光对裙带菜排卵的干扰及单克隆扩增、育苗条件优化

为了进一步完善裙带菜单倍体克隆（简称单克隆，以下同）育苗技术，实现该技术的产业化，本文对单克隆的快速扩增以及育苗条件进行了优化研究。获得如下结果：一、光对裙带菜排卵的干扰现象：一般附苗后4-5天雌雄配子即已形成。接近成熟的卵囊细胞翘起，长度达到50-55μm，直径为19-20μm，一到两天后即可排卵。精子囊略透明，颜色微绿。在11：13（L：D）的光周期下，排卵一般在黑暗开始后5分钟即已开始，5-15分钟后达到高峰。排卵的过程只有几秒钟。卵排出后停留在卵囊开口处，仍与卵囊牢固相连。虽然排卵过程只有几秒钟，一旦这个过程受到光的干扰，就会诱导卵脱离卵囊。实验证实，5-6μmol m~(-2)s~(-1)的微弱光强（显微镜下镜检的光强）即能引起95%的卵从卵囊脱落。根据我们的观察，一旦卵已排出并与卵囊相连，将不再受光的干扰而脱落。脱落的卵很快死亡分解。将配子已经形成但尚未释放的培养转移至连续光下以后，卵仍能排放，但排出的卵大部分脱落（75%），进一步说明了光对排卵的干扰作用。在育苗实践中，为了方便工作，育苗车间内在天黑后的2-3小时内仍有照明，而在第二天早晨取样观察，就会发现许多空的卵囊。我们的实验证实了这是由于排卵过程受到光的干扰引起的。因此，在育苗实践中，为了提高出苗率，在出苗期间，天黑后2-3小时内育苗车间内应避免照明，以降低光导卵的脱落。二、单克隆快速扩增以及育苗条件的优化：（一）、单克隆快速扩增的优化。实验结果表明：1、单克隆快速生长的适宜光照强度为80-120μmol m~(-2)s~(-1)。单克隆的培养密度宜控制在1-10g/L。接种密度以1g/L为宜。2、单克隆藻体内能贮藏氮，因此在单克隆快速扩增过程中，可采用间歇施肥法补充氮源。实验证明，培养液中氨态氮的适宜浓度为20μmol/L，可维持单克隆6天的生长之用（单克隆培养密度1-10g/L）。3、实验证明，在65天内，“老水”对单克隆的生长没有明显的抑制作用。而且，PES培养基除氮的其它成分也可满足单克隆65天的生长需求。4、单克隆快速生长的适宜温度为22 ℃。另外，单克隆密度与消光值之间存在着线形关系，可以通过测量消光值来计算单克隆的培养密度和鲜重，以代替称量法测鲜重。综上，可提出如下单克隆快速扩增的模式：温度为22 ℃；初始光强控制在80-120 μmol m~(-2)s~(-1)；单克隆的接种密度为1g/L；PES培养基（除去氮的成分）可供单克隆65天的培养之用，在这65天内，每隔六天左右将初始氨态氮补充至20 μmol/L；单克隆的培养密度控制在1-10g/L；单克隆培养密度和鲜重可通过测量消光值计算得到。依以上模式，并及时进行扩养，单克隆的鲜重平均日增长率可达25%，以此增长率计算，10g单克隆经一个月培养后鲜重可达8070克，可培育苗帘2000多个，实现海面养殖1000多亩，达到了生产性育苗的要求。（二）、单克隆育苗条件的优化 根据实验结果，可采取如下的育苗优化措施：1、光对排卵有干扰作用。因此，在出苗期间，在天黑后2-3小时内，育苗车间内应避免照明，以降低光导的卵子脱落。2、1μmol/L磷（PO_4~(3-) -P）和70 μmolm/L氮（NH_4~+-N）有利于加速出苗。3、铁对配子体的发育有明显的促进作用。2.5μmolm/L的Fe（III）能使出苗时间提前1-2天，出苗率增加15%左右。4、单克隆育苗较适宜的温度为17 ℃。依以上条件，4-5天左右即可出苗，比一般出苗时间提前1-2天。出苗率也有所增加，例如在实验室条件下，出苗率由原来的50-60%增至80-90%，增加了30%左右。本项研究进一步完善了裙带菜单克隆育苗技术，将大大有利于该技术的进一步推广。