Estudo do exossomo de Archaea e de sua interação com a proteína reguladora PaNip7

O exossomo é um complexo multiproteico conservado evolutivamente de archaea a eucariotos superiores que desempenha funções celulares essenciais tais como: atividade exoribonucleolítica 3\'→5\', regulação dos níveis de mRNA, maturação de RNAs estruturais e controle de qualidade de RNAs durante os vários estágios do mecanismo de expressão gênica. Em Archaea, o exossomo é composto por até quatro subunidades diferentes, duas com domínios de RNase PH, aRrp41 e aRrp42, e duas com domínios de ligação a RNAs, aCsl4 e aRrp4. Três cópias das proteínas aRrp4 e/ou aCsl4 se associam com o núcleo hexamérico catalítico do anel de RNase PH e completam a formação do complexo. A proteína PaNip7 é um cofator de regulação do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi e atua na inibição do complexo enzimático ligando-se simultaneamente ao exossomo e a RNAs. Neste projeto, a reconstituição in vitro do exossomo da archaea Pyrococcus abyssi formado pela proteína de topo PaCsl4 foi obtida. Para tanto foram realizadas análises de interação proteica usando as técnicas de cromatografia de afinidade, gel filtração e SDS-PAGE. Em adição à formação da isoforma PaCsl4-exossomo, um fragmento peptídico correspondente à região C-terminal da PaNip7 foi sintetizado pelo método da fase sólida, purificado por RP-HPLC e o purificado foi caracterizado por LC/ESI-MS almejando realizar futuros experimentos de interação com o exossomo.

The exosome is a multiprotein complex evolutionarily conserved from archaea to higher eukaryotes that performs essential cellular functions such as: 3\'→5\' exoribonucleolytic activity, regulation of mRNA levels, maturation of structural RNAs and quality control of RNAs during the various stages of the gene expression mechanism. In Archaea, the exosome is composed of up to four different subunits, two with RNase PH domains, aRrp41 and aRrp42, and two with RNAs binding domains, aCsl4 and aRrp4. Three copies of the aRrp4 and/or aCsl4 proteins associate with the hexameric catalytic core of the RNase PH ring and complete the formation of the complex. The PaNip7 protein is a regulating cofactor of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome and acts in the inhibition of the enzyme complex by binding simultaneously to the exosome and RNAs. In this project, the reconstitution in vitro of the Pyrococcus abyssi archaeal exosome formed by the PaCsl4 top protein was achieved. To this end protein interaction analyses were performed using affinity chromatography, gel filtration and SDS-PAGE techniques. In addition to the formation of the PaCsl4-exosome isoform, a peptide fragment corresponding to the C-terminal region of PaNip7 was synthesized by solid-phase method, purified by RP-HPLC and the purified peptide was characterized by LC/ESI-MS aiming to perform future binding experiments with the exosome.