苜蓿根瘤菌乙酰-CoA合成酶的过量表达、纯化及特性

PCR扩增了苜蓿根瘤菌乙酰辅酶A合成酶编码基因 (acsA1) ,克隆到连接 -非依赖型载体pET30LIC ;在E .coliBL2 1(DE3)pLysS中得到了有效表达 ,表达需IPTG的诱导 ,诱导 3h达到酶活高峰 .采用His·Bind柱层析对ACS进行了纯化 ,纯化的酶蛋白经SDS-PAGE呈单一浓带 ,分子量约 72 0 0 0 ,具较高的酶活 ,是无细胞提取液的 12 .7倍 .酶动力学分析显示 ,Vmax、Km分别为 (4 13.6± 11.7)mmolL-1和 (5 .8± 0 .6 )mmolL-1.图 4表 2参 8

Docking and molecular dynamics study on the inhibitory activity of coumarins on aldose reductase

In order to explore the inhibitory mechanism of coumarins toward aldose reductase (ALR2), AutoDock and Gromacs software were used for docking and molecular dynamics studies on 14 coumarins (CM) and ALR2 protease. The docking results indicate that residues TYR48, HIS110, and TRP111 construct the active pocket of ALR2 and, besides van der Waals and hydrophobic interaction, CM mainly interact with ALR2 by forming hydrogen bonds to cause inhibitory behavior. Except for CM1, all the other coumarins take the lactone part as acceptor to build up the hydrogen bond network with active-pocket residues. Unlike CM3, which has two comparable binding modes with ALR2, most coumarins only have one dominant orientation in their binding sites. The molecular dynamics calculation, based on the docking results, implies that the orientations of CM in the active pocket show different stabilities. Orientation of CM1 and CM3a take an unstable binding mode with ALR2; their conformations and RMSDs relative to ALR2 change a lot with the dynamic process. While the remaining CM are always hydrogen-bonded with residues TYR48 and HIS110 through the carbonyl O atom of the lactone group during the whole process, they retain the original binding mode and gradually reach dynamic equilibrium.

Docking and molecular dynamics studies toward the binding of new natural phenolic marine inhibitors and aldose reductase

Phenolic marine natural product is a kind of new potential aldose reductase inhibitors (ARIs). In order to investigate the binding mode and inhibition mechanism, molecular docking and dynamics studies were performed to explore the interactions of six phenolic inhibitors with human aldose reductase (hALR2). Considering physiological environment, all the neutral and other two ionized states of each phenolic inhibitor were adopted in the simulation. The calculations indicate that all the inhibitors are able to form stable hydrogen bonds with the hALR2 active pocket which is mainly constructed by residues TYR48, HIS110 and TRP111, and they impose the inhibition effect by occupying the active space. In all inhibitors, only La and its two ionized derivatives La_ion1 and La_ion2, in which neither of the ortho-hydrogens of 3-hydroxyl is substituted by Br, bind with hALR2 active residues using the terminal 3-hydroxyl. While, all the other inhibitors, at least one of whose ortho-sites of 3- and 6-hydroxyls are substituted by Br substituent which take much electron-withdrawing effect and steric hindrance, bind with hALR2 through the lactone group. This means that the Br substituent can effectively regulate the binding modes of phenolic inhibitors. Although the lactone bound inhibitors have relatively high RMSD values, our dynamics study shows that both binding modes are of high stability. For each inhibitor molecule, the ionization does not change its original binding mode, but it does gradually increase the binding free energy, which reveals that besides hydrogen bonds, the electrostatic effect is also important to the inhibitor–hALR2 interaction.

植物生产生物可降解塑料PHB的研究：真养产碱杆菌H16的phbB和phbC的基因克隆、植物表达载体构建和转基因马铃薯植株的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术从Alcaligenes eutrophus H16染色体DNA中扩增并克隆了调控聚-3-羟基丁酸(poly-3-hydroxy-butyrate，PHB)生物合成的两个关键酶基因：依赖NADPH的乙酰乙酰CoA还原酶基因(phbB)和PHB合成酶基因(phbC)。限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果，并表明克隆的基因与国外所报道的有很高的同源性。经过基因拼接，构建了块茎特异性表达的高等植物表达载体pPSAGB（嵌合phbB）、pBIBGC(嵌合phbC)和pPSAGCB（嵌合phbB和phbC）。并以试管薯(microtuber)为外植体经Agrobacterium介导转化了虎头、京丰、Bintje、Favorita、高原4号和88-5共6个马铃薯品种，获得49个株系。经PCR检测导入phbB的株系共有44个，对其中30个株系进行DNA dot blot分析，结果表明phbC导入呈阳性的株系有20个。深入的鉴定工作还在进行中。

毛白杨（Populus tomentosa）木质素生物合成相关基因分离与木质素合成调节

木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。然而纸浆生产主要是将原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离，该工艺过程产生了造纸工业的主要污染废液，并且增加造纸成本。本研究目的在于利用反义RNA技术，在分子水平调节木质素的生物合成，降低中国特有造纸树种毛白杨的木质素含量，培育更适于我国造纸工业的原料树种。以下为本研究已取得的相关研究进展： 1.通过RT-PCR技术，从毛白杨中克隆了木质素生物合成的三个相关酶的cDNAs，它们分别为咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)、咖啡酰CoA甲基转移酶(caffeoyl Co-enzyme A O-methyltransferase，CCoAOMT)及香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)。序列分析显示了毛白杨这三个基因与杨属中其它种的相应基因cDNA核苷酸序列高度同源。Northern点杂交分析表明，COMT、CCoAOMT及4CL基因在毛白杨正在生长的次生木质部中高水平表达，其表达高峰与树木的木质化进程同步;而在叶与叶柄中，这三个基因均不表达。COMT、CCoAOMT及4CL是木质素生物合成的相关酶，该表达特征与其基因功能相一致。本研究克隆的COMT、CCoAOMT及4CL基因的cDNAs已在GenBank注册登记，接受号分别为AF237777、AF240466、AF314180 (publish on Jan l,2002)。 2.通过一系列的DNA重组，构建了携带反义COMT、CCoAOMT或4CLcDNA的反义表达载体以及同时整合反义COMT与CCoAOMT cDNA的双价反义表达载体，PCR扩增与酶切检测确证构建无误。 3.以田间取材的速生三倍体毛白杨B19、B331及B304的茎尖、叶片与嫩茎为外殖体，首次获得了三倍体毛白杨的组培再生试管苗，并建立了速生三倍体毛白杨的组培再生系统，为通过基因工程改良其造纸性能奠定了基础。 4.农杆菌介导转化烟草，PCR与PCR-Southern检测表明我们获得了整合反义COMT、CCoAOMT cDNA及反义COMT及CCoAOMT cDNA共整合的转基因烟草。以Digoxigenin标记的对应于反义链的单链RNA为探针与转基因烟草的总RNA进行NoIthern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA均已表达。转基因烟草的木质素分析将有助于对COMT及CCoAOMT两个甲基化酶功能的认识。 5.通过农杆菌介导，将反义CCoAOMT cDNA转入欧洲山杨与银白杨的杂交杨（P tremulaXP.alba）。经PCR，PCR-Southern及Southern检测，确认获得了转基因植株。以Digoxigenin标记的对应于CCoAOMT cDNA反义链的单链RNA为探针与转基因杂交杨总RNA进行Northern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA已在转录水平表达。测定生长5-6个月的转基因杨树下部茎杆的Klason木质素含量，结果显示其中一个株系的Klason木质素含量比野生型对照下降17.9%，表明抑制杨树内源CCoAOMT基因表达可有效降低转基因植株的木质素含量。

果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理

用生物和非生物因子来进行采后病害的防治，是一个非常有效的方法。诱导抗性作为控制果蔬采后病害的生物技术，已成为该领域的一个研究热点。然而诱导抗性的机制非常复杂，涉及到寄主、病原菌、激发子之间的相互作用关系。本研究主要利用酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和SA处理果实，观察其抗性诱导表达和对采后青霉病菌（Penicillium expansum）的抑制作用，并从蛋白质组学水平上对诱导抗性的机理进行了分析。研究结果表明： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens (5 × 107 cells·ml-1)和SA(0.5 mM)处理采后甜樱桃果实，能够明显地降低病害的发病率和病斑直径。酵母菌和SA处理影响到了果实抗氧化酶的活性，同时还改变了POD同工酶谱和甜樱桃果实的总蛋白含量，并诱导了新的蛋白质条带产生。用光学显微镜和扫描电子显微镜技术观察发现，在in vitro条件下P. membranefaciens能够紧密地结合与病原菌的菌丝，而在in vivo条件下这种结合较为松散。 2、借鉴其它模式植物的方法，我们建立了一整套适用于多汁类植物材料的蛋白质组学研究方法。对于芒果，桃，甜樱桃、苹果以及冬枣等果实，都取得了重复性非常好的2-D图谱。我们应用该技术进一步研究了P. membranefaciens (1 × 108 cells·ml-1)以及SA (0.5 mM)处理对桃果实蛋白质组的诱导影响。结果显示，两种激发子处理都能够诱导桃果实产生抗性，从而减轻青霉病引起的腐烂。在诱导处理1 d以后，酵母拮抗菌和SA分别诱导22和16个蛋白的差异表达。质谱鉴定的蛋白属于6大类：代谢，防御反应，转录，能量途径以及细胞结构。有6个蛋白受到两种激发子的共同调控。其中，4种蛋白(包括glutathione peroxidase, polyphenol oxidase precursor, catalase和methionine sulfoxide reductase) 属于抗氧化蛋白，涉及到活性氧代谢。另2个蛋白（Major allergen Pru av 1和peroxidase）是病程相关蛋白，直接参与植物的防御反应。同时一些磷酸化酶和转录因子也受到两种激发子的调节从而参与果实的抗病反应。酶学测定和Northern杂交的结果表明，拮抗菌与SA处理均能影响过氧化氢酶活性及其基因的表达。 3、采前用较高浓度SA (2 mM) 短时间（10s）处理不同成熟期的甜樱桃果实，能够明显降低果实青霉病的病斑直径，并能减轻较低成熟度果实的发病率。在没有接菌的情况下，SA诱导了33个差异表达的蛋白，其中用质谱鉴定出了26个。而在接种病原菌的情况下，SA诱导了19个差异表达的蛋白，并鉴定出了其中的12个。这些蛋白分别涉及到代谢、防御反应、转录、能量途径、信号转导等过程。在没有接种病原菌的情况下，SA处理诱导了Putative DnaJ heat shock protein, PR1-like protein, Peroxidase, Major allergen Pru av 1 (Pru a 1)和Catalase等与抗病有关的蛋白。而在接种病原菌的情况下，诱导了PR1-like protein, Peroxidase和Catalase蛋白的差异表达。通过酶活性测定以及对细胞学定位的研究，我们发现在没有接种病原菌的情况下，POD的活性受到SA的诱导。但是在接种病原菌以后，诱导效果不明显。

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难;加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受关注,而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶（flavonol synthase）竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA文库中筛选到一个编码该酶的cDNA序列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA编码342个氨基酸;Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊（Callistephus chinensis）的相似性最高，达87%;SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA为编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR）。为了得到SmDFR的DNA序列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA序列，该序列包含五个内含子和六个外显子。 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana) DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能;目前，此实验尚在进行之中。

近零磁场对拟南芥生长发育影响初探及趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum）铁还原酶基因 MmFre 的克隆和功能分析

地磁场伴随着生命的起源、发生和进化，地球上的一切生命无时无刻不处于地球磁场中。地球自诞生以来，地磁场的强度一直在细微变化，但地磁场强度减弱会对植物产生什么样的直接影响尚知之甚少。随着对太空探索的不断发展，人类越来越需要了解处于零磁场环境的太空中生物的适应性。近零磁场是地磁场的恒定组分降低为零或者接近零的空间。本论文利用近零磁场环境探索了地磁场减弱对拟南芥整个生长周期的影响，开展了近零磁场下拟南芥短期生长试验，主要包括种子的萌发、暗培养、根生长、幼苗鲜重和根向重性分析，以及对近零磁场下拟南芥整个生长周期的表型进行了观察统计分析。结果发现(1)无论在光照还是暗培养的环境中，近零磁场对拟南芥种子的萌发、幼苗根的伸长、鲜重变化以及根向重性等的影响较小。(2)对拟南芥整个生长周期过程中表型变化进行的观察和统计分析发现：近零磁场环境中，拟南芥可以完成正常的生活史;但植株开花时间推迟、开花持续时间延长、枝条数减少、植株高度受到了抑制，种子千粒重降低。表明近零磁场对拟南芥营养生长的影响较小，而对生殖生长的影响较明显，暗示地磁场作为环境因子可能参与影响植物的生殖生长。 趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum)是一种可以沿磁力线方向运动的特殊的细菌，其胞内铁含量是菌体干重的3％，是非磁性细菌的数百倍，其中的铁主要以Fe3O4/Fe3S4 形式存在于磁小体(magnetosome) 中。趋磁细菌主要通过分泌转铁载体吸收环境中的三价铁。在磁小体合成过程中，三价铁还原为二价是一个必需的过程，因而铁还原酶在趋磁细菌的铁还原过程中可能起着重要的作用。我们以趋磁细菌AMB-1 为材料，克隆了预测的铁还原酶基因，命名为MmFre ，并在内源铁还原酶活性较低的酵母突变株S288C fre1 fre2 中进行异源超表达，对其铁还原活性进行了初步分析;同时结合GFP 融合蛋白技术对该基因的表达产物进行了酵母的亚细胞定位。结果表明：(1)利用生物信息学分析发现，MmFre 基因编码区含有1335 bp，编码444 个氨基酸残基;氨基酸序列中含有一个FAD 结合位点，并具有6 个跨膜结构域;(2)该基因在酵母表达后利用酵母活体进行酶活性检测发现，其铁还原酶活性是对照组的4 倍，暗示该基因在真核生物中的表达产物可以执行铁还原的功能;(3)利用激光共聚焦显微镜观察发现该基因的表达产物与GFP 构成的融合蛋白广泛的定位在细胞的膜上。因而，MmFre 基因的表达产物确实具有铁还原酶活性，且没有膜特异性分布，其对趋磁细菌磁小体生物合成中铁的还原可能起着重要作用。

拟南芥砷酸还原酶基因AtACR2的表达调控及其功能分析

将砷酸盐还原为亚砷酸盐是植物砷代谢途径中的关键步骤，其中砷酸还原酶是催化砷酸盐还原的关键酶。目前，对植物中砷酸还原酶基因的表达调控机制及该基因的功能了解得还不是很清楚。因此研究拟南芥砷酸还原酶基因的表达调控及其功能对于探讨植物对砷吸收、代谢、转运和富集的分子机制有重要意义。 本论文利用拟南芥砷酸还原酶基因（AtACR2）的启动表达调控序列的不同组合驱动GUS基因转录表达，对AtACR2启动表达调控序列的功能进行了分析；同时利用过表达、AtACR2基因T-DNA插入缺失突变体和地上部特异表达对拟南芥和蜈蚣草砷酸还原酶的基因功能进行了初步分析，主要结果如下： 1．对拟南芥AtACR2基因在不同砷酸盐处理浓度(0、100 yM、200 yM) 下的RT-PCR分析初步表明：在未用Na3As04处理的拟南芥幼苗中，AtACR2基因在根和茎叶中均有表达，且其在根中的转录水平高于茎叶中。同时该基因的表达在转录水平上受砷酸盐的负调控，即随着外界砷酸盐浓度的升高，AtACR2基因的转录水平降低。 2．将AtACR2基因不同启动调控序列组合驱动GUS基因转录表达，结果表 明：①由AtACR2基因上游1250 bp及其5’端非编码医构成的启动调控序列不足以启动AtACR2基因的转录表达和砷酸盐胁迫的应答；②在第一外显子和第一内含子中存在启动AtACR2基因起始转录表达的关键序列元件，它们的存在决定了该基因能否得以转录表达；⑧第一外显子和第一内含子序列中不仅存在起始基因转录的必需元件，还存在砷胁迫相关的应答元件，参与砷酸盐抑制AtACR2基因的转录表达调控；④在第二外显子和第二内含子中可能存在增强基因表达的调控元件序列，进一步影响该基因转录表达强度的调控。 3． 拟南芥AtA CR2基因和砷超富集植物蜈蚣草PvA CR2基因在拟南芥中过表达后的功能分析初步表明：①转基因植株能够通过减少体内As含量增强对砷酸盐的抗性；②两种植物的砷酸还原酶作用能力存在一定差异，其中超表达蜈蚣草PvA CR2能够使转基因植株根中As含量更少，但其对砷酸盐胁迫的抗性并没有AtACR2超表达植株强，这可能与转 PvA CR2基因植株地上部积累相对较高的砷含量有关。 4．将AtA CR2和PvA CR2在拟南芥中地上部特异表达后，抗性实验初步表明：①以野生型拟南芥为背景材料进行地上部特异超表达AtACR2或PvA CR2基因，不能增强转基因植株对砷酸盐抗性；②以AtA CR2基因的T-DNA插入缺失突变体为背景材料地上部特异表达AtACR2或PvA CR2基因，却能够明显增强转基因植株对砷酸盐的抗性。综上所述，植物砷酸还原酶基因在植物对砷酸盐胁迫的响应和调控中起着重要作用。

Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制分析

Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc) 属于蓼科蓼属多年生草本植物，在中国和日本民间曾被广泛用于动脉粥样硬化、高血压、咳嗽、化脓性皮肤炎以及淋病的治疗，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。而在现代医学上最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用，相关疗效主要来自于虎杖中结构迥异、种类丰富的聚酮化合物及其衍生物资源。这些聚酮类化合物主要包括蒽醌、大黄素、大黄素-甲醚、大黄酚、芪类以及类黄酮化合物等。其中，大部分聚酮类化合物生物合成途径机制尚不明确，但可以肯定的是植物类型III聚酮合酶type III polyketide synthases (PKSs) 在这些聚酮化合物的生物合成起始反应中行使着关键的作用。因此，除了我们所熟悉的类黄酮化合物、芪类化合物之外，进一步分离和分析虎杖中其它重要聚酮类化合物生物合成所涉及的类型III聚酮合酶基因的是非常值得期待的。 目前，已经有14个植物类型III PKS基因被克隆和功能分析。植物类型III PKS的共同特征包括基因结构、序列相似性、保守的活性中心、酶学性质以及共同的催化机制等。显花植物（裸子植物和被子植物）中，植物类型III PKS的基因结构绝对保守，除了一个早期报道的金鱼草（Antirrhinum majus）查尔酮合酶chalcone synthase (CHS) 含有第二个内含子外，迄今为止所有已知的植物类型III PKS基因均含有一个内含子且该内含子位置保守。有趣的是，在本研究中，两个含有3个内含子的类型III PKS基因从虎杖中被分离，且两个基因3个内含子的位置完全保守，这是三内含子类型III PKS基因首次得到分离。除了新奇的基因结构外，体外功能分析显示上述两个基因还具有特殊的酶学性质和功能。 本论文围绕上述2个三内含子基因开展了以下工作： 虎杖中一个由三内含子基因编码的新型类型III聚酮合酶 一个类型III PKS的cDNA及其相应的基因（PcPKS2）从药用植物虎杖中被克隆。序列分析结果表明，PcPKS2的开放阅读框被3个内含子分隔，这是一个出人意料的发现，因为截至到目前为止，除了金鱼草一个CHS基因外，所有已知的类型III PKS基因均在固定位置上含有一个内含子。除了特殊的基因结构外，PcPKS2显示了一些有趣的特性：(i) CHS“守卫”苯丙氨酸——Phe215和Phe265在PcPKS2中双双缺失，它们分别被亮氨酸和半胱氨酸取代;(ii) 体外功能分析结果表明，当酶促反应体系的pH值为6.5-8.5时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS2高效地合成丁烯酮非环化产物——4-香豆酰甘油酸内酯（4-coumaroyltriacetic acid lactone (CTAL)）为主产物，而丙烯酮非环化产物bis-noryangonin (BNY) 以及苯亚甲基丙酮为副产物;而当酶促反应体系的pH值为9.0时，PcPKS2高效地合成苯亚甲基丙酮为主产物，而CTAL、BNY为副产物。另外，除了上述3种产物外，在不同的pH条件下，还有痕量的柚皮素查尔酮能被检测到。此外，在4-香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）的类似化合物中，除了4-香豆酰辅酶A外，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS2接受作为起始底物。PcPKS2不接受脂肪酰辅酶A——异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS2基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，在根茎和幼叶中，PcPKS2表达量很高，而在根中无表达。叶中的PcPKS2的表达受病原菌诱导，但不受伤诱导。 虎杖中一个编码双功能类型III聚酮合酶的三内含子基因的鉴定 显花植物中，所有已知的类型III PKS 基因均含有一个内含子且位置绝对保守。本研究中，综合运用PCR技术，从富含聚酮类化合物的植物虎杖中克隆得到一个类型III PKS 基因（PcPKS1）及其cDNA。序列分析结果表明，PcPKS1含有3个内含子。系统发育分析结果表明，PcPKS1与其它植物的CHSs归为一类。然而，体外功能分析结果表明，当酶促反应体系pH值为7.0时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS1高效地合成柚皮素查尔酮（naringenin）为单一产物;而当pH值为9.0时，苯亚甲基丙酮（p-hydroxybenzalacetone）几乎为重组PcPKS1的唯一产物。后续的研究表明，与典型的CHSs相比，PcPKS1具有另外一些不同的特点：在pH值为9.0时（PcPKS1的苯亚甲基丙酮合成活性最适pH值），在4-香豆酰辅酶A的类似化合物中，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS1接受作为起始底物。与CHSs展现出的对脂肪酰辅酶A宽泛的底物特异性不同，在不同的pH条件下，PcPKS1不接受异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。以上数据指出重组PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS1基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，PcPKS1可能在防御病原菌和草食动物方面起着重要作用。PcPKS1和PcPKS2共同从虎杖中被分离的事实极有可能暗示了苯丁烷类化合物（phenylbutanoid）及其衍生物存在于虎杖中。 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制研究 高山红景天（Rhodiola sachalinensis A. Bor）是景天科（Crassulaceae）红景天属多年生草本植物，作为一种适应原性中草药在中国的应用史已经超过800年。最近红景天提取物作为一种重要的商业药用制剂资源，其应用遍及欧洲、亚洲和美国，其主要治疗范围包括抗变应性和消炎，提高心理机敏性等。目前已经非常明确，红景天甙（salidroside）和甙元酪醇（tyrosol）是红景天属植物的主要功效成分，主要分布于这类植物的根中并且具有抗缺氧、抗疲劳、延缓衰老、预防紫外线辐射伤害等功效。红景天甙为酪醇8-O-β-D葡萄糖甙，是酪醇在葡萄糖基转移酶UDP-glucosyltransferase (UGT) 的催化下糖基化后形成的，可以认为是酪醇在植物体内的贮存形式。酪醇作为一种重要的活性分子，同样存在于橄榄树和葡萄酒中。 虽然已经非常明确酪醇来自于莽草酸代谢途径，然而其具体的生物合成途径及其调控仍不明确。总结以往的报道，在酪醇的生物合成上主要存在两种观点：一是酪醇可能来自于苯丙烷代谢途径产生的4-香豆酸（4-coumaric acid）前体;二是来自于酪氨酸的酪胺（tyramine）可能是酪醇生物合成的直接前体。我们的工作兴趣主要围绕着鉴别高山红景天中的酪醇生物合成途径展开： 高山红景天内源苯丙氨酸解氨酶PALrs1的过表达对红景天甙积累的影响 红景天甙是来自于药用植物高山红景天的一种适应原性新型药物，其生物合成途径可能起始于苯丙氨酸或酪氨酸。由于高山红景天野生植物资源的匮乏和相对含量很低，阐明红景天甙的生物合成途径对于增加红景天甙的供给至关重要。在我们以前的工作中，运用cDNA末端快速扩增技术（RACE），一个编码苯丙氨酸解氨酶phenylalanine ammonia-lyase (PAL)的cDNA从高山红景天中被克隆，命名为PALrs1。在本研究中，PALrs1置于35S启动子+Ω增强子序列的控制下通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化回高山红景天。PCR 和 PCR–Southern blot分析结果表明，PALrs1已经整合到了转基因植物的基因组上。Northern blot杂交结果表明，PALrs1已经获得在转录水平上的高水平表达。与预期的结果相同，高效液相色谱High-performance liquid chromatography (HPLC)测定结果显示PALrs1的过表达引起4-香豆酸含量增长3.3倍。然而，与之相反的是，酪醇和红景天甙含量与对照相比反而分别下降4.7和7.7倍。此外，我们发现PALrs1的过表达造成酪氨酸含量下降2.6倍。这些数据暗示着PALrs1的过表达和4-香豆酸的积累并不能促进酪醇的生物合成。酪醇，作为一种苯乙烷类衍生物并非来自苯丙氨酸，而酪氨酸含量的下降则极有可能是酪醇生物合成和红景天甙积累大规模下降的直接原因。

一氧化氮在磷酸盐调节拟南芥根系形态变化中的作用

磷缺乏已成为制约世界农业生产的重要因子。植物根系的大小和形态是决定植物吸收土壤磷能力的重要因素，而且根系的生长发育与磷素的分布及其有效性密切相关。关于磷酸盐调节植物根系生长研究已有很多报道，但其生理和分子机制仍不清楚。一氧化氮 (NO) 是一种重要的气体信号分子，参与调控植物的生长发育和对多种逆境胁迫的应答反应。本文选用拟南芥为实验材料，研究探讨了NO与缺磷诱导的拟南芥根系形态变化之间的关系，主要结果如下： 用正常磷水平 (1 mM) 和低磷水平 (1 µM) 处理拟南芥幼苗，发现低磷抑制主根伸长，刺激侧根发生。外源NO供体销普纳 (SNP) 也抑制主根、刺激侧根生长，与低磷诱导根系形态变化相似。NO清除剂c-PTIO和一氧化氮合成酶 （NOS）抑制剂L-NNA均可部分减缓由低磷引起的对主根生长的抑制和对侧根的刺激作用。暗示低磷诱导的拟南芥根系形态的变化可能与NO含量的降低有关。 利用NO荧光标记物DAF-FM和激光共聚焦显微成像技术，本研究发现缺磷6 h和24 h后根细胞内源NO含量显著增加，而且NOS 抑制剂能减少低磷诱导的根细胞NO含量的增加。与正常供磷处理相比，低磷处理6 h和24 h，拟南芥根中编码与NO合成相关的基因（AtNOA1）的表达量增加，缺磷24 h后根中NOS酶活性升高。为了明确低磷诱导的NO 增加是否与硝酸还原酶（NR）介导的NO合成有关，本论文进一步研究了低磷对拟南芥硝酸还原酶活性和编码NR基因 （AtNR1和AtNR2）表达的影响。研究发现低磷处理6 h和24 h后和AtNR1和AtNR2基因的表达均没有变化，且蛭石中生长的拟南芥缺磷1个月后NR活性也没有发生变化;拟南芥的NR双突变体nia1，nia2在低磷处理24 h后，其根中的内源NO含量表现出与野生型相同的增加。因此这些研究结果表明，缺磷后拟南芥根细胞NO的含量增加主要由于NOS的活性升高，而与NR介导的NO合成无关。 已有资料表明低磷诱导植物根细胞内源过氧化氢（H2O2）分布和含量的变化。本论文研究了低磷处理对用H2O2标记物CM-H2DCFDA标记不同磷处理下的拟南芥根中的H2O2。研究发现，缺磷6 h根中H2O2的分布无明显变化，缺磷24 h后H2O2呈斑块状分布，且多集中在根尖伸长区。缺磷24 h后，叶片中的抗氧化保护酶—超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性没有明显变化。说明缺磷24 h 后产生的H2O2没有引起氧化胁迫，而是作为一种信号分子，与NO相互作用共同介导低磷胁迫的应答反应。关于NO与H2O2在低磷诱导的根形态变化中的信号转导过程还有待进一步研究。

植物体内谷胱甘肽还原酶的功能研究

谷胱甘肽还原酶（GR，EC1.6.4.2）是一重要的抗氧化酶，许多生理学和遗传工程研究都证明GR酶在抗氧化中的重要作用。但改变GR酶怎样影响植物的抗氧化系统却不清楚。GR是抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径中的重要组成部分，其功能必然与其密切相关。本文用RNAi技术获得具有较低GR酶活性的转基因烟草，系统测定了非胁迫条件和胁迫条件下抗坏血酸－谷胱甘肽循环的变化，得出以下主要结果： 1．选择一烟草叶绿体GR酶编码基因（X76293, gi: 431954）进行RNAi载体构建，构建好的双元载体转化根癌农杆菌LBA4404，然后侵染转化烟草叶圆片。获得的转基因烟草具有30－70％的GR酶活性。分子检测结果表明GR在RNA和蛋白水平上与GR酶活性的变化一致。文中我们第一次用2-D电泳对烟草中GR同工酶进行分析，并确定发生抑制的GR同工酶在细胞中的定位。2-D电泳后的Western杂交检测到烟草的10种GR同工酶，pI值分布在4.5-6.3，其中3种GR同工酶定位在叶绿体内，其蛋白量占据所有GR酶含量的大部分。RNAi发生在叶绿体内和叶绿体外，表明发生抑制的GR同工酶的基因序列具有很高的同源性。igr转基因烟草在表型上与野生型对照烟草无明显差异。 2．所有igr转基因植株和对照植株中的活性氧（O2-和H2O2）、MDA含量和光合作用都无明显差异，表明正常生长条件下GR酶活性的降低不会引起氧化胁迫。测定正常生长条件下igr转基因烟草中谷胱甘肽库的变化。结果表明与对照烟草相比，GR酶活性降低70％会引起转基因植株中GSH/GSSG比率明显降低，而GSH和GSSG的含量稍有增加；测定抗坏血酸－谷胱甘肽循环的变化，结果显示igr转基因烟草中DHAR和MDHAR的酶活性升高，表明非胁迫条件下较低的GR酶活性可能会诱导抗坏血酸－谷胱甘肽循环不能正常的运转。这一作用可能与改变的谷胱甘肽库有关。GR酶活性降低30％的转基因烟草中未检测到这些变化，表明70％的GR酶活对于非胁迫条件下igr转基因烟草可能是足够的。 3. MV处理结果显示，igr转基因烟草的离体叶圆片和活体植株在MV处理后都发生比对照烟草严重的光漂白作用。igr转基因烟草的活性氧和MDA含量明显高于对照烟草，igr转基因烟草的光合作用明显低于对照烟草。以上这些指标表明igr转基因烟草对MV处理更为敏感。MV处理条件下igr转基因烟草谷胱甘肽的含量明显高于对照烟草，但是GSH/GSSG的比率明显低于对照烟草，GR酶活性仍明显低于对照烟草，表明在MV胁迫条件下igr转基因烟草中较低的GR酶活性不能有效的将GSSG还原生成GSH。igr转基因烟草中较高的谷胱甘肽净含量说明其谷胱甘肽的合成能力提高，但这仍不能补偿胁迫条件下较低GR酶引起的GSH/GSSG比率降低。MV处理条件下igr转基因烟草和对照烟草相比ASC的含量大大降低，导致DHA/ASC明显升高。测定MDHAR和DHAR的结果表明，MV处理后igr转基因烟草的MDHAR酶活性明显降低，这表明较低的GR酶活性引起ASC再生循环受到抑制。MV处理后较低的GR酶还引起igr转基因烟草中APX的活性大大降低。以上这些结果表明MV处理条件下降低GR酶活性会削弱抗坏血酸－谷胱甘肽循环，从而引起活性氧的大量积累，造成严重的氧化伤害。 4．低温处理的结果和MV处理的结果稍有不同。在GR酶活性较高的i2转基因烟草中所有检测指标与对照烟草无明显差异。而GR酶活性较低的i21、i28和i42植株与对照烟草相比表现出明显差异。低温下生长的对照烟草叶绿素含量明显高于i21、i28和i42植株。i21、i28和i42中活性氧（O2-和H2O2）和MDA的含量都明显高于对照烟草，表明低温处理下i21、i28和i42受到更严重的胁迫伤害。与MV处理后的变化相似，低温处理后i21、i28和i42中较低的 GR酶活性导致GSH/GSSG大大降低，ASC再生循环受抑制，APX活性明显降低，从而使抗坏血酸－谷胱甘肽循环不能高效的清除活性氧，导致ROS和MDA的大量积累，造成严重的低温伤害。

小麦WHM基因的抗性分析

植物抗病研究一直是科学领域的一个热点，它不仅能从形态结构到分子基础对植物抗病进行机理的阐释，而且能够直接应用于农业生产，提高农业产值。 玉米基因组中Hm基因是编码一种依赖NADPH的HC-toxin 还原酶。Hm基因的序列和玉米，矮牵牛及金鱼草中的二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol -4- reductase，DFR)基因的序列具有较高的同源性；对水稻中Hm同源基因YK1的研究表明，过表达YK1后植物抗胁迫能力增强。本实验室从小麦中克隆得到了Hm同源基因WHM，由于在双子叶植物中不含有Hm的同源基因，为了检测WHM在双子叶植物中是否具有生物学功能，我们选取了烟草为模式植物进行了相关研究。 WHM基因cDNA全长1255bp，编码361个氨基酸，WHM基因序列与Hm基因序列具有78%的同源性。为分析此基因在双子叶植物中的功能，我们构建了WHM基因的pBI121植物表达载体，并通过农杆菌介导叶圆片法转化烟草，成功获得了转基因植株。同时我们还构建了WHM基因的原核表达载体并成功诱导了WHM蛋白的表达。对转基因烟草进行抗病与抗盐实验，实验结果表明，对烟草叶片接种烟草黑胫病菌后，转基因烟草的抗病能力显著性的高于对照烟草；烟草叶片接种黑胫病菌后，与对照烟草相比，转基因烟草积累了更多的H2O2，具有更高的POD活性。烟草种子在含不同浓度NaCl的培养基上萌发一定时间后，发现对照烟草的根长变化倍数高于转基因烟草的根长变化倍数，说明转基因烟草对NaCl浓度变化不敏感，尤其是在高浓度时，转基因烟草的生长状态明显好于对照烟草。我们还对IPTG诱导的WHM基因的原核表达载体表达的总蛋白进行了DFR活性的检测，结果表明WHM蛋白在总蛋白中能够竞争性的结合NADPH，但是由于蛋白没有进行纯化，其是否具有DFR的活性还不能确定。

水杨酸在水稻抗冷性中的作用

近年来大量研究表明水杨酸（salicylic acid, SA）在植物抵抗生物胁迫与非生物胁迫中都发挥着重要作用。然而在一些单子叶植物如水稻中SA的作用迄今仍不是很清楚。为了更深入地了解SA在水稻抵御冷胁迫中的作用，本研究选用两个抗冷性不同的水稻品种：‘长白九’（Oryza sativa cv. ‘Changbaijiu’）和‘中鉴’（Oryza sativa cv. ‘Zhongjian’）作为实验材料，其中‘长白九’为抗冷性较强的品种，而‘中鉴’为冷敏感的品种。在水稻幼苗长至三叶期后，分别对其施以三种浓度（0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM）的SA溶液预处理24 h，然后置于5 °C下进行冷处理24 h。形态学观察及各项指标的测定结果表明： 一、冷处理后，‘长白九’和‘中鉴’根与叶片中的SA含量都大幅提高，且结合态SA升高的幅度明显大于其自由态形式。 二、外施不同浓度的SA溶液于水稻根部，24 h后，大量SA尤其是结合态SA积累于根中，且其积累量与处理浓度成正相关;而叶片中积累的SA则较少。 三、形态学及生理指标的测定结果显示，SA预处理没有提高甚至降低了两个水稻品种幼苗的抗冷性。并且SA处理浓度越大，幼苗受到冷伤害程度的越高。 四、对水稻幼苗叶片与根中的抗氧化酶活性进行分析发现，常温下SA处理显著提高了‘长白九’和‘中鉴’根中过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）的活性;而在低温下SA预处理反而降低了两种水稻叶片与根中部分抗氧化酶的活性，推测低温下抗氧化酶活性的下降可能与水稻幼苗抗冷性的降低有关。 五、尽管两个水稻品种具有不同的冷敏感性，然而外施水杨酸均加剧了其低温伤害。分析认为，外施水杨酸后，水稻根部大幅升高的内源SA水平可能加剧了活性氧的产生，破坏了植物细胞内部的氧化还原平衡，从而导致水稻幼苗受到的冷害加重。

增强UV-B辐射下一氧化氮对小球藻氮素代谢和类囊体的保护作用

由于到达地球表面的紫外线B辐射不断加强,生物生长受到了威胁。UV-B的增强改变了生物体赖以生存的环境,影响了藻类生物生长,抑制了其光合作用。以BG11为培养基,在室内培养的条件是光照强度为60μmol·m-2s-(1昼夜比为12h∶12h),温度为26℃,研究了一氧化氮(NO)在增强UV-B(强度为0.2J·m-2s-1)辐射下的对小球藻的作用。测定了小球藻的硝酸还原酶(NR,nitrate reductase)、亚硝酸还原酶(NiR,nitrite reductase)、谷胱甘肽还原酶(GS,gluta