Identificação de genes em Chromobacterium violaceum relacionados à resposta ao estresse

The sequencing of the genome of Chromobacterium violaceum identified one single circular chromosome of 4.8 Mb, in which approximately 40% of the founded ORFs are classified as hypothetical conserved or hypothetical. Some genic regions of biotechnological and biological interest had been characterized, e. g., environmental detoxification and DNA repair genes, respectively. Given this fact, the aim of this work was to identify genes of C. violaceum related to stress response, as the ones involved with mechanisms of DNA repair and/or genomic integrity maintenance. For this, a genomic library of C. violaceum was built in Escherichia coli strain DH10B (RecA-), in which clones were tested to UVC resistance, resulting in five candidates clones. In the PLH6A clone were identified four ORFs (CV_3721 to 3724). Two ORFs, CV_3722 and CV_3724, were subcloned and a synergic complementation activity was observed. The occurrence of an operon was confirmed using cDNA from C. violaceum in a RT-PCR assay. Further, it was observed the induction of the operon after the treatment with UVC. Thus, this operon was related to the stress response in C. violaceum. The mutagenesis assay with rifampicin after the treatment with UVC light showed high frequency of mutagenicity for the ORF CV_3722 (Pol III δ subunit). In this way, we propose that the C. violaceum δ subunit can act in DH10B in the translesion synthesis using Pol IV in a RecA independent-manner pathway. In growth curve assays other four clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B and PLE12H) were able to complement the function at the dose 5 J/m2 and in mutagenicity assays PLE7B, PLE10B and PLE12H showed frequencies of mutation with significant differences upon the control (DH10B), demonstrating that in some way they are involved with the stress response in C. violaceum. These clones appear to be interrelated, probably regulated by a messenger molecule (eg., nucleotide c-di-GMP) and/or global regulatory molecule (eg., σS subunit of RNA polymerase).The results obtained contribute for a better genetic knowledge of this specie and its response mechanisms to environmental stress.

O seqüenciamento do genoma da espécie Chromobacterium violaceum identificou um cromossomo simples circular de 4.8 Mb, no qual aproximadamente 40% das ORFs encontradas são classificadas como hipotéticas conservadas ou hipotéticas. Algumas regiões gênicas de interesse biotecnológico e biológico vêm sendo caracterizadas, como por exemplo, genes de detoxificação ambiental e genes de reparo de DNA, respectivamente. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi identificar genes de C. violaceum envolvidos com a resposta ao estresse, como por exemplo, mecanismos de reparo de DNA e/ou manutenção da integridade genômica. Para tanto, foi construída uma biblioteca genômica de C. violaceum na cepa DH10B de Escherichia coli (RecA-), a qual foi testada para clones resistentes a UVC, resultando na seleção de cinco clones candidatos. Foram identificadas quatro ORFs (CV_3721 a 3724) no clone PLH6A. Das quais, as ORFs CV_3722 e CV_3724, foram subclonadas e uma atividade sinérgica de complementação foi observada. A ocorrência de um operon foi confirmada usando cDNA de C. violaceum em ensaio de RT-PCR. Adicionalmente, foi observada a indução do operon após tratamento com UVC, dessa forma, esse operon foi relacionado à resposta ao estresse em C. violaceum. Ensaios de mutagênese com rifampicina após tratamento com luz UVC mostraram alta freqüência de mutagenicidade para a ORF CV_3722, subunidade δ da Polimerase III. Assim, propomos que esta subunidade de C. violaceum pode agir em DH10B na síntese translesão utilizando Pol IV em uma via RecA independente. Em ensaios de viabilidade outros quatro clones (PLE1G, PLE7B, PLE10B e PLE12H) foram capazes de complementar a função na dose de 5 J/m2. E em ensaios de mutagenicidade PLE7B, PLE10B e PLE12H apresentaram freqüências de mutação com diferenças significativas em relação ao controle (DH10B), demonstrando que de alguma forma eles estão envolvidos na resposta ao estresse em C. violaceum. Estes clones parecem estar inter-relacionados, provavelmente, regulados por molécula mensageira (como o nucleotídeo c-di-GMP) e/ou molécula regulatória global (como a subunidade σS da RNA Polimerase). Os resultados obtidos contribuem para um melhor conhecimento da genética desta espécie e de seus mecanismos de resposta ao estresse ambiental.

2020-01-01