素基因（tac）的稳定表达，制备了转基因海带配子体，然后将光生物反应器培养技术应用于转基因海带配子体的高效增殖，以期解决阻碍海带配子体表达系统发展的量的问题，并为转基因海带配子体的大规模培养提供试验依据和技术支持。 本文的研究结果为： 1、人酸性成纤维细胞生长因子基因和鲎素基因可以稳定整合到海带配子体基因组中，实现转基因产物的表达。 2、根据转基因海带配子体的生长特点，研制开发了一套培养体积为300 ml的鼓泡式光生物反应器，它具有操作简便、成本低廉、适合海带配子体生长等特点。随后将培养体系扩大到2.5 L，并研究了光对转基因海带配子体生长的影响，试验结果显示，转基因海带配子体在光强为30 μE m-2 s-1时即可达到光饱和生长，最优光周期为14:10 LD，而且蓝光可促进转基因海带配子体的生长。 3、在前期研究工作的基础上，为改善反应器内的传质条件，我们又设计研制了2.5 L气升式光生物反应器用于转基因海带配子体的高效增殖。研究发现，气升式光生物反应器较鼓泡式光生物反应器能明显地改善反应器内的传质状态，实现转基因海带配子体更高密度的培养（生物量可达到1,990 mg L-1），是一套高密度悬浮培养转基因海带配子体的有效装置和设备。

羊栖菜养殖品系DNA指纹分析及遗传变异的研究

羊栖菜是重要的大型经济海藻之一，在食品、医药、化工领域都有广泛应用。本研究对羊栖菜养殖生产中常见的品系“鹿丰1号”及另外2种品系进行了DNA指纹分析及遗传变异的研究，构建了遗传指纹图谱，分析了不同种群的遗传关系，为羊栖菜的种质鉴定及遗传选育提供了理论依据。 运用RAPD分子标记技术，对5个羊栖菜的种群中共125个个体进行了分析，从300个引物中筛选出12条随机扩增引物共扩增135个位点，多态位点比率为84.4%。从中选择了4个多态性位点，构建了5种羊栖菜DNA指纹图谱，并获得了“鹿丰1号”SCAR标记。另外，进行了5种羊栖菜种群的遗传背景的分析，结果表明“鹿丰1号”与品系2可以明显的与野生种群分开。根据Dice常数计算所得的5个种群的遗传距离在0.1116-0.2563之间。 运用ISSR分子标记技术，对5个种群的125个羊栖菜个体进行分析，通过90条引物的筛选，获得10条ISSR引物，扩增出92个位点，多态位点比率为67.4%。5个种群的遗传距离在0.0863-0.1454之间。 本研究以铜藻作为外群，通过2种遗传标记分析，证明铜藻与5种羊栖菜种群的遗传距离均远远大于其种群之间的遗传距离；另外，“鹿丰1号”不同年份的种群之间的遗传距离均为其中的最小值，相关结果对羊栖菜遗传选育和种质鉴定等有参考价值。

中国沿岸水域养殖贝类及其养殖笼肉污损苔虫的研究

海洋污损苔虫（marine fouling bryozoans或bryozoan foulers)是海洋污损生物群落的一个重要组成部分。在海洋污损动物中，海洋污损苔虫是仅次于软体动物和甲壳动物的主要污损生物。海洋污损苔虫有独特的群体生长方式，既有能利用表面积宽阔的附着基形成单层片状、多层结核状或丘状群体的成员；也有能利用表面积狭窄的附着基形成树枝状、树丛状或中空管状群体的成员；某些污损苔虫还能随附着基表面积的改变而改变其群体生长方式，即同一种污损苔虫在表面积宽阔的附着基上形成片状被覆群体，而在表面积狭窄的附着基上或空间竞争激烈的环境中则形成被覆和直立两种生长方式式兼有的被覆－直立群体。随着海水养殖事业的发展，各种养殖生物尤其是养殖贝类及其养殖笼网的投入为海洋污损生物提供了极其丰富的附着基。而与其它污损生物相比污损苔虫更能充分利用养殖贝类及其养殖笼网作为附着基，从而成为养殖贝类及其养殖笼网污损生物群落的优势类群，给贝类养殖业带来极大危害。近年来对养殖贝类污损苔虫的研究已开始受到人们的重视，但由于污损苔虫的调查一直是与其它污损生物调查同时进行的，污损生物学家在对污损苔虫的分类鉴定中面临着许多困难。作者对中国科学院海洋研究所历年来所收集的中国沿岸水域养殖贝类及其养殖笼网的污损苔虫标本进行了系统的分类研究，并对中国学者曾报道过的中国沿岸水域工污损苔虫进行了对比分析，得到的结果如下：1．中国沿岸水域养殖贝类及其养殖笼网的污损苔虫现有143种，分隶于2纲3目9亚目46科76属。其中养殖贝类的污损苔虫122种，分隶于44科68属；养殖笼网的污损苔虫90种，分隶于37科53属。养殖贝类和养殖笼网两类物体上的污损苔虫科属组成几乎相同，主要优势种组成几乎相同，膜孔苔虫Membranipora、琥珀苔虫Electra、草苔虫 Bugula、三胞苔虫 Tricellaria、软苔虫 Alcyonidium、隐槽苔虫 Cryptosula、血苔虫 Watersipora 拟分胞苔虫Celleporaria、和仿分胞苔虫 Celleporina等属的成员常形成污损苔虫生物群落的优势类群。2．本项研究中，我们发现一新科、一新属和7新种。新科为：太平洋苔虫科，新科Pacificincolidae fam. nov.。新属为：太平洋苔虫属，新属Pacificincola gen. nov.。7个新种分别为：（1）空穴拟小孔苔虫，新种Microporella vacuatus sp. nov.；（2）小筛网拟小孔苔虫，新种 Microporella cribellata sp. nov.；（3）无齿拟小孔苔虫，新种 Microporella inermis sp. nov.；（4）异北方拟小孔苔虫，新种 Microporella antiborealis sp. nov.；（5）项链拟小孔苔虫，新种 Microporella monilifera sp. nov.；（6）中华斑孔苔虫，新种 Fenestrulina sinica sp. nov.；（7）东方斑孔苔虫，新种 Fenestrulina orientalis sp. nov.。3. 笔者发现，本项研究以前其他中国学者所报道的污损苔虫在分类鉴定中存在许多异物同名和同物异名现象。例如，过去许多学者所报道的大室膜孔苔虫实际上包括3个不同的独立种；而过去一直被标定为聚合软苔虫的污损苔虫经鉴定为迈氏软苔虫。笔者对在本项研究以前的污损调查报告中所出现的污损苔虫的分类鉴定错误进行了适当的更正，并在系统分类研究的基础上编制了中国沿岸水域养殖贝类及其养殖笼网143种污损苔虫的分类检索表。

牙鲆雌核发育分析鉴定与性别决定机制研究

本研究应用同工酶和随机扩增多态性DNA（RAPD）方法，分析了牙鲆野生种群和雌核发育群体的遗传多样性和遗传分化水平；应用RAPD方法对比分析了雌核发育牙鲆的亲鱼和子代DNA样品；采用PCR扩增牙鲆SRY同源片段并进行了序列分析；将RAPD扩增产物中性别连锁DNA片克隆与测序。主要结果有：1.牙鲆雌核发育群体同工酶的Ldh-C，Cat两个基因座位发生了重组，基因座位与着丝点之间的重组率分别为52.6％和29.8％；雌核发育群体RAPD分析发现136个DNA片段中有22个发生基因分离，但由于研究方法的局限，不能确定是否发生基因重组。2.牙鲆雌核发育群体的同工酶多态座位比例和平均杂合度分别为6.90%和0.0350；研究中提出了RAPD遗传多样参数修正算法；野生种群RAPD多态片段比例37.57％，多态座位比例20.88％，平均杂合度0.0852；雌核发育群体RAPD多态片段比例16.18％，多态座位比例8.98％，平均杂合度0.03898。同工酶与RAPD方法得出结果基本一致。3.牙鲆雌核发育群体与野生群体之间的RAPD遗传相似度I＝0.9036，遗传距离D＝0.1014，已超过一般鱼类地理种群之间的遗传距离值。雌核发育群体的遗传多样性指数（H＿O＝7.1982）远低于野生群体（H＿O＝28.0986）。雌核发育与野生群体H_(pop)／H_(sp)＝0.9716，（H_(sp)－H_(pop)）／H_(sp)＝0.0284，表明97.16％的遗传多样性是由群体内不同个体间的差异造成的，只有2.84％遗传多样性与群体间分化有关。4.分析过同工酶多态座位比例、同工酶平均杂合度、RAPD多态片段比例、RAPD多态座位比例、RAPD平均杂合度、群体遗传多样性指数H＿O等遗传多样性参数，牙鲆雌核发育群体各参数比野生群体减少55.39％－77.74％，说明它的遗传多样性严重损失。5.采用RAPD对照分析亲本与雌核发育子代胚胎的DNA样品。结果表明，雌鱼有、雄鱼无的基因，雌核发育子代表达；雌鱼无、雄鱼有的基因，雌核发育子代不表达，正常受精二倍体对照组表达正常。证明牙鲆雌核发育子代的遗传物质来自母本，雌核发育诱导使用的精子经过紫外线灭活后，遗传物质已被破坏，其携带的遗传信息没有传给子代，在DNA水平证明了雌核发育诱导方法和结果的可靠性。6.进行了牙鲆性别决定机制研究。PCR分析了哺乳动物性别决定基因SRY同源片段在牙鲆的表达情况。扩产物均无个体差异，也没有性别差异。将扩增产物中信号最强的sry-2片段测序，其648bp序列与人SRY基因相应的419bp片段进行了同源性分析，两者同源性为35％，同源性很低，只有随机的碱基重合。由于牙鲆SRY PCR 扩增带没有全部分析，不能肯定牙鲆没有SRY同源片段。RAPD分析确定3个引物的4条扩增片段与性别相关，分别克隆、测序，S134和S145－S两个片段得到了完整序列。

黄海冷水团及邻近海域小型底栖动物多样性及其环境效应

2007年夏季对黄海冷水团及邻近海域共48个站位的小型底栖动物组成、丰度和生物量，以及环境因子进行了科考研究。所调查站位的小型底栖动物平均丰度达2194 ± 1598 inds./10cm2，其中北黄海17个站位平均丰度为3408 ± 1578 inds./10cm2，南黄海31个站位平均丰度为1529 ± 1121 inds./10cm2。调查站位平均生物量为1839 ± 1289 g dwt/10cm2，其中北黄海站位平均生物量为2760 ± 1340g dwt/10cm2，南黄海平均生物量为1335 ± 902g dwt/10cm2。在分选出的共18个小型底栖动物类群中，丰度上均以自由生线虫占绝对优势，达总量的88%，且在南（88.3%）、北黄海（87.7%）基本无差异。在生物量上，同样以自由生线虫贡献最多（42％），多毛类居次（22%），其他生物量较多的还有桡足类（13%）和甲壳类幼体（12%）。在小型底栖动物的垂直分布上，分布于沉积物表层0-2cm的小型底栖动物占79%，次表层2-5cm占17%，最底层5-8cm仅占4%。统计分析表明研究站位小型底栖动物丰度和生物量与沉积物叶绿素a、有机质含量、中值粒径显著或极显著正相关，与水深呈极显著负相关，此外小型底栖动物生物量与沉积物粉砂粘土含量显著负相关。 同年秋季搭载开放航次对黄海5个站位、东海3个站位、南海2个站位的小型底栖动物组成、丰度和生物量，以及环境因子进行了调查研究。对三个海域小型底栖动物的比较研究发现，平均丰度以黄海最高，达2132 ± 946 inds./10cm2，东海次之，为1954 ± 2047 inds./10cm2，而南海仅156 ± 56 inds./10cm2；三海域的平均生物量依次为2193 ± 1148 g dwt/10cm2、1865 ± 1555 g dwt/10cm2和212 ± 22 g dwt/10cm2。在分选出的共14个小型底栖动物类群中，丰度上均以自由生线虫占绝对优势，分别占总量的85%、89%、85%。在生物量上，黄海以自由生线虫贡献最多（33％），多毛类居次（18%）；东海二者比例相近（约37％），而南海则以多毛类占绝对优势（56％），线虫居次（25%）。在小型底栖动物的垂直分布上，三个海区差异较大：分布于沉积物表层0-2cm的小型底栖动物在黄海高达90%，东海仅46%，在南海为63%。统计分析表明，本研究站位小型底栖动物丰度与沉积物中的叶绿素a及脱镁叶绿素a含量和底温呈显著正相关，与水深呈显著负相关。该结果与本航次之后在广东湛江和海南以东的南海海域开展的908调查结果形成了鲜明对照，后者的小型底栖动物及线虫丰度与沉积物中有机质含量呈显著正相关，与水深呈显著负相关，表明近海受人类干扰影响较大。 本文利用微宇宙实验方法，来确定不同浓度梯度的Cu、Pb以及Cu/ Pb混合重金属污染物对青岛湾小型底栖动物（主要是线虫）的影响。加入污染物后，分别在1、3、7、14、21天进行取样分析。结果显示，Cu和Cu/Pb混合高浓度实验单元组的线虫丰度除在第21天有较明显减少外，在整个实验周期内基本没有变化，分析可能系高浓度Cu的固定作用从而使小型底栖动物无法腐烂降解造成的。同一时间尺度上，各重金属污染物实验单元的线虫丰度均高于（或接近于）空白对照组，较高浓度的重金属污染物实验单元的线虫丰度高于（或接近于）较低浓度重金属污染物实验单元，Cu/Pb混合低浓度实验单元的线虫丰度高于同一时间尺度Cu低浓度和Pb低浓度实验单元。推测是由于采样点的线虫群落中存在对Cu和Pb的耐受种或者“机会种”造成的。

潮间带纤毛虫原生动物和小型底栖动物生态学研究

微型和小型底栖动物是底栖微/小食物网的重要构成。相对浮游生态系统, 迄今国际间对底栖食物网的认知极为欠缺。这一方面是由于微型生物形态和功能上的复杂性和多样性, 另一方面原因在于研究方法的障碍—主要是微型和小型底栖动物的定量提取和定性分析。本研究首先进行了方法学改良, 并应用新方法对底栖微食物网的重要功能类群—纤毛虫原生动物和小型底栖动物进行了不同生境的周年按月采样, 定性及定量研究的同时, 联系环境因子对微型和小型底栖生物的环境监测进行了探讨。 微型和小型底栖生物的定量研究首先涉及到目标生物在沉积物中的有效提取, 目前硅胶液提取是普遍使用的方法, 其中Ludox液主要应用于小型生物, 它不但价格便宜而且比重合适, 因此在常规生态研究中被广为接受。不过, Ludox易与于海水中的阳离子产生凝结而无法直接用于微型生物; 目前唯一直接应用于微型生物提取的是Percoll硅胶液, 但其昂贵的价格使其在常规生态研究中受到极大限制。本研究以价格低廉的Ludox 硅胶液结合定量蛋白银染色 (QPS) 技术开发了一种新的方法, 即Ludox-QPS法。主要流程为: 样品采集与固定、淘洗/稀释降盐、Ludox密度梯度离心、过滤浓缩和琼脂包埋, QPS染色、永久封片及鉴定计数。添加已知数量的纤毛虫至无生物底泥的重获实验表明, 该密度梯度离心的提取率大于94%; 该方法对自然沉积物中纤毛虫的提取率达97.6%, 对沙质、泥沙质和泥质中海洋线虫的提取率分别达97%、96.9% 和97.8%。对比实验表明, 经QPS制片获得的小型动物的丰度和类群数量与传统方法相当或更高, 尤其当小个体虫体占优势时, 该法显示出较传统方法 (导致数量低估) 更为明显的定量优越性。该方法除用于纤毛虫和小型动物的定量分析外, 还具有较高的分类分辨率, 染色后的纤毛虫原生动物大多类群可鉴定到属, 部分可鉴定到种, 以此可在群落水平上研究其生态作用。 根据新开发的Ludox-QPS技术, 在大沽河潮间带依据盐度梯度选定2个站位 (IIQ和营海) 进行了周年按月采样, 对底栖纤毛虫和小型底栖动物进行了定量研究。纤毛虫原生动物在IIQ和营海的年平均丰度分别为2236 inds./10 cm2 和935 inds./10 cm2 (28 inds./ml 和12 inds./ml), 平均生物量分别为119.1 gC/10 cm2和54.2 gC/10 cm2 (1.5 gC /ml 0.7 gC/ml)。丰度的季节变化趋势为: 春天 > 秋天 > 夏天 > 冬天。垂直分布上, 在营海分布于表层0-0.5 cm 的比例为57.1%, 分布于0.5-2 cm、2-4 cm和4-8 cm比例分别为23.1%、11.4% 和8.5%; 13个月中除12月份外, 4-8 cm均有一定数量的纤毛虫分布; 而在IIQ, 97% 的纤毛虫分布在0-0.5 cm, 分布在0.5-2 cm、2-4 cm和4-8 cm比例分别为2.4%、0.4%和0.2%, 4-8 cm的分布只发生在春季和秋季。纤毛虫的多样性季节变化明显, 春秋季物种丰富, 两个站点每毫升沉积物的平均物种数分别为18和6。Two-Way Crossed ANOSIM 分析表明纤毛虫群落在月份间和站点间的差异极其显著。Pseudochilodonopsis sp., Chilodontopsis sp., Euplotes sp.及Prorodon sp.是表征两个生镜中纤毛虫群落的主要类群。 同时, 发现了14个小型生物类群, 其中线虫在IIQ和营海的丰度优势度分别为97.4% 和78.6%。小型动物在IIQ和营海的年平均丰度分别为4793 inds./10 cm2和8915 inds./10 cm2 (60 inds./ml和111 inds./ml), 其生物量分别为1068.8 gC /10 cm2和1790 gC /10 cm2 (13.4 gC/ml和22.4 gC/ml)。小型底栖动物的丰度在IIQ的季节变化为: 夏季 (7888 inds./10cm2) > 秋季 (5447 inds./10cm2) > 春季 (3731 inds./10cm2) > 冬季 (2780 inds./10cm2); 在营海则完全相反: 冬季 (15579 inds./10cm2) > 春季 (10691 inds./10cm2) > 秋季 (6611 inds./10cm2) > 夏季 (4667 inds./10cm2)。小型底栖动物和纤毛虫的相对重要性存在明显的区域和季节差异。 纤毛虫原生动物、小型动物及环境因子的相关分析表明, 纤毛虫的丰度和多样性与温度和盐度及有机质含量显著相关, 与小型动物没有显著相关性; 群落结构分析表明, 温度、有机质和小型动物的丰度的组合与纤毛虫群落丰度的相关系数为0.345; 盐度、脱镁叶绿素、有机质和小型动物生物量的组合与纤毛虫群落多样性的相关系数为0.403。依据海洋线虫和桡足类的比值 (N/C) 推测, IIQ 可能存在严重的有机污染, 营海则存在明显的季节波动, 8月和9月及2月可能是污染最严重的季节, 这种状况在纤毛虫群落结构的CLUSTER聚类中得到验证。虽然目前尚没有形成有关微型底栖生物-纤毛虫原生动物的污染检测的直接依据, 但本研究说明纤毛虫群落的确对环境污染具有一定的感应度, 而且这种感应和利用小型生物的主要类群估算的污染检测 (N/C) 存在一定程度的关联。 90年代早期有关青岛湾有机污染带的研究表明, 经彻底截污后, 其环境状况向良性发展。进一步了解该湾的健康状况, 2006.5-2007.5月对该湾沙质和泥沙质的小型动物进行周年按月采样。小型动物在泥沙质和砂质沉积物中的年平均丰度分别为4853 ± 1292 inds./10 cm2和1528 ± 569 inds./10 cm2; 年平均总生物量分别为1434.1 ± 897.0 gC /10cm2和720.7 ± 353.8 gC/10cm2。沙质底小型生物的丰度季节波动明显, 6月份和12月份最高, 3月份和9月份最低; 泥沙质季节波动不明显, 6月份最高。两个站点均有48%的小型动物分布在0-0.5 cm 表层, 海洋线虫在表层的分布比例分别为48% (泥沙质) 和34% (砂质)。共检获14个小型动物类群, 其中线虫在泥沙质和砂质沉积物中的年平均丰度分别4619 ± 1255 inds./10cm2和1014 ± 376 inds./10cm2, 其丰度优势度分别为95.2%和66.4%。其它在丰度上占优势的类群, 泥沙质依次为多毛类 (1.5%)、甲壳幼体 (1.5%) 和桡足类 (0.7%); 沙质依次为: 甲壳类幼体 (12.6%)、腹毛类 (8.3%) 和 桡足类 (6.2%)。CLUSTER聚类分析表明, 泥沙质和和砂质中小型生物的丰度组成具有64%的相似性。BIOENV分析表明, 温度、盐度、中值粒径和粘土粉砂含量的组合最能解释不同月份之间和不同站位间的差异, 其相关系数为0.614。依据小型生物的丰度和类群组成, 表明泥沙质底尚存一定的有机污染。

刺参遗传连锁图谱构建及卵母细胞成熟过程研究

第一部分 刺参遗传连锁图谱的构建 利用AFLP和微卫星标记以一个远缘地理杂交家系为作图群体，以拟测交理论为作图策略，构建了刺参Apostichopus japonicus的雌性和雄性遗传连锁图谱。利用62对AFLP引物组合，对亲本和93个个体进行了分离分析，共得到3572个标记，其中具有多态性的标记为点数为1133个，多态性比例为31.5%。平均每个引物对产生18.3个多态片段。1133个多态性位点中，294个标记在父母本中都出现并在后代中分离，839个标记在父本或母本中出现并在子代分离，其中母本443(52.8%)个分离标记，父本396(47.2%)个分离标记。卡方检验显示，556个标记符合孟德尔1:1分离。筛选微卫星标记中30个在家系中具有作图信息，其中19个可用于母本作图，19个可用于父本作图。 利用Mapmaker 3.0/EXP软件对分离标记进行连锁分析。358个分子标记用于雌性遗传连锁分析，其中包括19个微卫星标记，199个AFLP标记和11个微卫星标记定位在雌性框架图谱中。雌性框架图谱共有25个连锁群，总长度为3148.3 cM。标记之间最大间隔为37.5 cM，平均间隔为17.0 cM，连锁群的分子标记数最大为21个最小为4个。用于雄性连锁分析的分子标记共有332个，其中包含19个微卫星标记。207个标记定位于23个连锁群上，其中AFLP标记数为196个，微卫星标记数为11个。23个连锁群总长度为3059.8 cM，标记间最大间隔38.6 cM，平均间隔16.6 cM。每个连锁群的长度范围在40 cM到271.4 cM之间，标记数在18到4个之间，包括二、三连体在内的雄性连锁图谱共覆盖3227 cM。雌雄基因组的预测长度分别为4053.7 cM和3816.3 cM，因此，所构建的雌雄连锁图谱覆盖率分别为84.0%和84.5%。通过共有微卫星标记，有3个连锁群在两个图谱中对应。分子标记在两个图谱中呈均匀分布，没有成簇现象。 分子标记筛选、遗传图谱的构建为刺参分子标记辅助选择育种，经济性状QTL定位和比较基因作图打下基础，并且最终将促进中国刺参遗传改良和新品种的培育工作。 第二部分 卵母细胞成熟过程研究 对刺参卵母细胞的体外诱导成熟方法进行探索，并且通过透射电子显微镜、扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜结合超薄切片技术及间接免疫荧光染色技术研究卵母细胞成熟的生物学过程。 分别利用在海参中有诱导作用的海星神经提取液和二硫苏糖醇(DTT)对从成熟卵巢解剖出的刺参卵母细胞进行诱导成熟试验，结果显示，刺参的卵母细胞在海水中不会发生自发成熟，海星神经提取液以及神经提取液加滤泡悬浮液对卵母细胞没有诱导成熟的作用，而二硫苏糖醇处理可以诱导卵母细胞生发泡破裂，当DTT溶液的浓度处于10-1 mol/L到10-3 mol/L之间时，对刺参卵母细胞的促熟作用较为明显，在10-2 mol/L左右时，卵母细胞的诱导成熟率可以达到90%以上。未成熟的卵母细胞处于第一次减数分裂前期，不具备受精能力。经DTT诱导后，生发泡发生移动并破裂，染色体排列到赤道板上，然后第一、二极体先后排出，诱导成熟的卵母细胞排出极体的时间与自然受精的卵子一致。在卵母细胞成熟过程中有受精膜举起的现象，说明精子入卵不是受精膜举起的必要条件。卵母细胞只有在生发泡破裂之后才具有受精能力，从生发泡破裂到第二极体排出前的整个减数分裂过程中，卵母细胞都可以受精，但是只有在第一极体排出前受精的卵母细胞才能发生卵裂。人工促熟的卵母细胞受精后，形成的胚胎似乎并不能正常发育，试验过程中最多只得到了8细胞期的胚胎，之后细胞便产生畸形并停止分裂，最终裂解消失。 利用DTT诱导刺参卵母细胞成熟，综合运用光镜、电子显微镜及激光共聚焦技术观察卵母细胞成熟过程，分析了卵母细胞表面动物极突起在卵母细胞脱滤泡中的作用，以及卵母细胞动物极突起和微管组织在生发泡移动过程中所起的作用。卵母细胞通过动物极突起连接到滤泡上，在脱滤泡作用开始时，卵母细胞动物极突起刺入并穿过滤泡膜，使得滤泡膜表面形成一个缺口，然后整个卵母细胞开始从缺口处挤出。脱滤泡的作用力来源有两种：胶膜层的水合作用以及滤泡的收缩。通过激光共聚焦显微镜观察，未成熟的卵母细胞中存在5种类型的微管，并且有两个微管组织中心锚定在卵母细胞突起下方。减数分裂重新启动时，生发泡沿微管向动物极移动，至细胞膜下时破裂。微管解聚对照实验证明驱动生发泡移动的细胞结构为微管束。生发泡破裂后，两个微管组织中心组织形成减数分裂纺锤体，然后第一极体以“收缩-排出”的独特方式排出。 本研究填补了刺参繁殖生物学研究中的缺失环节，为刺参人工繁育技术提供理论基础和指导。

扇贝大防御素和G型溶菌酶的基因克隆与重组表达

扇贝养殖是我国传统的海水养殖产业，但自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。 从扇贝自身的免疫防御因子入手，筛选和克隆参与免疫防御的功能基因，一方面可以研究抗病功能基因在病原感染或环境胁迫条件下的表达规律，深入探讨扇贝的免疫防御机制，并可作为抗病良种选育的分子标记，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育；另一方面，可对抗菌效应物实现重组表达，开发新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质，对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用，对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。 本研究采用大规模EST测序方法，结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从海湾扇贝血淋巴中克隆到了大防御素基因（big defensin, AiBD）的全长cDNA序列，该cDNA全长为531 bp，其中5' 非编码区（UTR）为24 bp，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有369 bp，编码122 个氨基酸残基；随后为138-bp 的3' UTR，包括一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和ploy A尾巴。分析表明，海湾扇贝大防御素是以前体的形式合成，前体分子包括信号肽、前域和成熟肽三部分。采用Northern blot方法，以DIG标记的DNA探针检测了 AiBD mRNA在不同组织中的表达。结果发现，AiBD 基因的转录本主要在血淋巴中表达，在鳃中也有微量的表达，而在外套膜、闭壳肌、性腺及肝胰腺中检测不到杂交信号。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌感染后海湾扇贝血淋巴中AiBD mRNA 的表达量进行了检测，结果发现在感染后8 h 内， AiBD mRNA 的相对表达量平缓升高；随着刺激时间的增长，AiBD基因的mRNA表达量急剧增加，在刺激后16 h 和32 h 分别达到了空白组的72.3 倍和131.1 倍。为了研究海湾扇贝大防御素的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组AiBD具有广谱的抗菌活性，其对供试的三株革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌）都表现出显著的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌（鳗弧菌、亮弧菌）的抑菌活性则相对较弱；此外，重组AiBD对表达宿主也表现出杀菌活性，证明其具有抗真菌活性。 根据栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的cDNA序列，利用构建的Genome Walking 文库获得了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的全长序列，该基因序列全长为8131 bp，由六个外显子和五个内含子组成。六个外显子长度分别为55 bp，60 bp，90 bp，113 bp，145 bp 和140 bp；五个内含子的长度分别为1126 bp，2161 bp，2744 bp，750 bp和592 bp；内含子的两侧都具有RNA正确剪接所必需的识别位点（GT/AG）。利用TRANSFAC 软件对栉孔扇贝G 型溶菌酶基因的5' 侧翼序列分析发现，该基因的5' 侧翼具有 TATA box 和 CAAT box 的共有序列；此外，在该基因的5' 侧翼发现了C/EBP、NF-κB、OCT-1 和 NF-IL6 等参与免疫基因激活的转录因子潜在结合位点。采用Northern blot方法，以生物素标记的RNA 探针检测了栉孔扇贝G 型溶菌酶基因在不同组织中的表达。结果发现，该基因的转录本主要在鳃、性腺及肝胰腺中表达，在血细胞和外套膜中也有微量的的表达，而在闭壳肌中检测不到杂交信号，这表明栉孔扇贝G 型溶菌酶可能兼备参与机体免疫防御和消化的功能。为了研究栉孔扇贝G 型溶菌酶的抗菌活性，将其成熟肽编码区克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K并实现了重组表达。抑菌实验表明，重组产物具有显著的抗阳性菌活性，其对供试的藤黄微球菌、溶壁微球菌表现出明显的抑制作用，对金黄色葡萄球菌未检测到抑制活性；而对革兰氏阴性菌仅表现出微弱的抑菌活性（亮弧菌和鳗弧菌），对大肠杆菌则基本无抑制活性。

光对裙带菜排卵的干扰及单克隆扩增、育苗条件优化

为了进一步完善裙带菜单倍体克隆（简称单克隆，以下同）育苗技术，实现该技术的产业化，本文对单克隆的快速扩增以及育苗条件进行了优化研究。获得如下结果：一、光对裙带菜排卵的干扰现象：一般附苗后4-5天雌雄配子即已形成。接近成熟的卵囊细胞翘起，长度达到50-55μm，直径为19-20μm，一到两天后即可排卵。精子囊略透明，颜色微绿。在11：13（L：D）的光周期下，排卵一般在黑暗开始后5分钟即已开始，5-15分钟后达到高峰。排卵的过程只有几秒钟。卵排出后停留在卵囊开口处，仍与卵囊牢固相连。虽然排卵过程只有几秒钟，一旦这个过程受到光的干扰，就会诱导卵脱离卵囊。实验证实，5-6μmol m~(-2)s~(-1)的微弱光强（显微镜下镜检的光强）即能引起95%的卵从卵囊脱落。根据我们的观察，一旦卵已排出并与卵囊相连，将不再受光的干扰而脱落。脱落的卵很快死亡分解。将配子已经形成但尚未释放的培养转移至连续光下以后，卵仍能排放，但排出的卵大部分脱落（75%），进一步说明了光对排卵的干扰作用。在育苗实践中，为了方便工作，育苗车间内在天黑后的2-3小时内仍有照明，而在第二天早晨取样观察，就会发现许多空的卵囊。我们的实验证实了这是由于排卵过程受到光的干扰引起的。因此，在育苗实践中，为了提高出苗率，在出苗期间，天黑后2-3小时内育苗车间内应避免照明，以降低光导卵的脱落。二、单克隆快速扩增以及育苗条件的优化：（一）、单克隆快速扩增的优化。实验结果表明：1、单克隆快速生长的适宜光照强度为80-120μmol m~(-2)s~(-1)。单克隆的培养密度宜控制在1-10g/L。接种密度以1g/L为宜。2、单克隆藻体内能贮藏氮，因此在单克隆快速扩增过程中，可采用间歇施肥法补充氮源。实验证明，培养液中氨态氮的适宜浓度为20μmol/L，可维持单克隆6天的生长之用（单克隆培养密度1-10g/L）。3、实验证明，在65天内，“老水”对单克隆的生长没有明显的抑制作用。而且，PES培养基除氮的其它成分也可满足单克隆65天的生长需求。4、单克隆快速生长的适宜温度为22 ℃。另外，单克隆密度与消光值之间存在着线形关系，可以通过测量消光值来计算单克隆的培养密度和鲜重，以代替称量法测鲜重。综上，可提出如下单克隆快速扩增的模式：温度为22 ℃；初始光强控制在80-120 μmol m~(-2)s~(-1)；单克隆的接种密度为1g/L；PES培养基（除去氮的成分）可供单克隆65天的培养之用，在这65天内，每隔六天左右将初始氨态氮补充至20 μmol/L；单克隆的培养密度控制在1-10g/L；单克隆培养密度和鲜重可通过测量消光值计算得到。依以上模式，并及时进行扩养，单克隆的鲜重平均日增长率可达25%，以此增长率计算，10g单克隆经一个月培养后鲜重可达8070克，可培育苗帘2000多个，实现海面养殖1000多亩，达到了生产性育苗的要求。（二）、单克隆育苗条件的优化 根据实验结果，可采取如下的育苗优化措施：1、光对排卵有干扰作用。因此，在出苗期间，在天黑后2-3小时内，育苗车间内应避免照明，以降低光导的卵子脱落。2、1μmol/L磷（PO_4~(3-) -P）和70 μmolm/L氮（NH_4~+-N）有利于加速出苗。3、铁对配子体的发育有明显的促进作用。2.5μmolm/L的Fe（III）能使出苗时间提前1-2天，出苗率增加15%左右。4、单克隆育苗较适宜的温度为17 ℃。依以上条件，4-5天左右即可出苗，比一般出苗时间提前1-2天。出苗率也有所增加，例如在实验室条件下，出苗率由原来的50-60%增至80-90%，增加了30%左右。本项研究进一步完善了裙带菜单克隆育苗技术，将大大有利于该技术的进一步推广。

黄海太平洋磷虾种群生态学研究

太平洋磷虾（Euphausia pacifica Hansen）作为目前已开发利用的6种主要磷虾资源之一，广泛分布于北太平洋北部及其临近近岸海域。在黄海，太平洋磷虾是黄海海洋生态系统中大型浮游动物的优势种和重要功能群的组成种类，它还是黄海生态系统中鱼类等上层营养级生物的重要饵料。太平洋磷虾的种群组成以及数量变化会直接影响到黄海经济鱼类的资源动态，从而影响到整个黄海海洋生态系统的变化。 本论文依托国家重点基础研究发展计划项目（973-II）——“我国近海生态系统食物产出的关键过程及其可持续机理”和国家自然科学基金40306021号——“黄、东海太平洋磷虾种群补充机制研究”，在2006年4月到2007年8月的八个黄海调查航次中，通过网采固定样品和现场培养实验相结合的方法，对黄海海域太平洋磷虾的种群生态分布和补充、繁殖和发育策略、以及成体的摄食、代谢进行了较为全面、细致的研究。 种群生态分布：本文根据2006年4月（春季）和10月（秋季）两次黄海大面调查和2006年9月－2007年8月六次黄海断面调查所获得的样品，研究了太平洋磷虾在南黄海的种群生态分布和补充机制，并探讨了其生态分布与环境因子的关系。 春季，南黄海太平洋磷虾种群主要分布在33 °N－36 °N、50 m-75 m等深线之间的海域，种群总丰度（不包括卵）为152.90 ind. m-3，卵丰度非常高，成体丰度较低，仅占种群总数量的8.72%。调查海域的平均成体丰度为0.35 ind. m-3。种群组成以幼体为主，占到种群的90.85%。春季是太平洋磷虾种群补充的高峰期。秋季，种群主要分布在黄海冷水团海域，种群总丰度（不包括卵）为335.38 ind. m-3，成体丰度显著高于春季，调查海区成体的平均丰度为7.73 ind. m-3。成体和未成体以99.5%的总比例在种群中占绝对数量优势，卵和幼体都非常少。秋季太平洋磷虾种群处于稳定期。春季成体的体长显著大于秋季，春季成体全长以13-18 mm为主，而秋季成体的全长主要是9-13 mm。 春季，太平洋磷虾成体具有昼夜垂直迁移行为，白天主要停留在底层水域，夜间少部分成体会上升到中上层水域，但是大部分成体仍然停留在深层。幼体从C3期开始就具有一定昼夜垂直迁移行为，F2—F5期幼体的昼夜垂直迁移行为已经非常明显。由于从表层到底层叶绿素a浓度逐渐降低，因此，太平洋磷虾的昼夜垂直迁移行为可能与摄食有关。 太平洋磷虾成体的分布是与海水温度紧密相关，南黄海太平洋磷虾成体比较适宜生活的水温是8-16 °C。春、冬季水温较低，成体分布范围较广。夏、秋季表层水温急剧升高到20 °C以上，太平洋磷虾成体主要分布在黄海冷水团海域，丰度也达到一年中的最高值。另外，秋季在近长江口的北部海域有大量成体分布。 繁殖和发育：自2006年9月到2007年8月的一年内，在黄海进行了七个航次的太平洋磷虾现场培养产卵实验，结果表明：在南黄海，太平洋磷虾在3月—6月份都具有产卵行为，4月份达到产卵高峰期。单个雌体的最大产卵量为617 egg female-1，出现在4月份。8月、9月和12月在南黄海均未发现太平洋磷虾的产卵行为。太平洋磷虾具有二次产卵行为，并且第一次产卵量要高于第二次。太平洋磷虾的产卵行为与其干湿重紧密相关。成体干重低于5.0 mg，湿重低于26.0 mg，均不具有产卵能力。在产卵高峰期，太平洋磷虾的干湿重达到一年中的最高值。 在南黄海，太平洋磷虾的幼体发育主要遵循下面的发育途径：卵 → 无节幼体 → 后期无节幼体 → 原溞状幼体 → 溞状幼体F1（0' 7, 1' 7） → 溞状幼体F2（1' 4'' 7, 3' 1'' 7） → 溞状幼体F3（5'' 7） → 溞状幼体F4（5'' 5） → 溞状幼体F5（5'' 3） → 溞状幼体F6（5'' 1）。太平洋磷虾在15 °C下的幼体发育速度明显快于4 °C。15 °C下幼体发育到C1期只需5.6 d，而4 °C下则需要16.1 d。 摄食和代谢：2006年9、10、12月和2007年3、8月，在南黄海的五个断面调查航次中，在S1-4站进行了太平洋磷虾成体摄食实验，结果表明：太平洋磷虾在8月和9月份对水体中浮游植物的摄食率比较低，主要摄食水体中的微型浮游动物，从而由于营养级级联作用，致使水体中叶绿素a浓度升高。12月和3月，太平洋磷虾对水体中浮游植物有着很强的摄食活动，使得水体的叶绿素a浓度大量降低，当然太平洋磷虾也可能会同时摄食水体中微型浮游动物。 2006年9、12月和2007年3月，在南黄海的三个断面调查航次中，在S1-4站进行了太平洋磷虾现场耗氧率和排氨率实验，结果表明：太平洋磷虾在3月份的耗氧率是172.92 μg ind.-1 d-1，是9月份和12月份的6倍还要多。太平洋磷虾在9月和12月的耗碳率和体碳日损耗量相近，且都较低。3月份太平洋磷虾的代谢非常旺盛，体碳日损耗量达到2.70 % d-1，每日的耗碳率为62.9 µg C ind-1 d-1。9月和12月份太平洋磷虾代谢的氧氮比都较低，分别是11.3和7.0，太平洋磷虾成体的主要代谢基质是蛋白质。3月份的氧氮比为35.1，太平洋磷虾成体代谢主要以脂肪及碳水化合物为主。

红树林植物海榄雌化学成分研究

本论文对红树林植物海榄雌的化学成分进行了研究，对其中分离得到的部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 海榄雌采自海南东寨港，样品干燥后用氯仿甲醇（1：1）浸泡提取，合并提取物，先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。 各部分采用常规的硅胶柱层析、制备薄层层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、反相硅胶柱层析、半制备HPLC以及重结晶等手段分离得到28个化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、ESI-MS、FAB-MS、HR-FAB-MS、1D-NMR、2D-NMR等)，确定了其中20个化合物的结构，其中包括2个新化合物：化合物A1 2′-O-(5-phenyl-2E, 4E-pentadienoyl)mussaenosidic acid和化合物A2 2′-O-(p-methoxycinnamoyl)mussaenosidic acid，以及13个首次从海榄雌中报道的化合物。 对得到的20个化合物A1－A20进行了DPPH自由基清除活性筛选，化合物A4、A5、A6和A16表现出较好的活性，其IC50分别为9.61 μg/mL、8.55 μg/mL、11.72 μg/mL和7.73 μg/mL；化合物A13和A15表现出中等强度的DPPH自由基清除活性，其IC50分别为34.80 μg/mL和44.90 μg/mL；其他化合物只表现出微弱活性，其IC50均大于100 μg/mL；阳性对照BHT的IC50为18.00 μg/mL。 对分离得到的部分样品进行了抑菌活性测试，各样品在测试浓度下对测试菌均未表现出明显的抑菌活性。

雨生红球藻诱变育种及突变株的筛选

虾青素是良好的着色剂，具有超强的抗氧化、捕获自由基、抗癌变，抗紫外线辐射、增强免疫等功能，在医疗、水产、食品和化妆品等生产领域有着广泛的市场。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞的绿藻，在逆境条件下可积累高达4%干重的虾青素，是目前已知的天然虾青素含量最高的生物资源，规模化培养雨生红球藻是获取天然虾青素的最佳途径。 目前实验室研究和规模化培养使用的藻株多为出发株，存在一些缺陷：养殖过程中易被其它微藻、变形虫、原生动物、细菌等污染；只适合低温培养，28℃以上生长受抑制；生长相对较慢，培养周期长；尽管雨生红球藻是已知的天然虾青素含量最高的生物资源，但其含量仍然需要提高以适合规模化生产。因此筛选出温度适应范围广、生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株一直是努力的方向。 本研究选用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）和叠氮钠(NaN3)以及物理诱变剂紫外线（UV)分别处理雨生红球藻，测定各种诱变剂的致死率，及对红球藻生长和虾青素积累的影响，根据实验结果确定合适的诱变剂量和诱变时间，通过初筛、复筛、再次诱变等分离、筛选出生长速度快、虾青素含量高的单一藻株并进一步利用高压液相色谱等方法进行鉴定。 实验结果表明：浓度为0.2％-1.0％EMS处理4h，雨生红球藻H2的死亡率7%-35%；紫外线照射2min-10min，雨生红球藻H0的死亡率10%-98％；叠氮钠30mg/L－270 mg/L处理24h，雨生红球藻H0的死亡率为20％-100％。各种诱变剂诱变结束后立即观察发现死亡细胞的形态相似但存活细胞相态有所不同，死亡细胞呈浅绿色，轮廓模糊，形状不规则，质壁间隙消失，胞内有白色空泡；EMS处理后存活细胞，呈圆球状，部分失去鞭毛和前端突起，游动缓慢，处理后第二天，细胞即恢复游动和分裂，分裂方式与正常细胞相似。紫外线和叠氮钠处理后存活细胞壁加厚，呈深绿色，圆球状，部分失去鞭毛和突起，严重抑制细胞的游动和分裂，出现不动细胞，培养一段时间后才出现分裂细胞，游动的和不动的存活细胞主要是采用不对称无性繁殖，这与正常细胞的不对称无性繁殖有所不同，正常细胞中不对称无性繁殖的母细胞多为不动细胞。紫外线和叠氮钠处理后部分细胞还产生大量的小孢子（配子？），直径较小1-4m，在母细胞内不停摆动，四、五天后逐渐脱离母细胞。这和以前描述的有性繁殖很相似，但由于没观察到后期孢子配对过程和缺乏小孢子的DNA含量和倍性的有关数据，不能确定观察到的小孢子现象为雨生红球藻的有性繁殖。 各种诱变剂处理后，各组存活藻株的生长和虾青素积累情况同对照组相比发生了变化：EMS实验中0.4％EMS组生长速率提高24％，其它组的细胞生长速率有所降低。各组单细胞虾青素含量和积累速率均高于对照组，其中0.4％和0.8％处理组单细胞内虾青素含量分别提高了76％和90％，积累速率分别提高了69％和115％；紫外线实验中4min、6min和10min组生长速率分别提高20％、17％和35%，各组藻细胞虾青素积累速率有不同程度的提高，其中2min组和10min组虾青素积累速率提高幅度最大分别为32%和31%，单细胞内虾青素含量除10min处理组提高48%，其它各组均有不同幅度的降低；叠氮钠实验中60mg/L、120mg/L和180mg/L组细胞生长速率分别提高了13％、20％和9％，各组藻细胞内虾青素含量和虾青素积累速率得到明显的提高。其中60 mg/L和180 mg/L组单细胞内虾青素含量提高幅度最大，分别提高75%和140%。180mg/L和240mg/L组虾青素积累速率提高幅度最大，分别为280％和250％。 诱变后通过固体平板分离，得到一系列单一藻株，其中0.4%浓度EMS处理雨生红球藻H2 4h后分离到H2-419在生物量上比H2高出20％,但虾青素含量提高幅度不大。用UV对突变株H2-419再次诱变得到较稳定的藻株H2-419-4，培养五个月后与H2相比生物总量提高68%，单细胞内虾青素含量提高28％，经高压液相色谱分析证明H2-419-4类胡萝卜素提取物中主要成分仍然为虾青素，和出发株H2相比色素成分没有发生变化，只是各成分比例有所不同。 还分析研究了其它单一藻株，但或是稳定性较差，或虾青素含量高而生长慢。如雨生红球藻H2经0.02％EMS诱变十天，分离得到的E-L-22和出发株相比虾青素产量提高40％，但生物总量上降低了27％；5min紫外线照射雨生红球藻H0后，分离得到的UV-5-16和UV-5-14在生物总量分别提高7％和36％。叠氮钠200mg/L处理24h分离得到的藻株N-2-42生物总量提高43％，但藻株N-2-43生物总量比出发株降低8％。

南沙珊瑚礁生态系的营养动力学过程

本论文首次报道了在珊瑚礁向海坡上投放沉积物捕捉器的结果和若干非生源要素如Mo、W、Re、Os、Ni、Ir等在泻湖内外的垂直通量，并在国内首次报道了珊瑚活体培养的结果。将海水、沉降颗粒物、生物和泻湖表层沉积物统一进行系统的研究，重点讨论了珊瑚礁营养动力学过程和维持高生产力的机制等问题。主要的研究内容和结果包括：1. 物理动力过程对营养物质的循环有重要影响物理因素尤其是海水的动力过程更可能是珊瑚礁生长的限制性因素。南沙珊瑚礁的形态及其相关的沉积环境明显受本海区物理过程（海洋和大气）的控制。与此相适应，珊瑚礁生态系统造就了有效保持和快速吸收营养盐的特性。泻湖海水中营养盐分布明显受到泻湖水运动方式的影响，尤其是PO_4-P。2. 营养物质的循环具有快速高效和不均衡的特点 对渚碧礁生源要素的生物地球化学循环研究表明，快速分解、高效再利用是珊瑚礁总生产力很高，净生产力却较低的主要原因。渚碧礁泻湖内两个站的POC分别有93.55%和95.83%在进入沉积物前被消耗，能真正进入沉积物中的却很少。其中99%左右的生物碎屑POC通过生物捕食或腐解作用转变为无机碳重新进入循环。珊瑚礁生态系的高生产力主要是依靠其系统内部快速而高效的再生循环过程维持的。营养盐的原位再生是珊瑚礁营养盐的主要来源，泻湖内PTN和PON释放率分别超过90%和86%；PTP释放率为58.7%～85.2%，多数站位POP的释放率在90%以上。泻湖水中N:P摩尔比平均值仅为8.1，可能存在着氮限制。而在礁坪区，N:P摩尔比的日平均值为26.7，磷的限制作用非常明显。整体来看，氮在泻湖内进入再循环的速度和效率要高于磷2.5～12.8 倍，由于磷缺乏类似于生物固氮作用的持续的供氮机制，磷在珊瑚礁生态系中的限制作用更为明显，至少在礁坪区是如此。珊瑚活体培养的实验表明，珊瑚也存在着短时间里大量消耗营养盐的“奢侈消费”现象。珊瑚对营养盐的吸收速度与营养盐的浓度和珊瑚的种类均有关系。添加营养盐起始浓度高的组营养盐消耗的速度快，与之相适应，其它的各种溶解性营养盐浓度也产生复杂的变化，对迅速稳定水体营养盐浓度产生协同作用，这一过程有助于珊瑚充分吸收突然输入的营养盐。在此实验条件下，珊瑚对含氮盐类的浓度变化要比对磷酸盐更为敏感，可以认为NH_4-N是珊瑚生长的限制性营养盐。在自然界中，这种情况常发生在有大量营养盐输入之后。实验中还发现，对营养盐的吸收速度比营养盐水平更为重要。吸收速度快于某种形态限制性营养盐的输入速度也会导致珊瑚的死亡。反过来讲，珊瑚礁系统可以通过降低对营养盐的消费速度而摆脱营养盐的限制。3. 非生源要素的循环也与生物过种密切相关 非生源要素在海洋颗粒物、生物和沉积物中的分布主要受两种作用的影响，一是颗粒物在生产、沉降和分解过程中的吸附释放作用，另一种是生物的直接利用。颗粒物对IIA族、过渡族的大部分和La系元素都是分布的制约性因素。而IA族、过渡族的一部分和部分非金属元素分布上属于营养盐型，主要受浮游生物直接吸收溶解的盐类（浮游植物）和捕食作用（浮游动物）的影响。轻元素、第四周期的过渡族元素在含量和性质上往往有别于重元素和其它周期的同族过渡元素，更多的参与生物过程。元素分析进一步显示珊瑚礁泻湖内沉降颗粒物主要是自生碎屑，而礁外沉降颗粒物包含了一部分再悬浮的碎屑矿物，但元素在泻湖内外的转移机制是类似的，造成颗粒物来源差别的主要原因是动力学因素。水动力始终是颗粒物中元素垂直转移的主要的、关键性的因素。对于营养盐型的元素，生物的捕食富集是另一个主要控制因素。4. 多种机制的协同作用维持了珊瑚礁生态系的高生产力 考虑到珊瑚礁营养盐的收支并非总是平衡的，珊瑚礁的高生产力的维持可能是通过以珊瑚礁发育位置的选择为基础，“流网”策略、快速吸收营养盐、营养盐的快速循环和高效利用以及“休渔”策略等的协同作用实现的。“休渔”策略是指捕食因素决定的食物链上游生物迁出和初级生产力的恢复过程，当捕食作用高于生产者的生产速度或营养盐供应严重不足时，许多处于食物链上游的游泳动物将迁徙到生产力更高的珊瑚礁中去。大量的生物碎屑和代谢产物中的营养成分重新释放利用。一段时间后又能够重新繁荣起来。由于生物对磷和金属元素等的富集作用，食物链上游生物及其代谢产物作为营养物质输入的一个经常性来源的作用不可忽视。

南黄海重金属的演变特征及控制因素

本文以南黄海1997～2006年10年表层海水和沉积物中重金属为主要研究对象，同时结合对生态环境信息的综合分析，系统探讨了海水和沉积物中重金属的生物地球化学特征、影响控制因素、演变趋势，并对海域生态风险进行了评估，获得了以下一系列新的结果和认识： 1．系统获得了南黄海海水和沉积物中重金属的地球化学分布模式，揭示了影响和控制其生物地球化学特征的因素 南黄海表层海水中重金属As、Cd、Cu、Hg、Pb、Zn的平均浓度分别为2.33、0.078、1.41、0.0036、0.37、6.21 μg/L，低于其它中国近海海水，而高于水交换较好的深海；表层海水重金属的分布模式（除Pb外）表现为在离岸较远的南黄海中部地区其含量较低，而近岸海区则普遍含量较高，区域分布呈现“高Cd-Cu-Hg-Zn区”，“高Pb-Cu-Zn区”以及“高Pb区”三个地球化学分区。 南黄海表层沉积物中重金属比邻近海域沉积物中的浓度低，南黄海重金属主要受沉积物粒度控制，即在细粒度高的南黄海中部区域重金属（除As外）的含量较高，粗粒度的近岸区则较低，区域分布呈现“高Cd-Cu-Pb-Zn区”，“高Hg低As-Cu-Zn区”以及“高As低Cd-Hg-Zn区”三个地球化学分区。 人类活动已经显著影响了南黄海海水中重金属的含量水平，重金属分布是径流、大气沉降、pH、盐度和重金属自身性质等各种影响因子耦合的结果。沉积物重金属的富集因子Pb>As>Hg>Cd>Zn>Cr>Cu，其中Pb和As主要来自人为污染排放，污染状况相对较重，Cr和Cu几乎没有受到人为污染的影响。沉积物的粒度是控制表层沉积物重金属分布的最主要因素，次要的因素包括沉积物有机质的含量、沉积速率以及重金属存在形态等。 2．首次获得了南黄海海水和沉积物中重金属的演变趋势 近10年来南黄海表层海水中，Zn呈上升趋势，As、Cd、Cu、Pb基本稳定变化不大，而Hg则呈略下降趋势。Zn的线性上升趋势明显，在近岸水域和中央水域中其浓度和公元年的统计关系分别为y=0.9524x+0.0034（R=0.97）和y=0.8622x+0.0299（R=0.95）（其中y为Zn的浓度，x为年度，取1997～2004）。近10年沉积物中重金属年际变化较小，浓度变化在多年均值的±（10%～30%）之间变动。As、Cd、Cu、Hg、Pb、Zn的均值变化范围分别为7.17±1.70、0.108±0.024、17.61±1.65、0.024±0.008、18.44±4.26、70.53±5.73 mg/kg，除了Hg随公元年呈较好的线性增加（y=0.0033x-6.50，R=0.75）外，其它重金属未显现出有明显的演变趋势。 近百年来，南黄海重金属的变化可分为3个阶段，20世纪60年代以前，20世纪60年代至90年代，及20世纪90年代至今。第一个阶段的60年可以看作是南黄海未明显受人类活动影响的一个时期，该段时期内明显的特征是重金属含量的变化受径流输入不均等多种因素影响，变化规律性不强；第二阶段是南黄海近岸工农业迅猛发展的阶段，由近岸传输到这一海域的重金属量增加，南黄海沉积物重金属浓度增加，沉积物质量有下降的趋势，这一阶段是人类活动影响南黄海最为明显的一个阶段；第三个阶段是20世纪90年代至今，南黄海沉积物重金属浓度呈降低趋势，与中韩两国减排及治污措施有关。近几年，南黄海沉积物的环境质量较20世纪末期有了较明显的改善。 3. 初步阐明了南黄海重金属的环境污染危害和潜在生态风险 采用潜在生态危害指数法和地积累指数等方法对南黄海沉积环境进行分析，结果表明，中等重金属污染程度海区占研究海区面积的38.7%，中等生态风险的区域则占了研究海区面积77.8%，但均未发现沉积物中的重金属与生物量的分布有明显的关系，总体表明，南黄海沉积物中的重金的污染状况及生态风险较低，南黄海沉积物质量良好。