石荠苎属的系统学与进化

石荠苎属(Mosla (Benth.) Buch.-Hamilt. ex Maxim.)是唇形科的一个小属，仅分布于东亚，该属复杂的变异式样一直困扰着系统学家．本论文是对该属进行三年物种生物学研究的结果．本研究从居群生物学出发，在广泛的野外调查后选取了47个居群进行取样和观察，在控制环境因素的实验设计条件下，测量了31个居群53个形态性状并分析了其变异规律;在扫描电镜下观察了含外类群在内的6属38个居群的花粉和小坚果表面微形态：对27个居群做了细胞学研究：对22个居群15个酶系统做了等位酶分析，获得了28个位点的资料;进行了35个组合的796次人工杂交．综合上述各方面资料的分析结果，对石荠苎属的形态变异与进化、居群分化、生殖隔离、物种形成、类群划分，以及起源和扩展作了详细的分析和讨论． 形态特征的数量遗传学分析表明，叶片大小和形状、苞片形态、花序（果序）和花萼（果期花萼）的复杂变异式样是造成分类混乱的主要原因．叶片大小和形状在小鱼仙草(M. dianthera)中呈现幅度很宽的连续变异，极端情况常分别被描述为不同的种，如M．remottllora和M．grosseserrata．少数突变体以及种间偶尔产生的杂交个体在苞片和花序形态上表现异常，都曾引起分类的混乱．本研究已经澄清M. bracteata和M. tamdaoensis是突变体，而M. exfoliata和M. longispica则是种间杂种．M.fomosana花萼上唇裂片长度的变异是导致分类困难的另一个原因，是小鱼仙草花萼上唇中裂片变异的极端类型。 通过比较分析揭示了石荠苎属中苞片形状、花序结构、花朵大小、花萼形态、小坚果和花粉粒表面纹饰以及染色体的变异和演化趋势，苞片由发达的叶状类型向披针形方向演化;花序由花朵疏离的松散状向紧缩的头状类型演化;花萼由近辐射对称，五个裂片近等长向二唇形演化;花冠由发达、鲜艳向退化方向演化：小坚果由具旋涡状深雕纹向具网纹类型演化;花粉粒由无明显突起向有明显条文或块状突起的类型演化;核型由不对称性小向不对称性增强发展;繁育系统由以异交为主向以自交为主演化，并且带动一系列花部形态的相关变异． 等位酶分析结果表明，石荠苎属种内的进化以遗传变异的积累和繁育系统的转变造成的居群间分化为主要特征．杭州石荠苎各居群的平均遗传距离为0.026，聚类分析结果发现7个居群明显分化为两支，居群3704，4704和3712为一支，其他居群为一支，等位酶资料获得的结果也得到形态和生殖特征的支持．3704、4704和3712在毛被、花朵大小、小坚果大小和颜色在均与其他居群有差异，繁育系统上，这三个居群表现出更明显的异交特性．小鱼仙草居群之间遗传分化甚至大于少数亲缘种之间的遗传分化，平均遗传距离达到0.034，但杂交实验发现，居群之间并不存在生殖隔离，不同的居群之间在叶片大小、叶形、苞片长短和花萼上唇中裂片的长短也有所不同．杭州石荠苎和小鱼仙草种内居群之间的形态和等位酶分化说明居群之问正处于分化和物种形成的早期阶段，生殖隔离还没有建立。 突变（包括染色体结构变异）的积累和繁育系统的转变是石荠苎属物种形成的基础，苏州石荠苎和石荠苎的分化是由于染色体结构变异的积累，具体表现在核型不对称性上的差异，造成生殖隔离．另一些比较明显的物种形成机制为：染色体多倍化，形成M.pauciflora;染色体结构变异，如随体染色体的臂间易位，产生M.cavaleriei;繁育系统由异交转变为自交产生M．chinensis．另外，在物种形成过程中，花期和生态位分化等促进了生殖隔离的完善． 石荠苎属形态上界限清楚，而且存在生殖隔离的种有八个，它们是小花荠苎(M.cavaleriei Levl.);石香薷 (M. chinensis Maxim.);小鱼仙草 (M. dianthera (Buch.-Hamilt. ex Roxb.) Maxim.);杭州石荠苎(M．hangchouensis Matsuda);日本石荠苎(M. japonica (Benth.) Maxim.);疏花荠苎(M. pauciflora (C. Y. Wu) C. Y. Wu et H. W. Li);石荠苎(M. punctulata (J.F. Gmelin) Nakai)和苏州石荠苎(M. soochouensis Matsuda). 石荠苎属的近缘属是香薷属(Elsholtzia)、香简草属(Keiskea)和紫苏属(Perilla)。石荠苎属与近缘属的分化大约在260万年之前，因为那时石荠苎属的祖先就发生了分化，形成以杭州石荠苎一一石香薷的祖先和以小花荠苎一一小鱼仙草的祖先为代表的两条进化主线，从香薷属和香简草属的现代分布式样-以及石荠苎属的分布特点推断，华东地区可能是石荠苎属的起源和演化的舞台，华东地区具有最大的种类多样性、变异性、特有性和多度．

木通科植物分类学研究

本文对木通科植物进行全面分类学修订，确认8属35种（包括16亚种）。这8个属是：猫儿屎属(Decaisnea，1种)，串果藤属(Sinofranchetia，1种)，牛藤果属(parvatia，2种)，野木瓜属(Stauntonia，24种)，长萼木通属(Archakebia，1种)，木通属（Akebia，4种），拉氏藤属（Lardizabala，1种）和勃奎拉属（Boquila，1种）。我们建立了1个新属(长萼木通属Archakebia)、4个新种（短蕊八月瓜Stauntonia brachyandra，厚叶八月瓜S．crassifolia，离丝野木瓜S．libera和墨脱八月瓜S．medogensis）和5个新亚种（长萼三叶木通Akebia trifolialassp. longisepala，线叶五风藤Stauntonia angustifolia ssp. linearifolia，三叶五风藤S．a．ssp, trifoliata，海南野木瓜S．chinensis ssp. hainaensis和纸叶八月瓜S．latifolia ssp. chartacea)，重新组合了8个名称(Parvatia brunoniana ssp. elliptica，Stauntonia angustifolia，S． chapaensis，S．coriacea，S．grandiflora，S．latifolia，S．obovatifoliola .ssp. urophylla和S．pterocaulis)和归并了32个类群（种及种下等级）。 我们对1989年系统进行了补充，在拉氏藤族(tribe Lardizabaleae)中建立两个亚族，并对野木瓜属(Stauntonia)提出一个详尽的属下分类系统，包括两个亚属4个组。本修订主要根据作者对近七千余份腊叶标本的研究和野外考察结果撰写而成。在前一部分中，我们全面阐述木通科形态性状特征及其演化意义，并应用于科下种上分类群的划分及其亲缘关系讨论。在此基~础上，我们进一步确认串果藤族(Sinofranchetieae)和猫儿屎族(Decaisneeae)均为木通科植物早期演化的分支，也是系统位置比较孤立的类群;拉氏藤族(Lardizabaleae)与亚洲类群分开的历史很长，其内部分化也很显著;木通族(Akebineae)是木通科植物演化的主干，也是较晚近时期发生的类群，它正处在强烈分化之中，存在有各种演化式样，是木通科植物分类实践的难点。 作者仍然认为木通科植物是毛茛类与木兰类之间联系的扭带，它可能在白垩纪初期就已经在联合古陆上起源，并在古陆分裂之前就发生了东亚及南美两群植物的隔离事件。 我们在本文后一部分（即分类处理）中，描述了每个种（共35种）的性状特征、物候期、生态习性及其与近缘种的关系，并作出种分布图和形态线描图。最后列出所研究标本的索引（中英对照）。

水杉的分类、历史地理分布及其与古气候变迁的关系

本文所用标本为采自中国东北晚白垩世或古新世黑龙江省嘉荫县乌云组和早始新世辽宁省抚顺市西露天矿古城子组和计军屯组的水杉植物化石。标本包括营养结构如两种小枝，生殖结构如雄花枝和雌球果。本论文对水杉的形态结构包括叶表皮及在雄球花苞叶的上下表皮结构及花粉结构作了详细的研究。 水杉属目前已建立21个种，由于保存的原因，多数种建立在保存下来的都分器的特征上。通过对中国东北材料与曾建立的14个种M. milleri，M. glyptostroboides, M. disticha, M. japonica, M. chinensis, M. cuneata, M. papillapollenites, M. miocenica, M. kimurae, M. onukii, M. europaea, M. asiatica, M. nathorstii, M. occidentalis 之间进行的详细对比，发现这些种之间存在着极大的相似性。现代水杉M. glyptostroboides的研究非常详细，且化石种缺乏足够的特征与其相对比，因此现代水杉可作为一个生活种而存在。M. milleri和M. glyptostroboides相比较表明：二者的雄球花及木材的解剖结构特征不同，以上其他的化石种由于保存的局限性，不具有可与M. milleri对此的相应的解剖特征，认为化石种M. milleri成立。M. disticha, M. japonica, M. chinensis, M. cuneata, M. papillapolenites, M. miocenica, M. kimurae, M. onukii, M. europaea, M. asiatica, M. nathorstii 11个化石种均归于M. occidentalis。由于M. wigginsii, M. neosibirica, M. krysthofovichi, M. spitzbergensis, M. paradoxa 5个种仅建立在具有互生叶的小枝或叶表皮的基础上，M. sibirica和M. klerkiana两个种仅建立在木材解剖的结构特征上,故此7个种有待于进一步研究.因此,水杉属下确定存的有3个种:1个现代种:M. glyptostroboides;2个化石种:M. occidentalis和M. Milleri. 本文还通过收集水杉栽培状况的资料,对水杉生长的环境和生长状况统计分析,得出水杉生存繁衍的气候条件要求范围:年降水量为1000.0 - 1865.5 mm,年均温为13-16 ℃, 一月均温为-3.1至4.2 ℃,极端低温为-12 ℃, 七月均温为17.7 - 27.9 ℃。这一条件也是水杉在地质克史时期分布区应该具备的气候限制因素。本文通过收集大量的文献资料得到水杉从晚白垩世至今在全球范围内的分布状况，发现：由于自晚白垩世以来气候逐渐转冷的变化，水杉的分布范围也在逐渐变小，最后仅自然分布于中国中部湘鄂川三省的交界。以时间为横轴，水杉分布的纬度为纵轴得到水杉分布的纬度变化曲线，从各个时期最北界为点建立的曲线的起伏变化表明，除从古新世至始新世曲线稍微升高外，晚白垩世以来曲线大都在下降，反映了气温在古新世晚期略微升高，其它时期都在下降之中，这一结论与氧同位素的结论基本一致。

七叶树组织及细胞培养产生生育酚的研究

从七叶树（Aesculus Chinensis Bunge）的未成熟的果实的子叶中诱导出愈伤组织;愈伤组织在pH5.8，温度26 ± 1 ℃，加有NAA，TBA，K，CA的MS培养基上生长良好。光对愈伤组织的生长有促进作用，植醇对生长有抑制作用;进行了发酵罐培养。 利用TLC、质谱分离鉴定了γ-生育酚的存在，并利用HPLC、荧光法测定了生育酚的含量。结果表明，愈伤组织中生育酚的含量在3.2～6.6mg/100g干重;光对生育酚的合成有促进作用;植醇是生育酚合成的可能前体;悬浮培养不利于生育酚的合成，培养液中没有发现生育酚的存在。生育酚的合成与组织的生长速率成正相关。

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

羊草繁殖生物学特性的研究

羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. )又称碱草，隶属禾本科，赖草属，因其营养价值高，富含蛋白质，适口性好，抗旱，耐盐碱，耐贫瘠，抗逆性强，适应性广等优点，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。近年来，由于自然环境变劣，荒漠化加剧，以及过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即结实率低、出苗率低、产草量低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，严重限制了我国人工草地建设和天然草地的改良和沙化治理的步伐。加强羊草生物学研究，开展羊草种质生物多样性保护，成为当前研究的紧迫课题。经对国内外相关文献的查新发现：国外发表的文献匮乏，国内的报导大多集中在草原生态等宏观领域，在羊草繁殖生物学方面缺乏系统的研究。本文以本课题组从国内外收集的羊草资源为材料，从以下几个方面进行了初步探索： 一、羊草繁殖性状与遗传多样性分子标记指标的相关分析。利用分子标记与形态标记对随机抽取的17份羊草种质进行了种质评估的比较研究。结果表明：两种方法均在17份供试材料中鉴别出9份羊草种质,说明分子标记方法用于羊草种质资源鉴定是可行的，并具有快速、准确、不受环境条件限制等优点。在40个10 Mer的随机引物当中筛选出21个有效引物，以之对9份羊草材料进行RAPD 分析，共扩增出115条带，其中95条带表现出多态性，多态比率82.61%，并筛选出S1213-900，S1213-1700，S1215-5500， S1396-1370，S1384-900，S1202-5180，S1220-2200，S1381-1580，S1211-1300，S1211-800为羊草种质所具有的10个特异性标记，据此可将羊草种质与披肩草、赖草加以区分。同时在羊草种内亦发现13条可区分供试羊草种质的特有标记。形态标记与分子标记相关性分析结果显示：羊草种质的小穗数，种子千粒重，叶色，有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标---特有带百分率及遗传距离之间，存在一定相关性。同时对羊草种质资源在收集和评价过程中存在的问题进行了探讨。 二、羊草不同基因型无性繁殖特性比较研究。以本课题组从吉林、内蒙古等省份收集的10个基因型羊草为供试材料，在相同的生态因子作用下，以吉生1号羊草为对照，对10个基因型羊草的叶数增量、芽数增量、芽高度、芽间距、芽重量、根量六个无性系形态性状指标进行测评。结果表明：基因型的差异也是影响羊草无性系生长发育的重要影响因子。因此，在今后的羊草无性繁殖生物学研究中，应综合考虑环境因子和基因型因子对羊草无性繁殖生长发育的影响。在所测评的10个基因型中，各基因型的形态性状指标差异很大，栽3基因型较其他基因型优于对照吉生1号，此结论可为今后培育羊草新种提供重要资料。 三、羊草幼穗离体培养方法的建立。其方法是取羊草幼穗为外植体，经0.1%升汞溶液表面消毒后，接种到含2mg/L的2,4-D的MS培养基上，置于恒温25℃条件下诱导愈伤组织。在加有1mg/L2,4-D的MS培养基上继代2次后，转移到含1mg/L KT和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化培养得到再生芽。在除去激素后的基本培养基上获得了生根的试管苗。试管苗移栽到温室后生长正常。羊草试管苗的分化因基因型和外源激素条件的不同而异。 四、羊草有性生殖特性的研究。在自然条件下进行了羊草自交、异交结实性实验，采用FDA染色法检测羊草小孢子活性，并观测羊草雌蕊、雄蕊发育的时空特点。结果表明：在大田中羊草异交结实率远大于其自交结实率;成熟花药中有活性的花粉达到92.2%以上;同时，在发育时间顺序和空间结构上，羊草的雌蕊、雄蕊并不妨碍自体授粉。因此，初步结论认为羊草具自交不和性。

荔枝果实采后褐变及果皮过氧化物酶的提纯与性质研究

本文对荔枝果实采后贮藏中的关键问题果皮褐变的相关生理活动进行了研究。研究了采后荔枝果皮的总酚含量、花色素类物质含量、多酚氧化酶和过氧化物酶活性等在贮藏期间的变化，并就这些因素与荔枝果实采后贮藏和果皮褐变的关系进行了讨论。实验表明，在荔枝果实的采后贮藏过程中，果皮中的酚类物质、花色素苷类物质、多酚氧化酶和过氧化物酶等共同参与了导致荔枝果皮褐变的生理过程。 比较了荔枝果实在几种不同的气调环境中的贮藏效果和生理指标。结果表明高氧短时处理对于延长荔枝果实贮存时间，延缓果皮褐变有很好的效果。 过氧化物酶在以往的果实褐变过程的研究中一直没有得到足够的重视，对于荔枝果皮过氧化物酶的提纯和性质的研究也较少。为了研究过氧化物酶在褐变过程中的作用，进一步了解荔枝果皮褐变的机理，本文对荔枝果皮过氧化物酶进行了提纯。采用低浓度中性磷酸缓冲液抽提。纯化过程采用了硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50离子交换柱层析、Sephadex G-100凝胶过滤等技术，比较并摸索出提取和纯化的合适方法和条件，本文对该酶的热稳定性、pH 适应性、底物专一性、反应动力学参数和抑制剂等性质进行了研究，发现该酶热稳定很高，具有较广的pH适应范围，能催化双氧水氧化多种底物，对酚类物质的催化氧化能力很强。表明过氧化物酶在荔枝果皮的采后褐变过程中起重要作用，为荔枝果皮采后褐变的机理和荔枝果皮保色技术研究提出了新的探索方向。

羊草生殖生物学研究

羊草 (Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. ) ，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部的重要草原建群种之一。羊草是牧草之王，属于我国有比较优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业发展以及保护生态环境均具有重要作用。 羊草较弱的有性生殖特性限制了其应用，本文从实验生物学角度，研究了羊草有性生殖的基本特点，并试图通过现代分子生物学手段探讨自交不亲和性的有关机理。本论文的主要结果如下： 1. 实验发现羊草具有自交不亲和性。以6 个羊草居群为材料，测定得知开放授粉时的结实率在6.5% - 56.7%之间，自交时结实率为0.6% - 4.3%，差异极其显著; FDA 染色法检测结果显示羊草成熟花药中有活性的花粉达到92.2% 以上;在发育时间顺序和空间结构上，羊草雌蕊、雄蕊适于异花和自花授粉;花粉柱头亲和性实验表明，自交花粉只有5.5%-11.7% 是亲和的，杂交花粉亲和率达到了60.0%-84.8%，说明自交花粉在柱头上萌发受到抑制，其次，荧光显微镜还观察到“不亲和花粉”在进入柱头后生长缓慢，或停止延伸。 2. 初步确定羊草自交不亲和性具有配子体型遗传特点。以不同居群羊草杂交后的姊妹系作为实验材料，观察到自交组合的亲和率变幅为0 % - 6.9 %，杂交组合的亲和率具有连续性变异和变幅较宽的特点（47.5％ - 96.0 %），且正反交结果具有一定的一致性（88.2％），表现出配子体遗传特性。 3. 羊草居群内结实率存在一定变异。以羊草单株为单位分别进行自交、随机互交和开放授粉，结果显示三者的平均结实率分别为4.6%，18.1% 和35.7%，株间的变异系数分别为33.4%，21.2%和17.1%，这些株间的变异均达到统计上的显著差异;同时羊草自交、杂交和开放授粉之间具有一定的相关性，显示羊草的这种株间差异与株系本身的生理特性相关。 4. 分离了羊草硫氧化还原蛋白 H 基因(ThioLc)并对其功能进行了分析。克隆了ThioLc全长和cDNA序列。序列分析结果显示，DNA全长2257 bp，包括3 个内含子和4 个外显子，与水稻Thio h 的cDNA 序列相比，具有 32.0% 的同源性;Southern 杂交显示 ThioLc 在羊草基因组中是单拷贝;Northern 杂交显示 ThioLc 在羊草根、茎、叶和幼小的雌蕊中没有表达, 在成熟雌蕊和幼小的花粉中微量表达, 在成熟花粉中大量表达，说明分离的羊草硫氧化还原蛋白H 基因具有花粉特异表达特点。 5. 原核表达的ThioLc 蛋白具有较高的催化活性。构建了ThioLc 基因的原核表达载体，检测证明ThioLc基因在大肠杆菌中正常表达;提取表达蛋白，纯化，用胰岛素和二硫苏糖醇反应体系进行硫氧化还原蛋白的催化作用反应，结果表明表达的蛋白具有催化活性。这一结果为进一步搜寻靶向蛋白和研究该蛋白的结构、功能和作用方式奠定了基础。

羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究

羊草（Leymus chinensis (Trin.) Tzvel），隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过细胞、分子生物学以及生物技术手段改良羊草、快速评价和创造新的种质;如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1. 建立了羊草离体培养再生体系，并研究了影响愈伤组织诱导和植株再生的因素，影响植株再生的主要因素为激素配比和基因型。将3～5mm的幼穗接种到含有2,4-D 0～5.0mg/L的N6基本培养基上，随着2,4-D浓度的变化，愈伤组织诱导率不同，最高诱导率为93.21%（基因型C6）、最低为33.35%（吉生1号）;愈伤组织在N6(大)＋B5(微)＋KT1.0mg/L+BA1.0mg/L的培养基上可以分化出芽，并在1/2MS培养基上生根。羊草基因型W4不同幼穗诱导的愈伤组织在继代培养过程中其生长、褐化死亡等方面存在着差异;在分化培养过程中，不同幼穗的愈伤组织最高分化率为9.24%，最低分化率为5.26%。 2. 对来自同一基因型不同幼穗的愈伤组织中差异表达的基因进行了研究。采用DDRT-PCR技术对其差异表达的基因进行了分离，通过银染技术显示差异片段。将得到的差异片段进行回收、克隆测序，得到两个差异片段序列，经过序列分析表明，其中一个片段是与水稻翻译延伸因子eEF-1基因高度同源;另一差异片段与水稻谷胱甘肽转移酶GST基因高度同源。 3. 建立了羊草遗传转化方法。在获得羊草离体培养再生体系的基础上，采用基因枪法对羊草两个基因型进行转抗除草剂基因（PAT）的研究。对分别来自基因型W4和C3的愈伤组织各1430和1850块进行转化。在附加1.0mg/L PPT的培养基上进行一系列的筛选培养，共获得了23株再生苗，经过生根筛选培养，得到5株抗性苗，3株来自基因型W4，2株来自基因型C3。对5株植株进行PCR和Southern 检测，得到2株阳性苗，均来自基因型W4，对阳性植株经过无性繁殖得到的无性系进行PCR检测及Basta耐受性鉴定，外源基因可以在其无性系稳定遗传并表达，无性系除对Basta具有抗性外，其表型特征与对照无明显区别。

采用AFLP分子标记和分子生物学方法对资源植物的评价

中国资源植物丰富，蕴藏着优异的基因资源，开发和利用这些优异资源是植物学研究的重要课题。本文面向国家重大需求选择两种资源植物一羊草(Leymuschinensis (Trin.)Tzvel)和向日葵(llelia thus annuus L．)，采用分子标记技术和分子生物学方法对其进行评价和研究，以期为资源利用提供依据。由于两种植物本身的差别和采用的研究方法各异，故分别论述。 羊草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过形态调查结合生物技术手段评价羊草遗传多样性为建立核心种质及改良羊草、快速评价和创造新的种质、如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1． 对羊草的形态调查和AFLP分析，表明羊草是一种形态变异较大但是遗传变 异较小的物种。两种生态型的表现显著差异，其中灰绿生态型羊草比黄绿生 态型差异大。羊草遗传多样性与包括长期的栽培驯化、地理分布有很大的相 关性，地理来源相同的几乎全部聚到了一组。 2． 通过主成分分析和通径分析，简化了羊草31个性状分析的复杂性，了解到 羊草无性繁殖受好的营养生长促进。 3． AFLP分子标记技术在分析羊草遗传多样性方面有显著优势，尤其是对于羊 草这样多态性不高的物种是一种非常有效的分析工具。在分析AFLP数据时 采用聚类分析和主坐标分析相结合的方法，既兼顾了亲缘关系较近的种质之 间的关系调查也兼顾了亲缘关系较远的种质之间的关系调查。 4．羊草AFLP反应，不同引物所获得的总带数和多态性带数差别明显。羊草基因 组对3’端有选择性碱基TN的所有EcoRJ选择性引物扩增效果很差，前人 的有关赖草属的遗传研究也支持这一结果。 向日葵(n=17)，属于菊科( Compositae)向日葵属(Helia thus)，向日葵的研究重要领域是向日葵杂种生产，而细胞质雄性不育系的使用是杂种优势育种的核心。全世界90%以上的向日葵杂交种生产仍然在使用同一个细胞质类型PETI，玉米遗传单一给生产带来的毁灭性打击仍然令研究者和生产者记忆犹新，因此寻找更多的细胞质类型仍然是研究者的重要任务。本研究围绕一个新的不育源(G20023)的发现及鉴定，通过使用不育的G20023的保持系、恢复系、恢复的Fi代、回交一代之间比较以及与属于PETI细胞质类型的不育系的相应材料进行比较，找出与这一新的细胞质类型不育表型有关的可能差异序列，来探讨其不育机制，得到如下结果： 1、 通过田间杂交试验，证明G20023的保持系有很多（已证实有24份）， 目前找到的恢复系只有一个，H.maximiliani。G20023不育源作为一 种新的细胞质类型可以成为将来杂交育种的候选资源。同时，我们找 到一些表型证据，除了无花粉之外，G20023与PETI表型的典型不同 之处还在于前者的花药上下均为分离状态，而后者花药的基部联合， 顶部分离。显然，不同的细胞质类型在解剖结构上可能表现不尽相同。 2、 与线粒体基因组特异基因的核酸序列比较，结果表明，G20023线粒体 基因组上没有orfH522序列，与PETI表现出差异;此外，在基因atp6 位点也与PETI不同，而且在该位点也与同属向日葵ANTI不相同。同 时由于orf873并没有出现在ANTI中而出现在G20023中，因此我们可 以认为G20023这一个新的不育系是与ANTI和PETI不同的细胞质类 型。 3、 在参考常规线粒体DNA提取方法的基础上，我们做了很多改进，建立 了自己的向日葵线粒体DNA提取方法。该方法更快更简单，提取的线 粒体DNA完全可以用于酶切和杂交。 4、 G20023不育源由于其稳定的不育性状，可以作为培育无花粉彩色向日 葵杂交种的亲本材料，我们通过此不育源选育适当花色的无花粉观赏 向日葵生产杂交种。

水母雪莲DFR基因的克隆及其正义和反义植物表达载体的构建

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.）为多年生菊科植物，是我国珍稀药用资源。所含的主要生物活性成分是黄酮类物质，具有抗炎、镇痛、免疫抑制及抗氧化等功效。但由于水母雪莲生长环境特殊，生长缓慢，人工引种困难;加上长期掠夺性采挖，造成其野生药用资源短缺，已经不能满足市场的需求。近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受关注,而黄酮类化合物更是以其广谱的药理作用引人瞩目。 黄酮类化合物的合成代谢途径在植物界进化过程中很保守，黄酮类生物合成途径中的相关酶也已得到确证并进行了系统的研究。二氢黄酮醇-4-还原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是一个处于花色素或者原花色素合成途径中的关键酶，它与黄酮合成途径中的黄酮醇合成酶（flavonol synthase）竞争底物。本研究以水母雪莲为研究对象，根据近缘物种DFR基因的保守核苷酸序列设计兼并引物，通过PCR技术，从已经建立的水母雪莲红色愈伤组织cDNA文库中筛选到一个编码该酶的cDNA序列，该序列全长1166个碱基对。根据生物信息学分析，此cDNA编码342个氨基酸;Blastp分析结果显示，该氨基酸序列与同科植物翠菊（Callistephus chinensis）的相似性最高，达87%;SWISSMODEL软件预测其蛋白的三级结构与葡萄(Vitis vinifera)的十分相似，活性中心的关键氨基酸残基也完全一致。据此可以断定，我们所得到的cDNA为编码二氢黄酮醇还原酶的基因，并命名为水母雪莲二氢黄酮醇还原酶基因(SmDFR）。为了得到SmDFR的DNA序列，我们又设计特异引物，从水母雪莲的基因组中扩增出了由1871个碱基对组成的DNA序列，该序列包含五个内含子和六个外显子。 为了提高水母雪莲和大苞雪莲中黄酮类物质的含量，我们构建了SmDFR的反义植物表达载体，利用根癌农杆菌介导进行基因转化。通过改变影响农杆菌转化的实验条件包括外植体来源、农杆菌菌株、细菌浓度、外植体预培养时间、侵染时间和乙酰丁香酮的浓度进行转基因试验，目前尚未得到转基因植株。另外，我们构建了SmDFR正义植物表达载体，通过对拟南芥(Arabidopsis thaliana) DFR基因突变体和矮牵牛(Petunia hybrida)进行基因转化，来验证SmDFR的功能;目前，此实验尚在进行之中。

羊草遗传多样性分析和赖草属的分子系统发育

羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.或Aneurolepidium chinense Trin.），隶属禾本科（Gramineae），大麦族（Hordeae），小麦亚族（Triticieae），赖草属（Leymus），兼具重要的生态价值和经济价值。面向国家重大需求，本论文选择羊草作为主要研究对象，开展了两方面的研究工作，即我国羊草种质资源的遗传多样性评价和赖草属物种的系统发育分析。 羊草是一种多年生根茎型禾草，根据叶色可以划分为黄绿型和灰绿型两种生态型。其分布范围横穿亚欧草原的东部，包括朝鲜和蒙古的西部，以及西伯利亚的西北部，集中分布于我国的东北部。羊草是我国典型草原植物群落中的优势种。它可以在多种土壤和气候条件下正常生长，如松嫩平原、内蒙古草原和黄土高原。从另一个角度讲，不同类型的生境也造就了羊草丰富的遗传多样性。 自上世纪90年代中期开始，我们陆续从我国东北部6个省市收集了293份羊草种质，包括205份灰绿型羊草和88份黄绿型羊草。经过连续3年的观测记录，通过37个重要农艺性状，对293份羊草的遗传多样性进行了评估。依据10个质量性状和27个数量性状，统计了羊草不同性状和不同地域羊草的Shannon遗传多样性指数，同时还使用了主成分分析和通径分析做了相关统计。结果显示：（1）与黄绿型羊草相比，灰绿型羊草具有更高的遗传变异（P<0.05）。结合这两个趋异型羊草的分布范围，可以得出两种类型羊草之间存在稳定的遗传差异;（2）通径分析显示，羊草营养生长性状和遗传多样性两者的组合效应可以解释羊草生殖特性中20.6％的遗传变异;（3）在124-128ºE这一区域，羊草的遗传多样性指数最高（H＝2.252），表明这一地区具有最丰富的羊草种质资源。 赖草属（Leymus Hochst.）是一个异源多倍体属，约有34个物种，该属未知基因组的起源一直争论不休。其倍性范围从四倍体（2n=4x=28）、八倍体（2n=8x=56）一直到十二倍体（2n=12x=84）。新麦草属（Psathyrostachys Nevski）只含有Ns一个基因组，约有9个物种。这两个属都是多年生牧草，具有抗旱、抗病和耐盐碱等生物学特性。 应用核糖体ITS（Internal Transcribed Spacer）序列和叶绿体trnL-F序列，我们对13个赖草属物种、小麦族18个属（40份二倍体材料）、以及Elymus californicus和Bromus catharticus，共计57份材料进行了系统发生分析。ITS序列分析表明，赖草属分别与新麦草属和小麦族中一个未知属在进化上具有紧密的关系。ITS谱系树表明赖草属内部存在大量的分化，以及赖草属物种具有多次起源的特征。trnL-F序列分析表明，赖草属物种的母本，部分来自Ns基因组，部分来自Xm基因组，这可能与赖草属物种的地理分布有关，分布于亚欧大陆的物种其母本是新麦草属，而分布于北美的大部分物种其母本是Xm基因组。trnL-F序列分析还表明，E. californicus和赖草属未知的基因组具有紧密的关系。以上研究结果表明：（1）从分子层面证明，赖草属的未知基因组并非来自薄冰草属，或是一个修正的新麦草基因组，其基因组组成应是NsNsXmXm;（2）赖草属物种的母本，部分来自Ns基因组，部分来自Xm基因组，这可能与赖草属物种的地理分布有关;（3）E. californicus的母本是Xm基因组，父本是Ns基因组，该物种应从披碱草属转移至赖草属。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。

北京怀柔常见山地灌丛聚类、排序的初步研究

次生山地灌丛是北京怀柔地区分布最广泛的植被类型。由野外资料，用包括模糊聚类在内的数值分类方法区分出如下三个重要的灌丛群落类型和一个萌生丛：荆条 （Vitex chinensis）灌丛、三桠绣线菊 （Spriaea trilobata）灌丛、平榛（Coryls heterophylla）灌丛与北鹅耳枥（Carpinus turczaninowii）萌生丛。主成分分析的排序提示了人较干燥到较湿润的生境梯度上植物群落分异与环境水分状况的密切关系，和显示了在些梯度上一些群落的过渡性质。相互平均法的排序支持了主成分分析的结果，并且表明了不同植物种在梯度上的分布主要受环境水分状况的影响。关联系数分析进一步探讨了环境水分梯度上种的集团分布。 地上生物量的收割用以显示群落中优势种的重要性。使用了回归分析与数量化理论I的方法来讨论某些灌木种干、鲜重的预测建模。 根据气孔扩散阻力测定的结果，荆条显得比三桠绣线菊有更强的控制水分散失的能力。

中国东北样带（NECT）羊草种群数量特性变化及其与环境因子的直接梯度分析

陆地样带研究是国际地圈一生物圈计划( IGBP)全球变化研究中最引入注目的创新之一。目前，国际上已经设立了15条陆地样带，而且正在开展各项研究工作。现有关于陆地样带的研究报道多集中在环境梯度分析、气候变化对植被初级生产力的影响及环境变化与植被变化的对应关系等方面，而关于陆地样带环境梯度变化上植物种群生态学的研究尚未见报道。 本研究以东北样带为平台，研究北纬43。31' - 44041'，东经125018’-115。31'范围内，即由湿润到干旱的环境梯度变化系列，羊草主要形态特征、种群密度、生物量、种子生产、生物量分配比例等变化规律及其与环境因子的相关关系，初步探讨了中国东北大尺度环境变化对羊草种群的影响及羊草对变化环境的适应规律。 在本研究的环境变化系列上，羊草种群外部形态的突出变化是种群植株高度由东至西沿降水量逐渐下降的梯度逐级递减，而且植株高度与生长季前期的降水量呈显著正相关关系。除旗叶外，羊草种群各叶片长度具有相似的变化趋势，即长春地区种群叶片长度远远大于其它种群，阿巴嘎旗地区种群叶片长度远远小于其它种群，其它8个种群叶片长度变化不大，呈平缓波动状态。除长春地区羊草叶片宽度显著大于其它种群外，其它9个种群间虽有一定的差异，但基本是处于波动状态。这说明羊草的各形态特征对该梯度环境变化的反映是不同的。 在该环境梯度上，羊草种群总密度、营养枝密度和生殖枝密度具有非常相似的变化趋势，均为由东至西呈先增后减的趋势，并且最大值都在长岭种马场地区。而且，无论是种群总密度，还是营养枝和生殖枝密度均与9月份平均温度显著相关，这是因为秋季高温对地上部分的营养物质向地下根茎转移及地下根茎芽的形成有利，丰富的物质积累和发育良好的地下根茎芽是翌年种群具有较高密度的保障。在本研究的10个种群中，除长春地区种群生殖枝分化率显著低于其它种群外，各羊草种群生殖枝分化率相对稳定，而且羊草种群生殖枝分化率与环境梯度上各环境因子间的相关性均不显著。 在本研究中，种群总生物量、营养枝生物量、生殖枝生物量和个体生物量等指标具有不同的变化趋势。表现为由东至西或由湿润到干旱，除生殖枝生物量在最东端的各种群中呈增加趋势外，种群总生物量和地上群体生物量（营养枝生物量和生殖枝生物量）均呈逐级盘低走势，而且干燥系数和生长季前期的降水量是决定总生物量和地上群体生物量变化的主要因素。地下根茎生物量表现为从湿润的长春市地区到半干旱的绍根地区呈缓慢盘低，而后随干旱程度的加重迅速增加，但至最干旱的阿巴嘎旗地区又迅速下降。在半干旱和干旱地区，植物根系生物量增加能使植物更有效地利用有限的水资源。羊草种群个体生物量的变化趋势基本一致，即除长春地区种群个体生物量远远大于其它9个种群外，各羊草种群个体生物量虽有所差异，但变化不大，基本水平波动状态。个体生物量的相对稳定是羊草能适应各种变化生境的重要保障，而且在该实验梯度上个体生物量的相对稳定是通过种群密度变化来调节的。 在本研究梯度上，虽然各种子生产指标有一定的变化，如锡林郭勒草原定位站种群和阿巴嘎旗种群的种穗长度、结实数和单位面积种子产量均较低等，但这些指标的变化与由东至西的降水量递减等气候因子变化是不一致的，如结实数、单位面积种子产量和种子重量等基本呈波动状态，只是在实验梯度的西端才有明显的下降。这说明在本研究的环境梯度系列上，环境因子对羊草种子生产有一定的影响，但最主要的影响可能是其自身遗传因素，这有待于今后的深入研究。 在本研究的环境梯度上，由东至西或由湿润到干旱的气候变化系列上，羊草种群根茎、营养枝、生殖枝和种子生物量分配比例呈现明显的规律性变化。最显著的表现是羊草种群根茎生物量分配比例随降水量的减少而逐渐增加。在水资源有限的生境下，大比例的根茎生物量分配能增加根系对地下水分的吸收，同时有利于物质和能量在根部的贮藏，这种机制能确保植物在干旱气候条件下生存。相反，羊草种群地上营养枝生物量分配比例由东至西逐渐下降，减少营养枝生物量分配比例可以降低营养枝水分蒸腾量，协调根部水分吸收和枝条蒸腾的关系，保持整个植物体的水分平衡。羊草种群生殖枝和种子生物量分配比例均呈两头低，中间高的变化趋势。这说明降水充足和严重干旱均不利于羊草有性生殖体的生产，半湿润和半干旱气候区是羊草种子生产的理想地域，这也可能是羊革能在半湿润和半干旱气候区大面积分布的原因。