Produção e purificação da proteína rica em gla (grp) humana recombinante

Dissertação de mest., Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Univ. do Algarve, 2011

Clonagem, Expressão e Purificação da Proteína Telomérica LaTRF em sistema bacteriano (pMAL)

As proteínas da família TRF2 (“TTAGGG repeat-binding factor 2”) fazem parte de complexos multiprotéicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos. Elas apresentam domínios funcionais que a caracterizam como proteínas que interagem com DNA telomérico na forma de dupla fita. São eles, o domínio de interação com o DNA do tipo Myb-like, localizado na porção C-terminal, um domínio acídico N-terminal e um domínio de homodimerização TRFH (“TRF homology domain for homodimerization”). A proteína TRF2 também está envolvida na formação de estruturas teloméricas terminais denominadas “t-loops”. O intuito deste projeto é a clonagem, expressão em vetor bacteriano (pMAL) e a purificação de uma proteína homóloga as proteínas teloméricas TRFs humana em parasitas do gênero Leishmania, especificamente a espécie Leishmania amazonensis (LaTRF). Primeiramente foram desenhados iniciadores (primers) utilizados para a amplificação da sequência LaTRF por PCR. O(s) produto(s) de amplificação foram clonados em vetores de clonagem para produtos de PCR e sequenciados para análise. Uma vez obtida a seqüência da LaTRF, o inserto contendo o gene foi subclonado direcionalmente e na mesma fase de leitura do vetor de expressão bacteriano (pMAL-c5x, NEB) para obtenção e futura purificação da proteína recombinante. Verificou-se a expressão da proteína recombinante LaTRF utilizando SDS-PAGE e “Western Blot”. Pelos resultados obtidos na análise de expressão em pequena escala da proteína recombinante, foi observado possíveis indícios de que esta esteja sendo expressa. Com isso, torna-se possível a tentativa de uma expressão em grande escala utilizando esse mesmo sistema bacteriano (pMAL) a fim de se obter a proteína purificada que poderá ser futuramente utilizada para ensaios de “pull-down” dentre outras aplicações

Clonagem, expressão e purificação de domínios da proteína AtRLI2 (RNase L Inhibitor), um supressor endógeno de silenciamento por RNA de Arabidopis thaliana, visando estudos estruturais

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Proteína capsidial do Rupestris stem pitting-associated vírus: seqüenciamento do gene, expressão em Escherichia coli, purificação e produção de anti-soro policlonal

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

Estudo das interações entre proteína NS1 do hRSV e flavonóides utilizando métodos biofísicos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo do exossomo de Archaea e de sua interação com a proteína reguladora PaNip7

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'→5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo.

Recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli e remoção de endotoxina utilizando adsorção em leito expandido

The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.

Análise da interação entre moléculas desenhadas a partir do ácido anacárdico e a proteína PPAR usando ferramentas in silico

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.

Desenvolvimento de kit para quantificação enzimática de etanol

A dosagem do etanol durante a produção de medicamentos, bebidas e combustíveis tem se mostrado bastante importante para o aumento de rendimento dos processos e qualidade dos produtos. Embora existam vários métodos para determinar a concentração do etanol, os enzimáticos são os mais interessantes por serem rápidos, precisos, de fácil manuseio e baixo custo. O objetivo geral desse trabalho foi a elaboração de um Kit de quantificação enzimática de etanol, utilizando a enzima álcool desidrogenase I recombinante de S. cerevisiae (Adh1). Para isso, o gene codificador da enzima álcool desidrogenase I (ADH1) de levedura foi clonado no vetor pET28a para expressão em E. coli (BL21). Em seguida, a produção e solubilidade da enzima álcool desidrogenase I foi determinada, sendo definida uma condição ideal de produção e purificação da proteína recombinante por cromatografia de afinidade. A atividade enzimática da álcool desidrogenase I purificada foi determinada através de ensaios já padronizados na literatura (UV), bem como sua estabilidade em diversas condições de tempo e temperatura. Os resultados obtidos aqui demonstraram que a enzima obtida apresentou boa atividade biológica in vitro, com sensibilidade na detecção de no mínimo 2,3 x 10–4 g/L de etanol em 2 minutos. Além disso, a proteína purificada teve sua atividade preservada quando estocada a - 20°C durante 120 dias, características que possibilitarão que a enzima álcool desidrogenase I recombinante, purificada pela metodologia apresentada nesse trabalho, seja utilizada em um kit de quantificação enzimática de etanol rápido, preciso e de baixo custo

Expressão heteróloga de biossurfactantes identificados em bibliotecas metagenômicas

The microorganisms have a vast genetic diversity and they are present throughout the biosphere, however, only about 1% of the species can be cultivated by traditional cultivation techniques. Within this diversity there is a huge pool genetic and biological being explored. The metagenomics has enabled direct access to microbial genome derived from environmental samples using independent methods of cultivation. The methodology enables to obtain functional information about the proteins, as well as identify potential products with biotechnological interest and new industrially exploitable biological resources, such as new solutions to environmental impacts. Oil-contaminated areas are characterized by a large accumulation of hydrocarbons and surfactants may be used for bioremediation. Thus, the metagenomic approach was used in this study in order to select genes involved in the degradation and hydrocarbon emulsification. In a previous work, the environmental DNA (eDNA) was extracted from soil samples collected from two different areas (Caatinga and Saline River) of Rio Grande do Norte (Brazil), the metagenomic libraries were constructed and functionally analyzed. The clone able to degrade the oil was evaluated for the ability to synthesize biosurfactants. The sequence analysis revealed an ORF with 897 bp, 298 amino acids and a protein with around 34 kDa. The search for homology in GenBank revealed sequence similarity with a hypothetical protein of representatives Halobacteriaceae family, who were recently shown as strains producing biosurfactants. The presence of the inserted coding sequence and the acquired phenotype was confirmed. Primers were designed and the ORF amplified by PCR. The ORF was subcloned into pETDuet-1 expression vector for subsequent purification of the protein of interest containing a histidine tail. The tests performed to confirm the biosurfactant activity and the ability of hydrocarbon degradation showed positive results. The immunodetection test (western blot) using the monoclonal AntiHis® confirmed the presence of the environmental protein. This study was the first to report a possible protein with biosurfactant activity obtained from a metagenomic approach

Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular Hsp65 de Mycobacterium leprae & caracterização da proteína NUDEL - nuclear distribuition element-like

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Clonagem, expressão e purificação de três mutantes truncados da proteína LaRPA-1 de Leishmania amazonensis

A leishmaniose é uma doença que atinge milhões de pessoas no mundo e, de acordo com a FUNASA, está se espalhando por todas as regiões do Brasil. O tratamento desta zoonose é ineficaz, pois os fármacos utilizados apresentam muitos efeitos colaterais e colaboram com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Portanto um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar o descobrimento de novas terapias e desenvolvimento de drogas antiparasitárias. O complexo telomérico é formado pela interação de DNA com proteínas, sendo que estas últimas podem também interagir entre si. A proteína RPA de eucariotos compreende um complexo trimérico subdividido em três subunidades. Este cumpre independentemente ou juntamente com outras proteínas diversas funções vitais para a célula, entre elas, auxiliar na manutenção dos telômeros e ajudar a recrutar a telomerase. Além disso, ela parece ser um dos principais componentes do complexo de proteínas que interagem com o terminal simples fita telomérico de protozoários tripanosomatídeos. Curiosamente, em Leishmania spp., as subunidades 2 e 3, ao contrário da subunidade 1 da RPA, não fazem parte do complexo telomérico. Portanto a LaRPA-1 pode apresentar comportamentos peculiares quando comparada a RPA dos outros eucariotos, e se tornar um importante alvo ao se estudar a biologia molecular do parasita. Este trabalho tem como objetivo clonar, expressar e purificar os três diferentes mutantes truncados da proteína LaRPA-1 para, futuramente, utilizar-se estas proteínas recombinantes como ligantes em ensaios de interação proteína:proteína, visando mapear possíveis sítios ou domínios na proteína LaRPA-1.O gene que codifica LaRPA-1 já encontrava-se clonado e sequenciado no laboratório de Telômeros da UNESP de Botucatu....(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Purificação e caracterização de proteínas Gla nos modelos peixe e mamífero

Dissertação de Mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2010

Isolamento e caracterização de uma proteína tóxica produzida por um isolado açoriano de Bacillus weihenstephanensis

Dissertação de Mestrado, Biotecnologia em Controlo Biológico, 27 de Junho de 2013, Universidade dos Açores.