转基因植物生产生物可降解塑料PHB的研究-phbA功能鉴定、多价表达载体的构建及转基因植物的获得

聚-β-羟基链烷酸（PHA）是许多微生物作为碳源、能源的一类贮藏性聚酯，具有广泛的应用价值。该聚酯可被微生物完全降解且有与塑料相似的性质，因而研究并提高PHA在植物中的合成为解决环境污染提供了新的解决途径。 聚-β-羟基于酸酯（PHB）是研究的最早、研究的最清楚的一种PHA。用聚合酶链式反应扩增并克隆了真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）中合成PHB的一个关键酶——3-酮硫裂解酶基因phbA。DNA序列分析表明所克隆的基因与国外报道序列同源性很高，只有一个碱基对的区别。为了检测该基因的功能及导肽的定位效率，构建了带有导肽基因的组成型表达载体，由根癌农杆菌介导转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38）得到转基因植株。蛋白质电泳结果表明导肽可以将外源蛋白定位于质体，phbA基因能翻译成相应大小的蛋白。酶活性分析证实了转基因烟草中phbA编码的3-酮硫裂解酶可以催化乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA。 将携有导肽序列的phbC（编码PHB合酶）和phbB（编码乙酰乙酰-CoA还原酶）连入pBIB-HYG得到组成型表达载体pZCB，用冻融法转入根癌农杆菌，介导转化烟草。烟草为已获得的具有卡那霉素抗性整合并表达phbA的转基因烟草。通过二次转化将携有潮霉素抗性的phbB基因和phbC基因导入已整合phbA的烟草，各基因均由质体导肽控制，最后得到整合PHB合成的三个酶基因的转基因烟草。转基因烟草经PCR、PCR-Southern检测，初步确定整合phbB和phbC烟草植株。以气相色谱初步分析，转基因烟草中PHB的含量可达鲜重的0.233%。 结果表明phbB和phbC基因可以在真核表达系统中编码相应的蛋白。通过色素分析、荧光动力学等手段分析了PHB在叶绿体中的累积对其功能的影响。 为了提高底物乙酰-CoA的供应能力及减少惰性聚酯对植物体的伤害，分离了种子特异性启动子和质体导肽序列，利用忆经克隆的合成PHB的三个关键酶基因，通过一系列DNA重组，分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合phbC、phbB的二价表达载体pSCB及嵌合phbC、phbA、phbB的三价表达载体pSCAB，并由导肽将基因表达产物定位于质体。经根癌农杆菌介导转化油菜（Brassica napus L.) H165，获得转基因油菜植株，并进行了PCR、Southern blot及RT-PCR-DNA杂交等分检测。结果表明，三基因已经分别整合到相应的转基因油菜中，并已在转录水平表达。同时转化了油菜不育系、恢复系和保持系，获得批量转化株，并移入温室栽培。

羊草生殖生物学研究

羊草 (Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. ) ，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性的有关机理。本论文的主要结果如下： 1. 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6 个羊草居群为材料，测定得知开放授粉时的结实率在6.5% - 56.7%之间，自交时结实率为0.6% - 4.3%，差异极其显著; FDA 染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到92.2% 以上;在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和自花授粉;花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5.5%-11.7% 是亲和的，杂交花粉亲和率达到了60.0%-84.8%，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延伸。 2. 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0 % - 6.9 %，杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点（47.5％ - 96.0 %），且正反交结果具有一定的一致性（88.2％），表现出配子体遗传特性。 3. 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4.6%，18.1% 和35.7%，株间的变异系数分别为33.4%，21.2%和17.1%，这些株间的变异均达到统计上的显著差异;同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4. 分离了羊草硫氧化还原蛋白 H 基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克隆了ThioLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包括3 个内含子和4 个外显子，与水稻Thio h 的cDNA 序列相比，具有 32.0% 的同源性;Southern 杂交显示 ThioLc 在羊草基因组中是单拷贝;Northern 杂交显示 ThioLc 在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达, 在成熟雌蕊和幼小的花粉中微量表达, 在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H 基因具有花粉特异表达特点。 5. 原核表达的ThioLc 蛋白具有较高的催化活性。构建了ThioLc 基因的原核表达载体，检测证明ThioLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白，纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应，结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。

果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理

用生物和非生物因子来进行采后病害的防治，是一个非常有效的方法。诱导抗性作为控制果蔬采后病害的生物技术，已成为该领域的一个研究热点。然而诱导抗性的机制非常复杂，涉及到寄主、病原菌、激发子之间的相互作用关系。本研究主要利用酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和SA处理果实，观察其抗性诱导表达和对采后青霉病菌（Penicillium expansum）的抑制作用，并从蛋白质组学水平上对诱导抗性的机理进行了分析。研究结果表明： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens (5 × 107 cells·ml-1)和SA(0.5 mM)处理采后甜樱桃果实，能够明显地降低病害的发病率和病斑直径。酵母菌和SA处理影响到了果实抗氧化酶的活性，同时还改变了POD同工酶谱和甜樱桃果实的总蛋白含量，并诱导了新的蛋白质条带产生。用光学显微镜和扫描电子显微镜技术观察发现，在in vitro条件下P. membranefaciens能够紧密地结合与病原菌的菌丝，而在in vivo条件下这种结合较为松散。 2、借鉴其它模式植物的方法，我们建立了一整套适用于多汁类植物材料的蛋白质组学研究方法。对于芒果，桃，甜樱桃、苹果以及冬枣等果实，都取得了重复性非常好的2-D图谱。我们应用该技术进一步研究了P. membranefaciens (1 × 108 cells·ml-1)以及SA (0.5 mM)处理对桃果实蛋白质组的诱导影响。结果显示，两种激发子处理都能够诱导桃果实产生抗性，从而减轻青霉病引起的腐烂。在诱导处理1 d以后，酵母拮抗菌和SA分别诱导22和16个蛋白的差异表达。质谱鉴定的蛋白属于6大类：代谢，防御反应，转录，能量途径以及细胞结构。有6个蛋白受到两种激发子的共同调控。其中，4种蛋白(包括glutathione peroxidase, polyphenol oxidase precursor, catalase和methionine sulfoxide reductase) 属于抗氧化蛋白，涉及到活性氧代谢。另2个蛋白（Major allergen Pru av 1和peroxidase）是病程相关蛋白，直接参与植物的防御反应。同时一些磷酸化酶和转录因子也受到两种激发子的调节从而参与果实的抗病反应。酶学测定和Northern杂交的结果表明，拮抗菌与SA处理均能影响过氧化氢酶活性及其基因的表达。 3、采前用较高浓度SA (2 mM) 短时间（10s）处理不同成熟期的甜樱桃果实，能够明显降低果实青霉病的病斑直径，并能减轻较低成熟度果实的发病率。在没有接菌的情况下，SA诱导了33个差异表达的蛋白，其中用质谱鉴定出了26个。而在接种病原菌的情况下，SA诱导了19个差异表达的蛋白，并鉴定出了其中的12个。这些蛋白分别涉及到代谢、防御反应、转录、能量途径、信号转导等过程。在没有接种病原菌的情况下，SA处理诱导了Putative DnaJ heat shock protein, PR1-like protein, Peroxidase, Major allergen Pru av 1 (Pru a 1)和Catalase等与抗病有关的蛋白。而在接种病原菌的情况下，诱导了PR1-like protein, Peroxidase和Catalase蛋白的差异表达。通过酶活性测定以及对细胞学定位的研究，我们发现在没有接种病原菌的情况下，POD的活性受到SA的诱导。但是在接种病原菌以后，诱导效果不明显。

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难;加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受关注,而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶（flavonol synthase）竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA文库中筛选到一个编码该酶的cDNA序列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA编码342个氨基酸;Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊（Callistephus chinensis）的相似性最高，达87%;SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA为编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR）。为了得到SmDFR的DNA序列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA序列，该序列包含五个内含子和六个外显子。 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana) DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能;目前，此实验尚在进行之中。

近零磁场对拟南芥生长发育影响初探及趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum）铁还原酶基因 MmFre 的克隆和功能分析

地磁场伴随着生命的起源、发生和进化，地球上的一切生命无时无刻不处于地球磁场中。地球自诞生以来，地磁场的强度一直在细微变化，但地磁场强度减弱会对植物产生什么样的直接影响尚知之甚少。随着对太空探索的不断发展，人类越来越需要了解处于零磁场环境的太空中生物的适应性。近零磁场是地磁场的恒定组分降低为零或者接近零的空间。本论文利用近零磁场环境探索了地磁场减弱对拟南芥整个生长周期的影响，开展了近零磁场下拟南芥短期生长试验，主要包括种子的萌发、暗培养、根生长、幼苗鲜重和根向重性分析，以及对近零磁场下拟南芥整个生长周期的表型进行了观察统计分析。结果发现(1)无论在光照还是暗培养的环境中，近零磁场对拟南芥种子的萌发、幼苗根的伸长、鲜重变化以及根向重性等的影响较小。(2)对拟南芥整个生长周期过程中表型变化进行的观察和统计分析发现：近零磁场环境中，拟南芥可以完成正常的生活史;但植株开花时间推迟、开花持续时间延长、枝条数减少、植株高度受到了抑制，种子千粒重降低。表明近零磁场对拟南芥营养生长的影响较小，而对生殖生长的影响较明显，暗示地磁场作为环境因子可能参与影响植物的生殖生长。 趋磁细菌(Magnetospirillum magneticum)是一种可以沿磁力线方向运动的特殊的细菌，其胞内铁含量是菌体干重的3％，是非磁性细菌的数百倍，其中的铁主要以Fe3O4/Fe3S4 形式存在于磁小体(magnetosome) 中。趋磁细菌主要通过分泌转铁载体吸收环境中的三价铁。在磁小体合成过程中，三价铁还原为二价是一个必需的过程，因而铁还原酶在趋磁细菌的铁还原过程中可能起着重要的作用。我们以趋磁细菌AMB-1 为材料，克隆了预测的铁还原酶基因，命名为MmFre ，并在内源铁还原酶活性较低的酵母突变株S288C fre1 fre2 中进行异源超表达，对其铁还原活性进行了初步分析;同时结合GFP 融合蛋白技术对该基因的表达产物进行了酵母的亚细胞定位。结果表明：(1)利用生物信息学分析发现，MmFre 基因编码区含有1335 bp，编码444 个氨基酸残基;氨基酸序列中含有一个FAD 结合位点，并具有6 个跨膜结构域;(2)该基因在酵母表达后利用酵母活体进行酶活性检测发现，其铁还原酶活性是对照组的4 倍，暗示该基因在真核生物中的表达产物可以执行铁还原的功能;(3)利用激光共聚焦显微镜观察发现该基因的表达产物与GFP 构成的融合蛋白广泛的定位在细胞的膜上。因而，MmFre 基因的表达产物确实具有铁还原酶活性，且没有膜特异性分布，其对趋磁细菌磁小体生物合成中铁的还原可能起着重要作用。

水稻灌浆期籽粒与 胚乳发育的蛋白质组学分析

籽粒的灌浆是将光合器官合成的有机物贮存在籽粒中的过程。这一过程直接决定了籽粒的产量及品质。先前研究表明灌浆籽粒中贮存物质的累积是各种代谢活动和细胞学过程协同作用的结果，但灌浆的分子机制目前还不是非常清楚。水稻是研究籽粒灌浆的优良模式材料，不仅因为它是世界上最重要的淀粉食物来源，更重要的是其全基因组的测序完成为分子机制的研究带来极大的便利。我们对发育水稻籽粒的观察表明在开花后6 天，籽粒就已完成了胚的分化和胚乳的细胞化；此后籽粒经历了一个显著的细胞增大过程，并在开花后12 天左右达到成熟籽粒的大小；而籽粒的灌浆过程起始于开花后6 天，这个过程一直持续到开花后20 天。因此，我们将开花后6 天到20 天的籽粒分为8 个连续的发育阶段进行动态的蛋白质组分析，396个蛋白点的表达在灌浆过程中发生了两倍以上变化。质谱鉴定得到的345 个差异表达的蛋白划分为10 个不同的功能类别。其中新陈代谢类（45%）和蛋白合成/终点（destination）类（20%）两个功能类别中就包括了大多数的差异表达蛋白，预示着这两类蛋白在籽粒发育中的重要性。蛋白功能群的表达分析显示与淀粉合成和乙醇发酵相关的蛋白在发育过程中大幅度的上调，而与碳代谢中心过程（糖酵解和三羧酸循环）相关蛋白呈现明显的下调趋势。大多数的功能类或（亚类）也呈现出下调的表达趋势，如细胞生长/分裂类，蛋白合成类，水解类，信号传导类和转录类。蛋白表达分析的结果表明蛋白的表达随籽粒的发育发生了显著的变化，这些变化与籽粒在不同阶段的发育和代谢过程密切相关并协调一致，是细胞从生长分裂过渡到以淀粉合成为中心的物质基础。同时也说明代谢重点由中心碳代谢向乙醇发酵的转变对于籽粒的发育和淀粉的合成与累积具有重要意义。 籽粒发育的研究表明在长到成熟籽粒大小后（开花后12 天），籽粒的代谢集中到淀粉累积途径上，一直持续到进入脱水期（18 天），绝大多数淀粉合成相关蛋白在这期间到达表达的顶点。为了解淀粉累积关键时期淀粉合成关键部位（胚乳）的发育规律，我们进一步应用DIGE 技术对这一淀粉累积关键时期（灌浆中后期，开花后12 到18 天）的蛋白表达特性进行分析。细胞学的观察发现胚乳在灌浆后期先后经历了过氧化氢的爆发、半透明胚乳的形成以及胚乳细胞死亡事件。相应的DIGE 分析显示有321 个蛋白点在胚乳的后期发育中发生了显著的表达变化。细胞学的观察结合DIGE 分析显示胚乳的后期发育是一个典型的衰老过程：细胞结构的崩溃；氧化自由基的爆发；脱水干燥；蛋白、脂类和DNA 由同化作用向异化作用的代谢转化。与代谢转化相伴随的细胞营养的重新分配是胚乳后期发育的一个显著过程。DIGE分析全面展示了参与营养重新分配相关蛋白在后期发育中的表达变化，为细胞学中观察到的有机物向淀粉的转化提供了清晰的蛋白水平的证据支持。在鉴定的差异表达蛋白中有2/3 的蛋白是已知的对氧化电位变化敏感的蛋白，表明由H2O2 爆发形成的氧化压力将引起氧化还原调控从而对胚乳的后期发育进行全面的影响。而其中与碳元素代谢相关的代谢途径中尤其富含氧化还原电位敏感的蛋白，表明后期的营养重新分配以及淀粉的累积受到氧化还原电位的紧密调控。另一方面，H2O2 的爆发激发了胚乳中的抗氧化体系。由抗氧化蛋白（如thioredoxin、抗坏血酸和超氧化物歧化酶等）、氧化还原敏感蛋白、代谢中间产物以及glyoxalase 构成的抗氧化体系在胚乳后期发育中协同作用调节氧化还原电位的变化，从而控制胚乳细胞衰老的节奏。另外，我们发现与RraA 相关的转录本的调控在胚乳发育末期急剧上调，在调控的代谢途径、调控时间以及调控的部位与氧化还原调控相重叠，并且支持RraA 活动有利于胚乳细胞对氧化压力的适应。所有这些结果表明内生的过氧化氢（或氧化自由基）在胚乳的后期发育和淀粉累积中起到核心的调控作用。

拟南芥砷酸还原酶基因AtACR2的表达调控及其功能分析

将砷酸盐还原为亚砷酸盐是植物砷代谢途径中的关键步骤，其中砷酸还原酶是催化砷酸盐还原的关键酶。目前，对植物中砷酸还原酶基因的表达调控机制及该基因的功能了解得还不是很清楚。因此研究拟南芥砷酸还原酶基因的表达调控及其功能对于探讨植物对砷吸收、代谢、转运和富集的分子机制有重要意义。 本论文利用拟南芥砷酸还原酶基因（AtACR2）的启动表达调控序列的不同组合驱动GUS基因转录表达，对AtACR2启动表达调控序列的功能进行了分析；同时利用过表达、AtACR2基因T-DNA插入缺失突变体和地上部特异表达对拟南芥和蜈蚣草砷酸还原酶的基因功能进行了初步分析，主要结果如下： 1．对拟南芥AtACR2基因在不同砷酸盐处理浓度(0、100 yM、200 yM) 下的RT-PCR分析初步表明：在未用Na3As04处理的拟南芥幼苗中，AtACR2基因在根和茎叶中均有表达，且其在根中的转录水平高于茎叶中。同时该基因的表达在转录水平上受砷酸盐的负调控，即随着外界砷酸盐浓度的升高，AtACR2基因的转录水平降低。 2．将AtACR2基因不同启动调控序列组合驱动GUS基因转录表达，结果表 明：①由AtACR2基因上游1250 bp及其5’端非编码医构成的启动调控序列不足以启动AtACR2基因的转录表达和砷酸盐胁迫的应答；②在第一外显子和第一内含子中存在启动AtACR2基因起始转录表达的关键序列元件，它们的存在决定了该基因能否得以转录表达；⑧第一外显子和第一内含子序列中不仅存在起始基因转录的必需元件，还存在砷胁迫相关的应答元件，参与砷酸盐抑制AtACR2基因的转录表达调控；④在第二外显子和第二内含子中可能存在增强基因表达的调控元件序列，进一步影响该基因转录表达强度的调控。 3． 拟南芥AtA CR2基因和砷超富集植物蜈蚣草PvA CR2基因在拟南芥中过表达后的功能分析初步表明：①转基因植株能够通过减少体内As含量增强对砷酸盐的抗性；②两种植物的砷酸还原酶作用能力存在一定差异，其中超表达蜈蚣草PvA CR2能够使转基因植株根中As含量更少，但其对砷酸盐胁迫的抗性并没有AtACR2超表达植株强，这可能与转 PvA CR2基因植株地上部积累相对较高的砷含量有关。 4．将AtA CR2和PvA CR2在拟南芥中地上部特异表达后，抗性实验初步表明：①以野生型拟南芥为背景材料进行地上部特异超表达AtACR2或PvA CR2基因，不能增强转基因植株对砷酸盐抗性；②以AtA CR2基因的T-DNA插入缺失突变体为背景材料地上部特异表达AtACR2或PvA CR2基因，却能够明显增强转基因植株对砷酸盐的抗性。综上所述，植物砷酸还原酶基因在植物对砷酸盐胁迫的响应和调控中起着重要作用。

参与调控拟南芥叶绿体发育基因的初步功能研究

绿色植物的光合作用是地球上唯一大规模地把无机物转变为有机物，把光能转变为化学能的过程。叶绿体是植物进行光合作用的场所。因而，高等植物叶绿体发育与叶绿体功能维持的研究一直倍受人们关注。然而，目前参与高等植物中调控叶绿体发育过程的基因克隆以及这些基因在叶绿体发育过程中的分子机制知之甚少。本论文克隆并初步探讨了2个参与调控拟南芥叶绿体发育基因AtECB1和AtECB2。AtECB1基因编码一个高等植物所特有的，具有类似硫氧还蛋白结构的叶绿体蛋白质。该基因主要在地上部分表达，尤其在14天的幼苗中表达较强，且该基因的表达是受光诱导的。该基因的敲除导致了拟南芥叶绿体中仅有少数片层结构。这些片层不能进一步形成类囊体结构。蛋白质免疫实验表明，突变体中多数光合作用蛋白质复合物的组分缺失。该基因的突变影响了质体转录，翻译和光合作用相关的基因的表达。基于这些结果我们推测，AtECB1可能是叶绿体发育过程中所必需的。而AtECB2基因则编码一个PPR家族的叶绿体蛋白质。该蛋白质具有11个PPR基序；此外，该蛋白质含有E/E+和DYW结构域。因而，AtECB2属于PPR家族中的DYW群。AtECB2敲除突变体表现为白化表型，该突变体中的叶绿体没有正常的类囊体结构，仅存在少量的膜结构。与电镜的结果相一致，蛋白质免疫实验表明突变体中多数光合作用蛋白质复合物的组分缺失。定量RT-PCR结果表明，AtECB2的缺失影响了叶绿体基因的表达。另外，我们对该突变体中的已经报道的34个RNA编辑位点分析发现其中的一个位点accD没有发生编辑。AccD编码异质型乙酰辅酶A羧化酶的羧基转移酶β亚基。而前人的实验表明，该位点的RNA编辑为其所编码的蛋白质活性所必需，且accD的缺失直接影响到植物叶绿体的发育。综合这些数据和本论文的结果表明，AtECB2是质体转录本accD的RNA编辑所必需的特异因子；accD RNA编辑的缺陷可能导致了叶绿体发育的缺陷。

一氧化氮在磷酸盐调节拟南芥根系形态变化中的作用

磷缺乏已成为制约世界农业生产的重要因子。植物根系的大小和形态是决定植物吸收土壤磷能力的重要因素，而且根系的生长发育与磷素的分布及其有效性密切相关。关于磷酸盐调节植物根系生长研究已有很多报道，但其生理和分子机制仍不清楚。一氧化氮 (NO) 是一种重要的气体信号分子，参与调控植物的生长发育和对多种逆境胁迫的应答反应。本文选用拟南芥为实验材料，研究探讨了NO与缺磷诱导的拟南芥根系形态变化之间的关系，主要结果如下： 用正常磷水平 (1 mM) 和低磷水平 (1 µM) 处理拟南芥幼苗，发现低磷抑制主根伸长，刺激侧根发生。外源NO供体销普纳 (SNP) 也抑制主根、刺激侧根生长，与低磷诱导根系形态变化相似。NO清除剂c-PTIO和一氧化氮合成酶 （NOS）抑制剂L-NNA均可部分减缓由低磷引起的对主根生长的抑制和对侧根的刺激作用。暗示低磷诱导的拟南芥根系形态的变化可能与NO含量的降低有关。 利用NO荧光标记物DAF-FM和激光共聚焦显微成像技术，本研究发现缺磷6 h和24 h后根细胞内源NO含量显著增加，而且NOS 抑制剂能减少低磷诱导的根细胞NO含量的增加。与正常供磷处理相比，低磷处理6 h和24 h，拟南芥根中编码与NO合成相关的基因（AtNOA1）的表达量增加，缺磷24 h后根中NOS酶活性升高。为了明确低磷诱导的NO 增加是否与硝酸还原酶（NR）介导的NO合成有关，本论文进一步研究了低磷对拟南芥硝酸还原酶活性和编码NR基因 （AtNR1和AtNR2）表达的影响。研究发现低磷处理6 h和24 h后和AtNR1和AtNR2基因的表达均没有变化，且蛭石中生长的拟南芥缺磷1个月后NR活性也没有发生变化;拟南芥的NR双突变体nia1，nia2在低磷处理24 h后，其根中的内源NO含量表现出与野生型相同的增加。因此这些研究结果表明，缺磷后拟南芥根细胞NO的含量增加主要由于NOS的活性升高，而与NR介导的NO合成无关。 已有资料表明低磷诱导植物根细胞内源过氧化氢（H2O2）分布和含量的变化。本论文研究了低磷处理对用H2O2标记物CM-H2DCFDA标记不同磷处理下的拟南芥根中的H2O2。研究发现，缺磷6 h根中H2O2的分布无明显变化，缺磷24 h后H2O2呈斑块状分布，且多集中在根尖伸长区。缺磷24 h后，叶片中的抗氧化保护酶—超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性没有明显变化。说明缺磷24 h 后产生的H2O2没有引起氧化胁迫，而是作为一种信号分子，与NO相互作用共同介导低磷胁迫的应答反应。关于NO与H2O2在低磷诱导的根形态变化中的信号转导过程还有待进一步研究。

植物体内谷胱甘肽还原酶的功能研究

谷胱甘肽还原酶（GR，EC1.6.4.2）是一重要的抗氧化酶，许多生理学和遗传工程研究都证明GR酶在抗氧化中的重要作用。但改变GR酶怎样影响植物的抗氧化系统却不清楚。GR是抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径中的重要组成部分，其功能必然与其密切相关。本文用RNAi技术获得具有较低GR酶活性的转基因烟草，系统测定了非胁迫条件和胁迫条件下抗坏血酸－谷胱甘肽循环的变化，得出以下主要结果： 1．选择一烟草叶绿体GR酶编码基因（X76293, gi: 431954）进行RNAi载体构建，构建好的双元载体转化根癌农杆菌LBA4404，然后侵染转化烟草叶圆片。获得的转基因烟草具有30－70％的GR酶活性。分子检测结果表明GR在RNA和蛋白水平上与GR酶活性的变化一致。文中我们第一次用2-D电泳对烟草中GR同工酶进行分析，并确定发生抑制的GR同工酶在细胞中的定位。2-D电泳后的Western杂交检测到烟草的10种GR同工酶，pI值分布在4.5-6.3，其中3种GR同工酶定位在叶绿体内，其蛋白量占据所有GR酶含量的大部分。RNAi发生在叶绿体内和叶绿体外，表明发生抑制的GR同工酶的基因序列具有很高的同源性。igr转基因烟草在表型上与野生型对照烟草无明显差异。 2．所有igr转基因植株和对照植株中的活性氧（O2-和H2O2）、MDA含量和光合作用都无明显差异，表明正常生长条件下GR酶活性的降低不会引起氧化胁迫。测定正常生长条件下igr转基因烟草中谷胱甘肽库的变化。结果表明与对照烟草相比，GR酶活性降低70％会引起转基因植株中GSH/GSSG比率明显降低，而GSH和GSSG的含量稍有增加；测定抗坏血酸－谷胱甘肽循环的变化，结果显示igr转基因烟草中DHAR和MDHAR的酶活性升高，表明非胁迫条件下较低的GR酶活性可能会诱导抗坏血酸－谷胱甘肽循环不能正常的运转。这一作用可能与改变的谷胱甘肽库有关。GR酶活性降低30％的转基因烟草中未检测到这些变化，表明70％的GR酶活对于非胁迫条件下igr转基因烟草可能是足够的。 3. MV处理结果显示，igr转基因烟草的离体叶圆片和活体植株在MV处理后都发生比对照烟草严重的光漂白作用。igr转基因烟草的活性氧和MDA含量明显高于对照烟草，igr转基因烟草的光合作用明显低于对照烟草。以上这些指标表明igr转基因烟草对MV处理更为敏感。MV处理条件下igr转基因烟草谷胱甘肽的含量明显高于对照烟草，但是GSH/GSSG的比率明显低于对照烟草，GR酶活性仍明显低于对照烟草，表明在MV胁迫条件下igr转基因烟草中较低的GR酶活性不能有效的将GSSG还原生成GSH。igr转基因烟草中较高的谷胱甘肽净含量说明其谷胱甘肽的合成能力提高，但这仍不能补偿胁迫条件下较低GR酶引起的GSH/GSSG比率降低。MV处理条件下igr转基因烟草和对照烟草相比ASC的含量大大降低，导致DHA/ASC明显升高。测定MDHAR和DHAR的结果表明，MV处理后igr转基因烟草的MDHAR酶活性明显降低，这表明较低的GR酶活性引起ASC再生循环受到抑制。MV处理后较低的GR酶还引起igr转基因烟草中APX的活性大大降低。以上这些结果表明MV处理条件下降低GR酶活性会削弱抗坏血酸－谷胱甘肽循环，从而引起活性氧的大量积累，造成严重的氧化伤害。 4．低温处理的结果和MV处理的结果稍有不同。在GR酶活性较高的i2转基因烟草中所有检测指标与对照烟草无明显差异。而GR酶活性较低的i21、i28和i42植株与对照烟草相比表现出明显差异。低温下生长的对照烟草叶绿素含量明显高于i21、i28和i42植株。i21、i28和i42中活性氧（O2-和H2O2）和MDA的含量都明显高于对照烟草，表明低温处理下i21、i28和i42受到更严重的胁迫伤害。与MV处理后的变化相似，低温处理后i21、i28和i42中较低的 GR酶活性导致GSH/GSSG大大降低，ASC再生循环受抑制，APX活性明显降低，从而使抗坏血酸－谷胱甘肽循环不能高效的清除活性氧，导致ROS和MDA的大量积累，造成严重的低温伤害。

小麦WHM基因的抗性分析

植物抗病研究一直是科学领域的一个热点，它不仅能从形态结构到分子基础对植物抗病进行机理的阐释，而且能够直接应用于农业生产，提高农业产值。 玉米基因组中Hm基因是编码一种依赖NADPH的HC-toxin 还原酶。Hm基因的序列和玉米，矮牵牛及金鱼草中的二氢黄酮醇-4-还原酶(Dihydroflavonol -4- reductase，DFR)基因的序列具有较高的同源性；对水稻中Hm同源基因YK1的研究表明，过表达YK1后植物抗胁迫能力增强。本实验室从小麦中克隆得到了Hm同源基因WHM，由于在双子叶植物中不含有Hm的同源基因，为了检测WHM在双子叶植物中是否具有生物学功能，我们选取了烟草为模式植物进行了相关研究。 WHM基因cDNA全长1255bp，编码361个氨基酸，WHM基因序列与Hm基因序列具有78%的同源性。为分析此基因在双子叶植物中的功能，我们构建了WHM基因的pBI121植物表达载体，并通过农杆菌介导叶圆片法转化烟草，成功获得了转基因植株。同时我们还构建了WHM基因的原核表达载体并成功诱导了WHM蛋白的表达。对转基因烟草进行抗病与抗盐实验，实验结果表明，对烟草叶片接种烟草黑胫病菌后，转基因烟草的抗病能力显著性的高于对照烟草；烟草叶片接种黑胫病菌后，与对照烟草相比，转基因烟草积累了更多的H2O2，具有更高的POD活性。烟草种子在含不同浓度NaCl的培养基上萌发一定时间后，发现对照烟草的根长变化倍数高于转基因烟草的根长变化倍数，说明转基因烟草对NaCl浓度变化不敏感，尤其是在高浓度时，转基因烟草的生长状态明显好于对照烟草。我们还对IPTG诱导的WHM基因的原核表达载体表达的总蛋白进行了DFR活性的检测，结果表明WHM蛋白在总蛋白中能够竞争性的结合NADPH，但是由于蛋白没有进行纯化，其是否具有DFR的活性还不能确定。

水杨酸在水稻抗冷性中的作用

近年来大量研究表明水杨酸（salicylic acid, SA）在植物抵抗生物胁迫与非生物胁迫中都发挥着重要作用。然而在一些单子叶植物如水稻中SA的作用迄今仍不是很清楚。为了更深入地了解SA在水稻抵御冷胁迫中的作用，本研究选用两个抗冷性不同的水稻品种：‘长白九’（Oryza sativa cv. ‘Changbaijiu’）和‘中鉴’（Oryza sativa cv. ‘Zhongjian’）作为实验材料，其中‘长白九’为抗冷性较强的品种，而‘中鉴’为冷敏感的品种。在水稻幼苗长至三叶期后，分别对其施以三种浓度（0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM）的SA溶液预处理24 h，然后置于5 °C下进行冷处理24 h。形态学观察及各项指标的测定结果表明： 一、冷处理后，‘长白九’和‘中鉴’根与叶片中的SA含量都大幅提高，且结合态SA升高的幅度明显大于其自由态形式。 二、外施不同浓度的SA溶液于水稻根部，24 h后，大量SA尤其是结合态SA积累于根中，且其积累量与处理浓度成正相关;而叶片中积累的SA则较少。 三、形态学及生理指标的测定结果显示，SA预处理没有提高甚至降低了两个水稻品种幼苗的抗冷性。并且SA处理浓度越大，幼苗受到冷伤害程度的越高。 四、对水稻幼苗叶片与根中的抗氧化酶活性进行分析发现，常温下SA处理显著提高了‘长白九’和‘中鉴’根中过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）的活性;而在低温下SA预处理反而降低了两种水稻叶片与根中部分抗氧化酶的活性，推测低温下抗氧化酶活性的下降可能与水稻幼苗抗冷性的降低有关。 五、尽管两个水稻品种具有不同的冷敏感性，然而外施水杨酸均加剧了其低温伤害。分析认为，外施水杨酸后，水稻根部大幅升高的内源SA水平可能加剧了活性氧的产生，破坏了植物细胞内部的氧化还原平衡，从而导致水稻幼苗受到的冷害加重。

增强UV-B辐射下一氧化氮对小球藻氮素代谢和类囊体的保护作用

由于到达地球表面的紫外线B辐射不断加强,生物生长受到了威胁。UV-B的增强改变了生物体赖以生存的环境,影响了藻类生物生长,抑制了其光合作用。以BG11为培养基,在室内培养的条件是光照强度为60μmol·m-2s-(1昼夜比为12h∶12h),温度为26℃,研究了一氧化氮(NO)在增强UV-B(强度为0.2J·m-2s-1)辐射下的对小球藻的作用。测定了小球藻的硝酸还原酶(NR,nitrate reductase)、亚硝酸还原酶(NiR,nitrite reductase)、谷胱甘肽还原酶(GS,gluta

Oxidative stress response after prolonged exposure of domestic rabbit to a lower dosage of extracted microcystins

Oxidative stress response after prolonged exposure to a low dose of microcystins (MCs) was studied in liver, kidney and brain of domestic rabbits. Rabbits were treated with extracted MCs (mainly MC-LR and MC-RR) at a dose of 2 MC-LReq. mu g/kg body weight or saline solution every 24 h for 7 or 14 days. During the exposure of MCs, increase of lipid peroxidation (LPO) levels were detected in all the organs studied, while antioxidant enzymes responded differently among different organs. The enzyme activities Of Superoxide dismutase (SOD). catalase (CAT) and glutathione reductase (GR) in liver decreased in the MCs treated animals. In brain, there were obvious changes in glutathione peroxidase (GPx) and GR, while only CAT was obviously influenced in kidney. Therefore, daily exposure at a lower dosage of MCs, which mimicked a natural route of MCs. could also induce obvious oxidative stress in diverse organs of domestic rabbits. The oxidative stress induced by MCs in brain was as serious as in liver and kidney, suggesting that brain may also be a target of MCs in mammals. And it seems that animals may have more time to metabolize the toxins or to form an adaptive response to reduce the adverse effects when exposed to the low dose of MCs. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.

Time-Dependent Oxidative Stress Responses of Crucian Carp (Carassius auratus) to Intraperitoneal Injection of Extracted Microcystins

This study was conducted to investigate time-dependent changes in oxidative enzymes in liver of crucian carp after intraperitoneally injection with extracted microcystins 600 and 150 mu g kg(-1) body weight. The results showed that activities of antioxidant enzymes, including superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase generally exhibited a rapid increase in early phase (1-3 h post injection), but gradually decreased afterwards (12-48 h) compared with the control, with an evident time-dependent effect. These zigzag changes over time contributed a better understanding on oxidative stress caused by microcystins in fish.