Estudo do reparo das lesões induzidas no DNA de Escherichia coli pela radiação ultravioleta C (UVC)

Didaticamente, podemos dividir o espectro da radiação ultravioleta (UV) em três faixas: UVA (400 a 320 nm), UVB (320 a 290 nm) e UVC (290 a 100 nm). Apesar do UVC ou UV-curto ser eficientemente filtrado pela camada de ozônio da Terra e sua atmosfera, este é uma das faixas do espectro de UV mais usadas para explorar as consequências de danos causados ao DNA, já que a letalidade induzida por este agente está relacionada aos danos diretos no genoma celular, como as lesões dímero de pirimidina, que são letais se não reparadas. Contudo, demonstrou-se que a radiação UVC pode gerar espécies reativas de oxigênio (ERO), como o oxigênio singleto (1O2). Embora, o radical hidroxil (OH) cause modificações oxidativas nas bases de DNA, alguns trabalhos indicam que o 1O2 também está envolvido nos danos oxidativos no DNA. Esta ERO é produzida por vários sistemas biológicos e reações fotossensibilização, quando cromóforos são expostos à luz visível ou são excitados pela luz UV, permitindo que essa energia possa ser transferida para o oxigênio sendo convertido em 1O2, que é conhecido por modificar resíduos de guanina, gerando 8-oxoG, que caso não seja reparada pode gerar uma transversão GC-TA. O objetivo deste trabalho foi o de elucidar a participação de ERO nos efeitos genotóxicos e mutagênicos gerados pela radiação UVC, assim como as enzimas envolvidas no processo de reparação destas lesões em células de Escherichia coli. Nos ensaios as culturas foram irradiadas com o UVC (254 nm; 15W General Electric G15T8 germicidal lamp, USA). Nossos resultados mostram que o uso de quelantes de ferro não alterou a letalidade induzida pelo UVC. A azida sódica, um captador de 1O2, protegeu as cepas contra os danos genotóxicos gerados pelo UVC e também diminuiu a frequência de mutações induzidas no teste com rifampicina. A reversão específica GC-TA foi induzida mais de 2,5 vezes no ensaio de mutagênese. A cepa deficiente na proteína de reparo Fpg, enzima que corrige a lesão 8-oxoG, apresentou menos quebras no DNA do que a cepa selvagem no ensaio de eletroforese alcalina. A letalidade induzida pelo UVC foi aumentada nos mutantes transformados com o plasmídeo pFPG, ao mesmo tempo que representou uma redução na indução mutagênica. Houve dimuição na eficiência de transformação com plasmídeo pUC 9.1 na cepa fpg quando comparado a cepa selvagem. Assim como, um aumento da sensibilidade ao UVC na associação entre mutantes fpg e uvrA. Estes resultados mostram que o 1O2 participa dos danos induzidos pelo UVC, através da geração da lesão 8-oxoG, uma lesão mutagênica, que é reparada pela proteína Fpg

Didactically, we can divide the ultraviolet radiation (UV) spectrum into three bands: UVA (400 to 320 nm), UVB (320-290 nm) and UVC (290-100 nm). Despite the UVC or far-UV be efficiently filtered by Earths ozone layer and its atmosphere, this is one of bands of UV spectrum used to explore the consequences of DNA damages, since the UVC-induced lethality is related to direct damage in genome cells, such as pyrimidine dimers, which are lethal if not repaired. However, it was shown that UVC radiation can generate reactive oxygen species (ROS) such as singlet oxygen (1O2). Although hydroxyl radical (OH) cause oxidative modifications in DNA bases, some works suggests that 1O2 is also involved in oxidative DNA damage. This ROS is produced by several biological systems and photosensitivity reactions when chromophores are exposed to visible light or excited by UV light, allowing that energy can be transferred to the oxygen being converted to 1O2, which is known to modify guanine residues, generating 8-oxoG, if not repaired can lead to a GC-TA transversion. The objective of this work was to elucidate the ROS involvement in the genotoxic and mutagenic effects generated by UVC radiation, as well as the enzymes involved in the repair process of these lesions in Escherichia coli cells. In the assays, cultures were irradiated with UVC (254 nm, 15 W General Electric germicidal lamp G15T8, USA). Our results show that the use of iron chelators did not affect the UVC-induced lethality. The sodium azide, a 1O2 quencher, protected strains against the genotoxic damage produced by UVC and also decreased the frequency of mutations induced in rifampicin assay. Reversal specific GC-TA was induced more than 2.5 fold in the mutagenesis assay. The deficient strain in the repair protein Fpg, an enzyme that corrects 8-oxoG lesions, had less DNA breakage than the wild strain in electrophoresis alkaline assay. The UVC-induced lethality was increased in mutants transformed with the pFPG plasmid, while representing a decrease in mutagenic induction. There was a reduction in the transformation efficiency with plasmid pUC 9.1 on Fpg-strain compared to wild-type strain. Also there was a lethality increase in the association between fpg and uvrA mutants. These results shows that 1O2 participates in UVC-induced damages through the generation of 8-oxoG lesion, a mutagenic lesion that is repaired by the Fpg protein.