Desenvolvimento de um sistema de expressão em Metarhizium anisopliae baseado no promotor homólogo do gene tef-1 α

Vetores de expressão são ferramentas moleculares úteis para investigar a função de genes tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos. O fungo Metarhizium anisopliae, utilizado no controle biológico de artrópodes, é bem caracterizado em nível molecular. Genes candidatos a participar do processo de infecção de hospedeiros tem sido isolados utilizando estratégias em que o gene candidato é predefinido (enzimas hidrolíticas, por exemplo) ou estratégias mais globais como projetos de ESTs e a análise de bibliotecas de subtração. A superexpressão tem sido o método adotado para verificar a participação de genes isolados no processo de infecção. Esta estratégia tem sido baseada no promoter heterólogo PgpdA de Aspergillus nidulans. Neste trabalho, o gene que codifica o fator de alongamento de tradução tef-1 α de Metarhizium anisopliae foi clonado e a sua região promotora foi localizada e utilizada na construção de um vetor de expressão. Somente uma cópia do gene tef-1α está presente no genoma de M. anisopliae e o seu perfil de expressão foi analisado. Uma árvore filogenética foi construída baseada nos ortógos de tef-1 α e mostrou uma alta correlação com o fungo Cordyceps taii. A região de 639 pb à montante do codon de iniciação (ATG) foi utilizada com sucesso para a expressão do gene repórter sGFP e do gene bar, que confere resistência ao glifosinato de amônio, em M. anisopliae. Os transformantes construídos não apresentaram alteração na sua virulência em bioensaios com carrapatos, em relação a linhagem receptora. Além disso, demonstramos que o nível de expressão permite a detecção óptica da fluorescência de sGFP durante a infecção dos carrapatos. Desta forma, o vetor desenvolvido será uma ferramenta útil para a superexpressão em Metarhizium.

Caracterização de genes de quitanases do entomopatógeno e acaricida Metarhizium anisopliae

O fungo entomopatogênico e acaricida Metarhizium anisopliae é patógeno de uma vasta gama de insetos, sendo extensivamente utilizado em experimentos, bem como, no controle efetivo de alguns insetos-praga. Seu potencial uso para o controle de carrapatos como Boophilus microplus é também considerável. O processo de infecção de M. anisopliae é o melhor caracterizado entre os fungos entomopatogênicos, e combina pressão mecânica, por diferenciação do apressório, síntese e secreção de enzimas hidrolíticas altamente reguladas como proteases e, provavelmente, quitinases e lipases. As quitinases em fungos também são importantes em processos que requerem digestão celular, como germinação, crescimento e ramificação das hifas e autólise, visto que a quitina é o maior constituinte da parede celular desses organismos, sendo um sistema altamente regulado. Objetivamos neste trabalho, obter mais informações sobre o sistema quitinolitico do fungo M. anisopliae var. anisopliae linhagem E6 durante o processo de infecção do hospedeiro ou na morfogênese e crescimento. Com o objetivo de analisarmos o gene chi2 de M. anisopliae E6, clonamos e caracterizamos sua seqüência genômica, incluindo a região flanqueadora 5’. O gene chi2 é interrompido por dois pequenos íntrons típicos, de 210 pb e 75 pb, respectivamente. A ORF do gene chi2 apresenta 1.545 pb e codifica uma proteína predita de 419 aminoácidos (denominada CHI2), com massa molecular estimada de 44 kDa. Um peptídeo sinal característico com sítio de clivagem no aminoácido V19 está presente. A forma madura dessa proteína tem uma massa molecular estimada de 42 kDa e um pI teórico de 4,8. Análise por Southern de DNA genômico indica cópia única de chi2 no genoma de M. anisopliae. A seqüência de consenso SXGG, correspondendo ao sítio de ligação à quitina, foi identificada e a seqüência NGFDFDIE, que compõem o domínio catalítico de quitinases, está presente em CHI2. A construção de uma árvore filogenética determinou que a quitinase CHI2 pertence a um grupo diferente daquele da CHIT42 a qual provavelmente não está envolvida na patogenicidade. Uma análise in sílico da seqüência 5’ franqueadora do gene chi2 para determinação de possíveis elementos regulatórios foi efetuada. A regulação da transcrição dos genes chit1 e chi2 em M. ansisoplaie frente a diferentes fontes de carbono e em diferentes tempos de cultivo foi analisada. Os genes chit1 e chi2 apresentaram uma expressão tardia no fungo, a partir de 30 horas. O gene chi2 foi expresso majoritariamente em cultivos com quitina e sua expressão foi reprimida por glicose. O gene chit1 foi induzido em presença de fontes de carbono facilmente assimiláveis, como glicose e NAcGlc. Ambos os genes, chit1 e chi2, apresentaram alta expressão quando a fonte de carbono já estava exaurida e o fungo estava em autólise, sugerindo o requerimento dessas enzimas nessa fase. O cDNA do chit1 foi inserido em um vetor de expressão, em ambas orientações senso e antisenso, sob regulação do promotor do gene tef1α de M. anisopliae e o terminador do gene trpC de A. nidulans. Os transformantes com o gene chit1 na orientação senso mostraram superexpressão de atividade de quitinase e o transformante com o gene na orientação antisenso apresentou uma redução na atividade de quitinase. Também construímos quatro deleções na região flanqueadora 5’ do gene chit1 fusionadas com a proteína repórter SGFP, para localizar seqüências reguladoras no promotor e, destas construções, três foram transformadas em M. anisopliae.

Produção e purificação de β-1,3 glicanases em Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.

Caracterização e comparação de genes expressos em ápices meristemáticos de cana-de-açúcar cultivados em SP e RN

In this work, we used sugarcane as a model due to its importance for sugar and ethanol production. Unlike the current plant models, sugarcane presents a complex genetics and an enormous allelic variation. Here, we report the analysis of SAGE libraries produced using the shoot apical meristem from contrasted genotypes by flowering induction (non-flowering vs. early-flowering varieties) grown under São Paulo state conditions. The expression pattern was analyzed using samples from São Paulo (SP) and Rio Grande do Norte (RN) states. These results showed that cDNAs identified by SAGE libraries had differential expression only in São Paulo state samples. Furthermore, the cDNA identified CYP (Citocrome P450) was chosen for in silico and genome characterization because it was found in SAGE libraries and subtractive libraries from samples from RN. Phylogenetic trees showed the relationship for these sequences. Furthermore, the qRT-PCR for CYP showed a potential role as flowering indutor for RN samples considering different isophorms. Considering the results present here, it can be consider that CYP gene may be used as molecular marker

Resposta de Chromobacterium Violaceum cultivada em alta concentração de ferro

The Chromobacterium violaceum is a β-proteobacterium Gram-negative widely found in tropical and subtropical regions, whose genome was sequenced in 2003 showing great metabolic versatility and biotechnological and pharmaceutical potential. Given the large number of ORFs related to iron metabolism described in the genome of C. violaceum, the importance of this metal for various biological processes and due to lack of data about the consequences of excess of iron in free-living organisms, it is important to study the response mechanism of this bacterium in a culture filled with iron. Previous work showed that C. violaceum is resistant to high concentrations of this metal, but has not yet been described the mechanism which is used to this survival. Thus, to elucidate the response of C. violaceum cultured in high concentrations of iron and expecting to obtain candidate genes for use in bioremediation processes, this study used a shotgun proteomics approach and systems biology to assess the response of C. violaceum grown in the presence and absence of 9 mM of iron. The analysis identified 531 proteins, being 71 exclusively expressed by the bacteria grown in the presence of the metal and 100 just in the control condition. The increase in expression of proteins related to the TCA cycle possibly represents a metabolic reprogramming of the bacteria caused by high concentration of iron in the medium. Moreover, we observed an increase in the activity assay of superoxide dismutase and catalase as well as in Total Antioxidant Activity assay, suggesting that the metal is inducing oxidative stress in C. violaceum that increases the levels of violacein and antioxidant enzymes to better adapt to the emerging conditions. Are also part of the adaptive response changes in expression of proteins related to transport, including iron, as well as an increased expression of proteins related to chemotaxis response, which would lead the bacteria to change the direction of its movement away from the metal. Systems Biology results, also suggest a metabolic reprogramming with mechanisms coordinated by bottleneck proteins involved in transcription (GreA), energy metabolism (Rpe and TpiA) and methylation (AhcY)

Análise filogenética e funcional de dois genes de reparo homólogos a AP endonuclease em cana-de-açúcar: ScARP1 e ScARP3

The genome of all organisms constantly suffers the influence of mutagenic factors from endogenous and/or exogenous origin, which may result in damage for the genome. In order to keep the genome integrity there are different DNA repair pathway to detect and correct these lesions. In relation to the plants as being sessile organisms, they are exposed to this damage frequently. The Base Excision DNA Repair (BER) is responsible to detect and repair oxidative lesions. Previous work in sugarcane identified two sequences that were homologous to Arabidopsis thaliana: ScARP1 ScARP3. These two sequences were homologous to AP endonuclease from BER pathway. Then, the aim of this work was to characterize these two sequence using different approaches: phylogenetic analysis, in silico protein organelle localization and by Nicotiana tabacum transgenic plants with overexpression cassette. The in silico data obtained showed a duplication of this sequence in sugarcane and Poaceae probably by a WGD event. Furthermore, in silico analysis showed a new localization in nuclei for ScARP1 protein. The data obtained with transgenic plants showed a change in development and morphology. Transgenic plants had slow development when compared to plants not transformed. Then, these results allowed us to understand better the potential role of this sequence in sugarcane and in plants in general. More work is important to be done in order to confirm the protein localization and protein characterization for ScARP1 and ScARP3

Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à resposta ao estresse

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress.

Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC

Chromobacterium violaceum is a free-living bacillus, Gram-negative commonly found in water and sand of tropical and subtropical regions. One of its main characteristic it's the ability to produce the purple pigment named violacein, that shows countless biological activities. In 2003, the genome of this organism was totally sequenced and revealed important informations about the physiology of this bacteria. However, few post-genomics studies had been accomplished. This work evaluated the protein profile of C. violaceum cultivated in LB medium at 28ºC that allowed the identification and characterization of proteins related to a possible secretion system that wasn't identified and characterized yet in C. violaceum, to the quorum sensing system, to regulatory process of transcription and translation, stress adaptation and biotechnological potential. Moreover, the response of the bacteria to UVC radiation was evaluated. The comparison of the protein profile, analyzed through 2-D electrophoresis, of the control group versus the treatment group allowed the identification of 52 proteins that arose after stress induction. The obtained results enable the elaboration of a stress response pathway in C. violaceum generated by the UVC light. This pathway, that seems to be a general stress response, involves the expression of proteins related to cellular division, purine and pirimidine metabolism, heat chock or chaperones, energy supply, regulation of biofilm formation, transport, regulation of lytic cycle of bacteriophages, besides proteins that show undefined function. Despite the response present similarities with the classic SOS response of E. coli, we still cannot assert that C. violaceum shows a SOS-like response, mainly due to the absence of characterization of a LexA-like protein in this organism

Proteômica diferencial da Chromobacterium violaceum em resposta ao estresse oxidativo induzido por peróxido de hidrogênio

The β-proteobacterium Chromobacterium violaceum is a Gram-negative, free-living, saprophytic and opportunistic pathogen that inhabits tropical and subtropical ecosystems among them, in soil and water of the Amazon. It has great biotechnological potential, and because of this potential, its genome was completely sequenced in 2003. Genome analysis showed that this bacterium has several genes with functions related to the ability to survive under different kinds of environmental stresses. In order to understand the physiological response of C. violaceum under oxidative stress, we applied the tool of shotgun proteomics. Thus, colonies of C. violaceum ATCC 12472 were grown in the presence and absence of 8 mM H2O2 for two hours, total proteins were extracted from bacteria, subjected to SDS-PAGE, stained and hydrolysed. The tryptic peptides generated were subjected to a linear-liquid chromatography (LC) followed by mass spectrometer (LTQ-XL-Orbitrap) to obtain quantitative and qualitative data. A shotgun proteomics allows to compare directly in complex samples, differential expression of proteins and found that in C. Violaceum, 131 proteins are expressed exclusively in the control condition, 177 proteins began to be expressed under oxidative stress and 1175 proteins have expression in both conditions. The results showed that, under the condition of oxidative stress, this bacterium changes its metabolism by increasing the expression of proteins capable of combating oxidative stress and decreasing the expression of proteins related processes bacterial growth and catabolism (transcription, translation, carbon metabolism and fatty acids). A tool with of proteomics as an approach of integrative biology provided an overview of the metabolic pathways involved in the response of C. violaceum to oxidative stress, as well as significantly amplified understanding physiological response to environmental stress. Biochemical and "in silico" assays with the hypothetical ORF CV_0868 found that this is part of an operon. Phylogenetic analysis of superoxide dismutase, protein belonging to the operon also showed that the gene is duplicated in genome of C. violaceum and the second copy was acquired through a horizontal transfer event. Possibly, not only the SOD gene but also all genes comprising this operon were obtained in the same manner. It was concluded that C. violaceum has complex, efficient and versatile mechanisms in oxidative stress response

Fatores de risco individuais e familiares no desenvolvimento da pré-eclâmpia

Preeclampsia is a spectral disease, with different clinical forms which can evolve with severe multisystemic complications. This present study aimed to determine the risk factors associated with preeclampsia (PE); to validate the existence of aggregation of hypertensive disease in families of women with preeclampsia and verify the existence of association between polymorphisms in the VEGF gene and level of VEGF and its soluble receptor (sFlt1). A case-control study was performed (n = 851). Genotyping of VEGF was performed and serum levels of VEGF and sFlt1 were measured by ELISA. It was observed that 38% of mothers (173, 455) of a case of preeclampsia and 30.8% (78 of 361) of controls had history of hypertension (p <0.0001). Similarly, when examining the history of maternal preeclampsia, we observed that 14.6% (48 of 328) of mothers of women with preeclampsia and 9.6% (12 of 294) of mothers of controls had a history of preeclampsia (p = 0.0001). As for maternal history of preeclampsia, we found that 5.1% (15 of 295) of cases and 3.6% (7 of 314) of controls had a history of preeclampsia (p = 0.0568). Sisters of women with preeclampsia also had a history of hypertensive disease in 9% (41 of 455) versus 6.6% (13 of 361), p = 0.002. Similarly when examining the history of preeclampsia in sisters, it was observed that 22.7% (57 of 251) of a sister of case versus 11.4% (26 of 228) of controls had a history of preeclampsia (P = 0.0011). We observed a decrease in free VEGF in the serum of patients (P <0.05) and increased soluble VEGF receptor. There was no association between polymorphisms in the VEGF gene and preeclampsia. The data obtained in this work validate that hypertensive disease in mothers and sisters with preeclampsia are risk factors for preeclampsia. The risk of illness in the family is higher according to disease severity. High incidence of preeclampsia can be assumed by the high incidence of this disease among the controls. Significant differences between the frequency of preeclampsia in mothers of cases and controls indicate familial factors. Work is being conducted with the to eventually perform genome wide association studies to identify susceptibility loci

Fatores genéticos e étnicos relacionados à evolução da infecção por Leishmania infantum

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Polimorfismos do gene MSX1 e a fenda labio e/ou palatina não-sindrômica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

A search for markers of sugarcane evolution

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo dos genes do complexo do antígeno leucocitário humano (hla) associados à susceptibilidade ao diabetes mellitus tipo 1

Of all of the genes associated with the development of Diabetes mellitus type 1 (T1D), the largest contribution comes from the genes in the Human Leukocyte Antigen (HLA) region, mostly the class II DR e DQ genes. Specific combinations of alleles DRB1, DQA1 and DQB1 constituting haplotypes, and further, a combination of more than one haplotype, providing multilocus genotypes are associated with susceptibility, protection and neutrality to DM1. Thus, the aim of present study was to verified the association of polymorphisms of HLA genes class II with susceptibility to type 1 diabetes mellitus (T1D). Ninety-two patients with T1D and 100 individuals normoglycemics (NG) aged between 6 and 20 years were studied. Genomic DNA was obtained from peripheral whole blood, collected in EDTA tube, using the extraction kit Illustra Triple Prep®, GE Healthcare. For HLA typing was used DNA LABType system by One Lambda kit applying Luminex® technology to the method of PCRSSO typing reverse. The alleles DRB1*03:01, *04:05, *04:01, *04:02, DQA1*03:01g, *05:01g, DQB1*02:01g, *03:02, the haplotypes DRB1*03:01-DQA1*05:01-DQB1*02:01, DRB1*04:05-DQA1*03:01g-DQB1*03:02, DRB1*04:02-DQA1*03:01g-DQB1*03:02, DRB1*04:01-DQA1*03:01g-DQB1*03:02 and DR3-DQ2/DR4-DQ8 genotype were significantly associated with the chance of developing T1D. The alleles DRB1*11:01, *15:03, *15:01, *13:01, DQA1*01:02, *04:01g, *01:03, DQB1*06:02, *03:01g, *06:03, *04:02, the haplotypes DRB1*11:01-DQA1*05:01-DQB1*03:01, DRB1*13:01-DQA1*01:03-DQB1*06:03 and DRX-DQX/DRX-DQX genotype, formed by other than the DR3-DQ2 or DR4-DQ8 haplotypes, were significantly associated with T1D protection Despite the major racial Brazilian, even at the regional level, these results are similar to the majority of alleles, genotypes and haplotypes of HLA class II-related susceptibility or resistance to T1D, extensively described in the literature for Caucasian population. Children with age at diagnosis less than 5 years of age had significantly higher frequency of the heterozygous genotype DR3-DQ2/DR4-DQ8 compared to children with age at diagnosis than 5 years old. These results also demonstrate strong association of the genetic profile of the class II HLA for this age group, possibly associated with the severity and rapid progression to the onset of T1D. The knowledge of HLA class II genes may be useful in genetic screens that allow the prediction of T1D

Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource

O café é um dos principais produtos agrícolas, sendo considerado o segundo item em importância do comércio internacional de commodities. O gênero Coffea pertence à família Rubiaceae que também inclui outras plantas importantes. Este gênero contém aproximadamente 100 espécies, mas a produção comercial é baseada somente em duas espécies, Coffea arabica e Coffea canephora, que representam aproximadamente 70 % e 30 % do mercado total de café, respectivamente. O Projeto Genoma Café Brasileiro foi desenvolvido com o objetivo de disponibilizar os modernos recursos da genômica à comunidade científica e aos diferentes segmentos da cadeia produtiva do café. Para isso, foram seqüenciados 214.964 clones escolhidos aleatoriamente de 37 bibliotecas de cDNA de C. arabica, C. canephora e C. racemosa representando estádios específicos do desenvolvimento de células e de tecidos do cafeeiro, resultando em 130.792, 12.381 e 10.566 seqüências de cada espécie, respectivamente, após processo de trimagem. Os ESTs foram agrupados em 17.982 contigs e em 32.155 singletons. A comparação destas seqüências pelo programa BLAST revelou que 22 % não tiveram nenhuma similaridade significativa às seqüências no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (de função conhecida ou desconhecida). A base de dados de ESTs do cafeeiro resultou na identificação de cerca de 33.000 unigenes diferentes. Os resultados de anotação das seqüências foram armazenados em base de dados online em http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe. Os recursos desenvolvidos por este projeto disponibilizam ferramentas genéticas e genômicas que podem ser decisivas para a sustentabilidade, a competitividade e a futura viabilidade da agroindústria cafeeira nos mercados interno e externo.