71 resultados para DNA Teses
Resumo:
Na medicina regenerativa h uma crescente utilizao de lasers de baixa intensidade em protocolos teraputicos para tratamento de doenas em tecidos moles e no tecido sseo. Lasers emitem feixes de luz com caractersticas especficas, nas quais o comprimento de onda, a frequncia, potncia e modo de misso so propriedades determinantes para as respostas fotofsica, fotoqumica e fotobiolgica. Entretanto, sugere-se que lasers de baixa potncia induzem a produo de radicais livres, que podem reagir com biomolculas importantes, como o DNA. Essas reaes podem causar leses e induzir mecanismos de reparo do DNA para preservar a integridade do cdigo gentico e homeostase celular. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar leses no DNA de clulas do sangue perifrico de ratos Wistar e a expresso dos genes ERCC1 e ERCC2 em tecidos biolgicos expostos a lasers de baixa intensidade em comprimentos de onda, fluncias, potncias e modos de emisso utilizados em protocolos teraputicos. Para tal, amostras de sangue perifrico foram expostas ao laser vermelho (660 nm) e infravermelho (808 nm) em diferentes fluncias, potncias e modos de emisso, e a induo de leses no DNA foi avaliada atravs do ensaio cometa. Em outros experimentos, leses no DNA foram analisadas atravs do ensaio cometa modificado, utilizando as enzimas de reparo: formamidopirimidina DNA glicosilase (FPG) e endonuclease III. Pele e msculo de ratos Wistar foram expostos aos lasers e amostras desses tecidos foram retiradas para extrao de RNA, sntese de cDNA e avaliao da expresso dos genes por PCR quantitativo em tempo real. Os dados obtidos neste estudo sugeriram que a exposio aos lasers induz leses no DNA dependendo da fluncia, potncia e modo de emisso, e que essas leses so alvos da FPG e endonuclease III. A expresso relativa do RNAm de ERCC1 e de ERCC2 foi alterada nos tecidos expostos dependendo do comprimento de onda e fluncia utilizada. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que danos oxidativos no DNA poderiam ser considerados para segurana do paciente e eficcia teraputica, bem como alteraes na expresso dos genes de reparo do DNA participariam dos efeitos de bioestimulao que justificam as aplicaes teraputica de lasers de baixa potncia.
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A emodina uma antraquinona estruturalmente semelhante aloe-emodina e ambas tem sido apontadas como capazes de causar leses oxidativas pela produo de ERO. Sua presena em produtos dermocosmticos e de higiene pessoal, associada s informaes de que a fotoativao de antraquinonas levaria ao aumento de leses oxidativas causadas por ERO, torna relevante o estudo da associao da emodina com a radiao UVA. O objetivo desse trabalho foi avaliar a citotoxicidade induzida pela associao da emodina com doses subletais de radiao UVA, em clulas de Escherichia coli (selvagem e cepas deficientes em enzimas do BER), atravs de ensaios de sobrevivncia bacteriana (taxa de dose de UVA igual a 20J/m/s, totalizando 108kJ/m ao final de 90min de experimento), e em clulas da linhagem A549 pela excluso do corante azul de tripan e sobrevivncia clonognica(taxa de dose de UVA igual a 20J/m/s, totalizando 36kJ/m ao final de 30min de experimento). Alm disso, a genotoxicidade desses agentes foi estudada por eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial (taxa de dose de UVA igual a 16J/m/s, totalizando 57,6kJ/m ao final de 60min de experimento). De acordo com os resultados: i) Concentraes iguais ou abaixo de 5,55mM de emodina no alteraram a sobrevivncia em nenhuma das cepas estudas; ii) As protenas Xth e Fpg parecem ter um papel importante no reparo das leses causadas pela emodina, em altas concentraes, sugerindo a participao do reparo por exciso de bases (BER) nesse processo; iii) A associao da emodina com a radiao UVA se mostrou citotxica em todas as cepas de E. coli; iv) O gene nfo foi o mais importante na resistncia bacteriana s leses induzidas pela associao dos dois agentes, reforando o envolvimento do BER e indicando uma possvel participao do reparo por inciso de nucleotdeos (NIR); v) A emodina parece ter interagido com o DNA plasmidial, alterando seu padro de migrao no gel de agarose; vi) Em clulas da linhagem A549, a emodina causa efeitos txicos imediatos que parecem ser reparados ao longo do tempo. Porm, quando a droga permaneceu por 24 horas em contato com as clulas, houve uma diminuio na sobrevivncia celular que parece ser dosedependente; vii) As concentraes de 10μM e 25μM de emodina, quando associadas ao UVA, se mostraram responsveis pela reduo de mais de 50% na sobrevivncia nas clulas A549, chegando a 100% de morte quando a concentrao de emodina foi de 50μM; viii) A radiao UVA potencializou os efeitos citotxicos da emodina, nos 2 modelos experimentais do presente estudo, indicando que a interao da emodina com a radiao UVA seja genotxica e portanto prejudicial sade.
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A doena de Chagas uma zoonose causada pelo protozorio flagelado Trypanosoma cruzi. Estima-se que 8 milhes de pessoas esto infectadas com o T. cruzi em todo o mundo, principalmente na Amrica Latina. Testes tradicionais de diagnstico esto sendo gradualmente substitudos por mtodos inovadores. A utilizao de antgenos recombinantes foi proposta nos anos 90, e vrias combinaes foram testadas com soros de pacientes com diferentes formas clnicas de diferentes regies da Amrica Latina. Apesar do ganho em especificidade, estes testes apresentaram menor sensibilidade, frustrando expectativas. Este estudo objetivou analisar a variabilidade gentica dos genes KMP11 e 1F8 que codificam antgenos comumente utilizados em diagnstico experimental. Cepas de T. cruzi pertencentes a diferentes sub-grupos taxonmicos e de diferentes regies foram analisadas para avaliar o impacto da variao antignica em testes de diagnstico. Maximizando a sensibilidade, evitar reatividade cruzada com eptopos de outros agentes patognicos deve permitir a concepo de melhores testes rpidos. Num primeiro passo, DNA genmico foi extrado das seguintes cepas: Dm28c, Colombiana, Y, 3663, 4167, LL014 e CL Brener e foi realizada a amplificao dos genes 1F8 e KMP11 que codificam antgenos a partir destas cepas. Em seguida foram realizadas a clonagem, sequenciamento, expresso e deteco dos antgenos recombinantes. Na etapa final, anlises de estruturas secundrias e tercirias, a ltima apenas para o antgeno 1F8, visualizaram as diferenas nas sequncias de aminocidos obtidas a partir de sequenciamento de DNA. Os resultados apresentados neste estudo mostram que o antgeno KMP11 de T. cruzi possui uma similaridade na sequncia de aminocidos muito elevada com o T. rangeli, mostrando a necessidade de um mapeamento antignico desta protena em todos os tripanosomatdeos que apresentaram alta similaridade com o antgeno de T. cruzi, como o T. rangeli, para verificar a presena de eptopos especficos de T. cruzi. O antgeno 1F8 pode ser uma ferramenta til no diagnstico da doena de Chagas e que ser necessrio aprofundar os conhecimentos sobre os determinantes antignicos para futuramente elaborar poli-eptopos sintticos adaptados de um maior nmero possvel de antgenos, obtendo a maior especificidade e sensibilidade nos testes de diagnstico sorolgico e de teste rpido da doena de Chagas. Este estudo representa um passo crucial para a otimizao de antgenos recombinantes para o diagnstico da doena de Chagas.
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A clula epitelial o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interao pode levar a produo de diversas citocinas, quimiocinas, molculas inflamatrias e tambm estimular a gerao de espcies reativas de oxignio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interao com as clulas HEp-2 poderia ser genotxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por exciso de base (BER). Alm disto, avaliamos a expresso do sistema SOS, que induzido pela presena de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presena de filamentos, na interao com clulas HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interao foi quantificada na ausncia da D-manose, observamos um aumento das bactrias aderidas. Alm disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos tambm aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensveis estavam envolvidas na filamentao bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentao observada neste ensaio foram uma consequncia da induo do sistema SOS, desencadeada pela interao com as clulas HEp-2, quantificamos a expresso do SOS, na presena e na ausncia da D-manose. De fato, observamos que a induo do SOS na ausncia da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presena de D-manose. Alm disto, observamos que a ausncia de xthA foi importante para o aumento da filamentao observada na ausncia de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentao ocorreria quando as bactrias interagiam com uma superfcie abitica como o vidro. Observamos tambm inmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentao foi associada induo do SOS, em resposta a interao das bactrias com o vidro. Em parte a filamentao e a induo do SOS observadas na interao ao vidro, foram associadas produo de ERO. Quantificamos tambm o nmero de bactrias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formao de biofilme dependia da capacidade da bactria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tenso do oxignio foi importante para interao dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactrias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuio observada no estava vinculada a morte dos mutantes BER. Tambm realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as trs cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formao desta estrutura por ambas as cepas dependia da tenso de oxignio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em concluso, mostramos que na interao das bactrias com a superfcie bitica e abitica, ocorreu leso no genoma, com induo do SOS e a resposta de filamentao associada.
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As espcies reativas de oxignio (ERO) so geradas durante o metabolismo celular normal e podem produzir vrios danos oxidativos no DNA, tais como leses nas bases nitrogenadas ou stios apurnico/apirimidnico (AP). Essas leses podem acarretar acmulo de stios de mutaes, caso esses danos no sejam reparados. Entretanto, as bactrias possuem vrios mecanismos de defesa contra as ERO que desempenham um importante papel na manuteno da fisiologia. O objetivo deste trabalho foi o de avaliar se sistemas enzimticos, como o reparo por exciso de bases (BER), sistema SOS e SoxRS, interferem em respostas como a sensibilidade aos antibiticos, aderncia das clulas bacterianas a superfcies biticas ou abiticas e formao de biofilme. Os mutantes utilizados no presente estudo so todos derivados de Escherichia coli K-12 e os resultados obtidos mostraram que, dos mutantes BER testados, o nico que apresentou diferena no perfil de sensibilidade aos antimicrobiamos em relao cepa selvagem (AB1157) foi o mutante xthA- (BW9091), deficiente em exonuclease III. No teste de aderncia qualitativo realizado com linhagem de clulas HEp-2 (originria de carcinoma de laringe humana) foi observado que onze cepas da nossa coleo, apresentaram um padro denominando like-AA, contrastando com o que era esperado para as cepas de E. coli utilizadas como controle negativo, que apresentam aderncia discreta sem padro tpico. A aderncia manose-sensvel via fmbria do tipo I avaliada nesse estudo mostrou que essa fimbria, possui um papel relevante na intensidade da aderncia e filamentao nessas cepas estudas. A filamentao uma resposta SOS importante para que o genoma seja reparado antes de ser partilhado pelas clulas filhas. Alm disso, com relao formao de biofilme, oito cepas apresentaram um biofilme forte sendo que essa resposta no foi acompanhada pelo aumento da intensidade de filamentao. Nossos resultados em conjunto sugerem o envolvimento de estresse oxidativo na definio de parmetros como sensibilidade a antimicrobianos, padro e intensidade de aderncia, filamentao e formao de biofilme nas amostras de E. coli K-12 avaliadas neste trabalho. Sugerimos que a aderncia gera estresse oxidativo causando danos no DNA, o que leva a induo do sistema SOS resultando na resposta de filamentao observada.
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Novas metodologias de anlise molecular voltadas para estudos populacionais, clnicos, evolutivos, da biodiversidade e identificao forense foram desenvolvidas com base em marcadores microsstelites ou STR Short Tandem Repeats. Os marcadores STR, que esto amplamente espalhados nos genomas e se caracterizam por apresentar alto grau de polimorfismo, podem ser analisados a partir da amplificao por PCR (Reao em Cadeia da polimerase). A anlise foi facilitada a partir do desenvolvimento de sistemas de amplificao simultnea de mltiplos STR (multiplex STR) e com a deteco automatizada dos produtos de amplificao marcados por fluorescncia. Recentemente, o uso de marcadores STR do cromossomo X (X-STR) tornou-se significativo na prtica forense. Devido ao seu modo de transmisso, os X-STR so teis em situaes particulares de investigao de relaes de parentesco, apresentando vantagens sobre o uso de STR autossmicos. Este estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento e validao de sistema multiplex, denominado LDD (X-STR) Decaplex, capaz de amplificar dez loci X-STR (DXS7133, DXS7424, DXS8378, DXS6807, DXS7132, DXS10074, DXS7423, DXS8377, GATA172D05 e DXS10101) para aplicao em gentica populacional, identificao e anlises forenses. Utilizando o LDD (X-STR) Decaplex 170 indivduos autodenominados afrodescendentes, no aparentados geneticamente, foram genotipados. As freqncias allicas e genotpicas no apresentaram desvio do equilbrio de Hardy-Weinberg e esto em concordncia com aquelas observadas em outros estudos. Os hapltipos observados foram nicos em indivduos de amostra masculina. A anlise de desequilbrio de ligao no revelou associao entre os marcadores X-STR. A diversidade gentica foi elevada, variando entre 0,6218 para o locus DXS7133 a 0,9327 para o locus DXS8377. Os parmetros de Probabilidade de Vinculao (PV), ndice de Vinculao (IV), Poder de Excluso (PE), Poder de Discriminao e Razo de Verossimilhana foram tambm elevados, demonstraram que os dez X-STRs so altamente polimrficos e discriminativos na populao estudada. A concentrao mnima de DNA para a amplificao dos loci do LDD (X-STR) Decaplex de 0,5 ng e verificamos que amplificao por PCR pode ser afetada quando so adicionados mais de 5 ng de DNA nas reaes. Os percentuais de bandas stutter foram elevados para os loci DXS7132 e DXS8377. No teste de reprodutibilidade observamos consistncia entre as tipagem de diferentes amostras biolgicas, incluindo as de restos mortais. No teste de mistura a proporo limite em que observamos a coexistncia de duas espcies biolgicas foi de 2,5:1ng (feminino-masculino). Os resultados evidenciaram que os loci do LDD (X-STR) Decaplex so altamente informativos, consistindo, em conjunto, uma ferramenta importante em estudos de identificao humana e de relaes de parentesco.
Resumo:
Para analisar cepas de Salmonella ser. Typhimurium isoladas de processos entricos e extraintestinais humanos ocorridos no perodo de 1970 a 2008 de diferentes regies do pas foram selecionadas, com base nos registros contidos no banco de dados do Laboratrio de Enterobactrias do IOC/FIOCRUZ, RJ, amostras do fagotipo prevalente 193, visando precipuamente o reconhecimento de clones epidmicos. Foram selecionadas 553 cepas de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 representadas por 91, 65, 70 e 327 amostras referentes as dcadas de 70, 80, 90 e ao perodo de 2000 a 2008, respectivamente. Na anlise global da sensibilidade destas cepas, 52% apresentaram um ou mais marcadores de resistncia a antibiticos includos no perfil ACSSuT. Este perfil de resistncia completo foi verificado em 20,9% dos isolados, sendo os 21,9% restantes, sensveis a todas as drogas testadas, especialmente no perodo de 2000 a 2008, representadas por 121 amostras (37,0%) em relao as 327 culturas dessa poca. O maior percentual de resistncia foi observado nas amostras da dcada de 70 (99%) sendo o perfil ACSSuT detectado em 35,2% dos isolados, ressaltando-se que todas as amostras foram isoladas de processos gastroentricos ocorridos na cidade de So Paulo. Ao longo das quatro dcadas de estudo, descreve-se um ponto de ruptura entre a prevalncia de resistncia e a suscetibilidade na transio entre as dcadas de 80 e 90. Embora o nmero de isolados de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 tenha aumentado no ltimo perodo considerado, o percentual de mono e multirresistncia aos antimicrobianos se situou em nvel elevado (63,0%). A anlise do polimorfismo obtido aps macrorrestrio com a enzima XbaI revelou que cepas isoladas na dcada de 90 apresentaram elevado percentual de similaridade (≥85%) com cepas isoladas recentemente (perodo de 2000-2008), sendo agrupadas nos mesmos subclusters. Por outro lado, as cepas da dcada de 70 inserem-se em subclusters independentes, embora o percentual de similaridade entre tais subclusters e os demais seja ≥70%; o mesmo sendo observado para as cepas isoladas durante a dcada de 80. Em concluso, este estudo mostrou que a prevalncia de isolados humanos de Salmonella ser. Typhimurium fagotipo 193 no Brasil vem progredindo desde a dcada de 1990, enquanto a deteco do modelo R (ACSSuT) est diminuindo e a avaliao atravs da PFGE indicou a presena de multiplicidade de perfis de macrorrestrio no fagotipo 193, entretanto com elevados percentuais de similaridade entre si, sugerindo alguma clonalidade, tendo em vista o perodo entre o isolamento e a anlise
Resumo:
Os INDELs so polimorfismos de comprimento, gerados a partir de inseres e/ou delees de um ou mais nucleotdeos. Os marcadores INDELs, que esto amplamente distribudos pelo genoma e se caracterizam pela alta estabilidade devido baixa taxa mutacional (10-9), podem ser analisados a partir da amplificao por PCR (Reao em Cadeia da Polimerase). A facilidade de anlise e a possibilidade de construo de sistemas multiplex capazes de gerar amplicons curtos (menores que 100 pb) tornam os INDELs uma importante ferramenta para identificao humana por DNA. Para avaliar a eficincia e validar a metodologia que emprega os polimorfismos de insero/deleo na identificao humana, utilizamos o sistema Indel-plex ID, capaz de amplificar simultaneamente 38 loci INDELs biallicos de cromossomos autossomos. Diferentes amostras biolgicas (cabelo, saliva, sangue, smen e urina) foram genotipadas apresentando reprodutibilidade entre todas as tipagens. A concentrao mnima de DNA necessria para amplificao dos 38 loci INDELs foi de 0,5 ng. Artefatos do tipo split peaks foram observados em algumas amostras. Os produtos da PCR foram purificados em resina Sephadex proporcionando melhores condies de anlise, reduo de artefatos e aumento na intensidade mdia de fluorescncia dos alelos amplificados. A eficincia do sistema Indel-plex ID na amplificao de DNA degradado foi verificada durante as anlises das amostras de DNA extradas de restos mortais (ossos e dentes). Comparativamente ao sistema Identifiler, o Indel-plex ID, se mostrou mais eficiente em termos de nmero de loci genotipados e qualidade de amplificao. Nas investigaes de vnculos genticos realizadas com o sistema Indel-plex ID foi possvel corroborar resultados anteriores obtidos pela anlise de marcadores STR. Nas anlises com amostras in vivo foram obtidos valores mximos de Probabilidades de Paternidade de 99,99998%. Para casos envolvendo supostos pais falecidos, o sistema Indel-plex ID reforou resultados obtidos com o sistema Identifiler e Minifiler. A Probabilidade de Paternidade de 99,953%, obtida com o sistema Indel-plex ID, conjugada com a Probabilidade de Paternidade de 99,957%, obtida como o sistema Minifiler, possibilitou um ndice final de 99,99998%. Os resultados evidenciaram que os loci INDELs do sistema Indel-plex ID so altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificao humana e de relaes de parentesco
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As pores uniparentais do genoma humano, representadas pelo cromossomo Y e pelo DNA mitocondrial (DNAmt), contm informao gentica relacionada s heranas patrilinear e matrilinear, respectivamente. Alm da aplicabilidade em gentica mdica e forense, o DNAmt tem sido utilizado como um importante marcador molecular em estudos sobre evoluo para traar inferncias filogenticas e filogeogrficas sobre as populaes humanas. A anlise de linhagens de DNAmt presentes em diferentes populaes mundiais levou identificao de haplogrupos reunindo diversos hapltipos especficos dos grandes grupos tnicos: africanos, europeus, asiticos e nativos americanos. A populao brasileira conhecida como uma das mais heterogneas do mundo, resultado do processo de colonizao do pas, abrangendo mais de cinco sculos de miscigenao entre povos de diferentes continentes. Este trabalho teve como objetivo estimar a partir da anlise do DNA mitocondrial as propores ancestrais africanas, europias e amerndias na populao do Rio de Janeiro. Para isso foram sequencidas as regies hipervariveis HVI e HVII do DNAmt de 109 indivduos no relacionados geneticamente residentes no Rio de Janeiro. Os haplogrupos foram classificados de acordo com o conjunto de polimorfismos dos hapltipos individuais. Programas estatsticas foram utilizados para a determinao de parmetros de diversidade gentica e comparaes populacionais. A diversidade haplotpica foi estimada em 0,9988. Nossos resultados demonstraram na populao do Rio de Janeiro percentuais de cerca de 60%, 25% e 15% de ancestralidades maternas africana, amerndia e europia, respectivamente. Atravs da anlise de distncias genticas, evidenciou-se que a populao do Rio de Janeiro est mais prxima das populaes brasilerias dos estados de So Paulo e Alagoas. Como descrito nos registros histricos, algumas regies do pas tiveram processos de colonizao muito especficos que se refletem nas propores ancestrais maternas e paternas observadas. Em relao ao DNAmt, no se verificou diferena gentica significativa entre as populaes do Rio de Janeiro e a de Angola, uma populao africana. Os resultados obtidos esto em estreita concordncia com os registros histricos e outros estudos genticos acerca da formao da populao brasileira
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Didaticamente, podemos dividir o espectro da radiao ultravioleta (UV) em trs faixas: UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC (290 a 100 nm). Apesar do UVC ou UV-curto ser eficientemente filtrado pela camada de oznio da Terra e sua atmosfera, este uma das faixas do espectro de UV mais usadas para explorar as consequncias de danos causados ao DNA, j que a letalidade induzida por este agente est relacionada aos danos diretos no genoma celular, como as leses dmero de pirimidina, que so letais se no reparadas. Contudo, demonstrou-se que a radiao UVC pode gerar espcies reativas de oxignio (ERO), como o oxignio singleto (1O2). Embora, o radical hidroxil (OH) cause modificaes oxidativas nas bases de DNA, alguns trabalhos indicam que o 1O2 tambm est envolvido nos danos oxidativos no DNA. Esta ERO produzida por vrios sistemas biolgicos e reaes fotossensibilizao, quando cromforos so expostos luz visvel ou so excitados pela luz UV, permitindo que essa energia possa ser transferida para o oxignio sendo convertido em 1O2, que conhecido por modificar resduos de guanina, gerando 8-oxoG, que caso no seja reparada pode gerar uma transverso GC-TA. O objetivo deste trabalho foi o de elucidar a participao de ERO nos efeitos genotxicos e mutagnicos gerados pela radiao UVC, assim como as enzimas envolvidas no processo de reparao destas leses em clulas de Escherichia coli. Nos ensaios as culturas foram irradiadas com o UVC (254 nm; 15W General Electric G15T8 germicidal lamp, USA). Nossos resultados mostram que o uso de quelantes de ferro no alterou a letalidade induzida pelo UVC. A azida sdica, um captador de 1O2, protegeu as cepas contra os danos genotxicos gerados pelo UVC e tambm diminuiu a frequncia de mutaes induzidas no teste com rifampicina. A reverso especfica GC-TA foi induzida mais de 2,5 vezes no ensaio de mutagnese. A cepa deficiente na protena de reparo Fpg, enzima que corrige a leso 8-oxoG, apresentou menos quebras no DNA do que a cepa selvagem no ensaio de eletroforese alcalina. A letalidade induzida pelo UVC foi aumentada nos mutantes transformados com o plasmdeo pFPG, ao mesmo tempo que representou uma reduo na induo mutagnica. Houve dimuio na eficincia de transformao com plasmdeo pUC 9.1 na cepa fpg quando comparado a cepa selvagem. Assim como, um aumento da sensibilidade ao UVC na associao entre mutantes fpg e uvrA. Estes resultados mostram que o 1O2 participa dos danos induzidos pelo UVC, atravs da gerao da leso 8-oxoG, uma leso mutagnica, que reparada pela protena Fpg
Resumo:
O cncer de esfago uma malignidade altamente freqente e letal. Uma caracterstica especfica das reas de alta incidncia de cncer de esfago a grande proporo de duplas mutaes no gene TP53, sendo, ao menos uma delas, uma transio G para A em stios CpG. Essas transies resultam de malpareamentos GT causados pela desaminao espontnea da 5-metilcitosina em ilhotas CpG. A enzima de reparo de DNA Timina-DNA Glicosilase (TDG) responsvel pelo primeiro passo na remoo da timina de malpareamentos GT em CpG. A alta proporo de mutaes em stios CpG em cncer de esfago das reas de alta incidncia sugere que a via de reparo de DNA iniciada pela TDG pode estar prejudicada. A presena de duplas mutaes, sendo ao menos uma delas em CpG, levantou a hiptese de que a primeira mutao no TP53 reduz a atividade da via de reparo iniciada pela TDG, que acarretaria a segunda mutao em stios CpG. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi analisar o efeito da p53 sobre a expresso e atividade da TDG. Os resultados obtidos mostram que a expresso de TDG regulada transcricionalmente pela p53 numa gama de linhagens celulares e induzida pelo dano ao DNA, de forma p53-dependente. Alm disto, os resultados apontam um possvel papel da protena p53 ativa na migrao nuclear e atividade da TDG. Estes resultados ainda nos levam concluso de que o silenciamento de TDG aumenta a sensibilidade morte celular induzida por MMS quando a p53 encontrada na forma selvagem, mas no quando esta protena mutada, e de que o status mutacional de TP53 parece afetar a expresso de TDG em CEE primrios. Juntos esses resultados sugerem que a p53 regula o reparo de DNA mediado pela TDG e que a inativao de p53 em clulas tumorais pode contribuir para a aquisio de um mutator phenotype.
Resumo:
A Mata Atlntica brasileira concentra uma das maiores diversidades biolgicas da Terra com cerca de 7% das espcies animais e vegetais do planeta. Esse bioma abriga atualmente mais de 50% das espcies de anuros do Brasil (c.a. 500 espcies), mas sofre intensa perda e fragmentao de habitat. Um dos principais fragmentos da Mata Atlntica, a Reserva Ecolgica de Guapiau (REGUA) abriga vasta anurofauna, com cerca de 71 espcies j descritas. Acredita-se, porm, que muitas ainda precisam ser identificadas e estudadas. A identificao de espcies baseada em caracteres moleculares vem se mostrando uma alternativa para dar suporte identificao morfolgica, e dentro deste contexto os genes de DNA mitocondrial, como o 16S, so utilizados para a realizao de barcode. O objetivo deste estudo foi testar a metodologia de identificao molecular de espcies (DNA barcode) na comunidade de anfbios anuros da REGUA utilizando o gene mitocondrial 16S. Para isso, foram coletados tecidos de 99 indivduos, entre adultos e girinos de 23 espcies, agrupados em seis famlias distintas. Desses 99 indivduos, 88 foram amplificados corretamente para o gene em referncia e foram realizadas, com sucesso, a determinao de espcies de 84 anuros (95,45%) da REGUA. As espcies de Scinax albicans, Scinax flavoguttatus e Hylodes charadranaetes, cujas identificaes haviam sido determinadas com base em critrios morfolgicos, agruparam em clados de mesmo gnero, porm de espcies diferentes quando analisadas pelas metodologias neighbor-joining e maximum-likelihood. Alm de altos valores de distncia intraespecfica (2,18%, 3,49% e 3,77%, respectivamente) e distncias interespecficas nulas (0%) temos a indicao de possveis equvocos em determinaes de espcies feitas exclusivamente por critrios morfolgicos. Nesse caso, as discordncias morfolgica e molecular so exclusivamente de girinos, demonstrando a dificuldade na identificao morfolgica e a escassez de chaves de identificao dessas espcies em estgio larval. Os resultados mostram que o gene mitocondrial 16S teve seu uso na identificao de anuros da REGUA confirmada e apontam que, em casos de estudos com indivduos em estgios larvais, como em girinos, a metodologia de barcode, quando complementada a identificao morfolgica, suporta a correta identificao das espcies de anfbios anuros.
Resumo:
Amostras de DNA so encontradas em fragmentos, obtidos em vestgios de uma cena de crime, ou coletados de amostras de cabelo ou sangue, para testes genticos ou de paternidade. Para identificar se esse fragmento pertence ou no a uma sequncia de DNA, necessrio compar-los com uma sequncia determinada, que pode estar armazenada em um banco de dados para, por exemplo, apontar um suspeito. Para tal, preciso uma ferramenta eficiente para realizar o alinhamento da sequncia de DNA encontrada com a armazenada no banco de dados. O alinhamento de sequncias de DNA, em ingls DNA matching, o campo da bioinformtica que tenta entender a relao entre as sequncias genticas e suas relaes funcionais e parentais. Essa tarefa frequentemente realizada atravs de softwares que varrem clusters de base de dados, demandando alto poder computacional, o que encarece o custo de um projeto de alinhamento de sequncias de DNA. Esta dissertao apresenta uma arquitetura de hardware paralela, para o algoritmo BLAST, que permite o alinhamento de um par de sequncias de DNA. O algoritmo BLAST um mtodo heurstico e atualmente o mais rpido. A estratgia do BLAST dividir as sequncias originais em subsequncias menores de tamanho w. Aps realizar as comparaes nessas pequenas subsequncias, as etapas do BLAST analisam apenas as subsequncias que forem idnticas. Com isso, o algoritmo diminui o nmero de testes e combinaes necessrias para realizar o alinhamento. Para cada sequncia idntica h trs etapas, a serem realizadas pelo algoritmo: semeadura, extenso e avaliao. A soluo proposta se inspira nas caractersticas do algoritmo para implementar um hardware totalmente paralelo e com pipeline entre as etapas bsicas do BLAST. A arquitetura de hardware proposta foi implementada em FPGA e os resultados obtidos mostram a comparao entre rea ocupada, nmero de ciclos e mxima frequncia de operao permitida, em funo dos parmetros de alinhamento. O resultado uma arquitetura de hardware em lgica reconfigurvel, escalvel, eficiente e de baixo custo, capaz de alinhar pares de sequncias utilizando o algoritmo BLAST.
Resumo:
Os tumores de mama so caracterizados pela sua alta heterogeneidade. O cncer de mama uma doena complexa, que possui o seu desenvolvimento fortemente influenciado por fatores ambientais, combinada a uma progressiva acumulao de mutaes genticas e desregulao epigentica de vias crticas. Alteraes nos padres de expresso gnica podem ser resultado de uma desregulao no controle de eventos epigenticos, assim como, na regulao ps-transcricional pelo mecanismo de RNA de interferncia endgeno via microRNA (miRNA). Estes eventos so capazes de levar iniciao, promoo e manuteno da carcinognese, como tambm ter implicaes no desenvolvimento da resistncia terapia Os miRNAs formam uma classe de RNAs no codificantes, que durante os ltimos anos surgiram como um dos principais reguladores da expresso gnica, atravs da sua capacidade de regular negativamente a atividade de RNAs mensageiros (RNAms) portadores de uma seqencia parcialmente complementar. A importncia da regulao mediada por miRNAs foi observada pela capacidade destas molculas em regular uma vasta gama de processos biolgicos incluindo a proliferao celular, diferenciao e a apoptose. Para avaliar a expresso de miRNAs durante a progresso tumoral, utilizamos como modelo experimental a srie 21T que compreende 5 linhagens celulares originrias da mesma paciente diagnosticada com um tumor primrio de mama do tipo ErbB2 e uma posterior metstase pulmonar. Essa srie composta pela linhagem obtida a partir do tecido normal 16N, pelas linhagens correspondentes ao carcinoma primrio 21PT e 21NT e pelas linhagens obtidas um ano aps o diagnstico inicial, a partir da efuso pleural no stio metastatico 21MT1 e 21MT2. O miRNAoma da srie 21T revelou uma reduo significativa nos nveis de miR-205 e nos nveis da proteina e-caderina e um enriquecimento do fator pr-metasttico ZEB-1 nas clulas 21MT. Considerando a importncia dos miRNAs na regulao da apoptose, e que a irradiao em diferentes espectros comumente usada em procedimentos de diagnstico como mamografia e na radioterapia, avaliamos a expresso de miRNAs aps irradiao de alta e baixa energia e do tratamento doxorrubicina. Para os ensaios foram utilizados as linhagens no tumorais MCF-10A e HB-2 e as linhagens de carcinoma da mama MCF-7 e T-47D. Observou-se que raios-X de baixa energia so capazes de promover quebras na molcula do DNA e apoptose assim como, alterar sensivelmente miRNAs envolvidos nessas vias como o let-7a, miR-34a e miR-29b. No que diz respeito resposta a danos genotxicos, uma regulao positiva sobre a expresso de miR-29b, o qual em condies normais regulado negativamente foi observada uma regulao positiva sobre miR-29b expresso aps todos os tratamentos em clulas tumorais. Nossos resultados indicam que miR-29b um possvel biomarcador de estresse genotxico e que miR-205 pode participar no potencial metasttico das clulas 21T.
Resumo:
Alguns Bastonetes Gram-negativos no fermentadores (BGNNF) costumam ser considerados clinicamente pouco significantes e a sua implicao em infeces subestimada. Devido similaridade fenotpica, mudanas taxonmicas, baixa reatividade bioqumica e limitaes nos bancos de dados em sistemas comerciais, a identificao de BGNNF frequentemente equivocada, culminando com a denominao de diferentes micro-organismos apenas como BGNNF, por falta de melhor diferenciao. O objetivo desse estudo foi avaliar, por mtodos fenotpico convencional, protemico e molecular, a identificao de BGNNF incomuns isolados em hemoculturas de pacientes atendidos em um hospital universitrio no Rio de Janeiro. Foram selecionadas 78 amostras isoladas de hemoculturas caracterizadas no laboratrio clinico como BGNNF para a identificao por sequenciamento dos genes 16S RNA e recA, por um conjunto amplo de testes fenotpicos manuais e por MALDI-TOF MS. Os micro-organismos predominantes na amostragem foram genotipados pela tcnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Pelo sequenciamento do gene 16S rRNA, a maioria das amostras (n=31; 40%) foi includa no gnero Burkholderia, seguido de Pseudomonas stutzeri (10%) e Delftia acidovorans (4%). Os demais isolados foram agrupados em 27 diferentes espcies. O sequencimento do gene recA identificou a maioria das espcies de Burkholderia como Burkholderia contaminans (n=19; 24%). Os testes fenotpicos incluram as 31 amostras apenas no CBc e para as outras 47 amostras, a concordncia com o sequenciamento do gene 16S rRNA em nvel de espcie foi de 64% (n=30) e apenas em gnero a concordncia foi de 17% (n=8). A anlise comparativa geral da identificao por MALDI-TOF MS com o sequenciamento do gene16S rRNA mostrou que 42% (n=33) das 78 amostras foram concordantes em nvel de espcie e 45% (n=35) apenas em gnero. Excluindo as amostras do CBc, houve um aumento da concordncia em nvel de espcie para 60%. As discordncias parecem ser devido s diferenas nos perfis proteicos das amostras em relao s amostras-referncia do banco de dados do equipamento e podem ser aprimorados com a atualizao de perfis no sistema. A anlise do polimorfismo gentico de B. contaminans mostrou a ausncia de um clone disseminado causando surto, alm da provvel origem ambiental das infeces. Os setores de nefrologia e hemodilise contriburam com maior nmero de pacientes com amostras positivas (5 pacientes e 9 amostras). Os grupos clonais BcoD e BcoE foram encontrados em pacientes assistidos no mesmo setor com diferena de quatro meses (BcoD, nefrologia) e 1,5 ano (BcoE, hemodillise), entre as culturas, respectivamente. As discordncias entre as tcnicas ocorreram principalmente devido a dificuldade de identificao das espcies do CBc. Os BGNNF incomuns so de difcil caracterizao independente da metodologia usada e nenhum mtodo por si s foi capaz de identificar todas as amostras.
