Cultura de tecidos e conservação in vitro de Passiflora foetida L.

O gênero Passiflora ocorre principalmente em regiões de clima tropical, sendo o Brasil um importante centro de diversidade. Passiflora foetida L. é uma espécie silvestre que apresenta características de interesse ornamental e medicinal. O objetivo deste trabalho foi o estabelecimento de sistemas de cultura de tecidos e criopreservação para P. foetida. Explantes caulinares foram excisados de culturas primárias obtidas a partir de plântulas derivadas da germinação in vitro. Para isso foram inoculados em meio MSM, suplementado com diferentes concentrações de ANA, PIC, TDZ e BAP utilizado isoladamente ou em combinação com ANA, e mantidos na presença ou ausência de luz. Foi observada a produção de brotos, calos e raízes adventícias, de acordo com o tipo e a concentração do regulador de crescimento testado e da condição de cultura utilizada. A produção de plantas ocorreu via organogênese direta e indireta em resposta a BAP, enquanto que a formação de calos não morfogênicos foi observada a partir de ambos explantes em resposta a PIC. A produção de raízes adventícias ocorreu em resposta a ANA. Tendo em vista a produção de raízes observada em meio sólido, segmentos internodais foram inoculados em meio líquido suplementado com diferentes auxinas e mantidos em imersão contínua ou sobre pontes de papel de filtro. A maior taxa de multiplicação de raízes foi observada a partir de entrenós mantidos no sistema de ponte de papel de filtro, em resposta a ANA. Segmentos radiculares excisados das culturas primárias também foram utilizados visando à produção de brotos e a multiplicação de raízes. Contudo, apenas foi observada a formação de gemas, sem posterior desenvolvimento de brotos. Além disso, a capacidade proliferativa dos segmentos radiculares inoculados em meio suplementado com ANA foi menor que a obtida a partir dos entrenós cultivados nas mesmas condições. Neste trabalho, foram também testados diferentes protocolos de criopreservação para ápices caulinares de P. foetida por meio de vitrificação e encapsulamento-vitrificação. A recuperação de plantas pós-congelamento foi observada unicamente a partir de ápices encapsulados e expostos à solução de vitrificação PVS2 por 120 minutos. Tendo em vista o potencial medicinal já descrito para P. foetida, através dos diferentes sistemas de cultura desenvolvidos neste trabalho serão obtidos materiais para a avaliação de diferentes atividades biológicas.

Avaliação da trealose como crioprotetor natural de células-tronco hematopoiéticas de sangue de cordão umbilical e placentário

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes.

Conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea L. utilizando cultura de tecidos e criopreservação

A implementação de estratégias visando à conservação de espécies medicinais apresenta grande importância, tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico. Petiveria alliacea L., espécie da família Phytolacaceae, conhecida como guiné, erva-de alho, erva-tipi ou amansa-senhor, pode ser encontrada desde a América Central até a América do Sul. Esta espécie possui ampla utilização medicinal, devido à presença, em sua composição, de vários polissulfetos, como o DTS (dibenziltrissulfeto), com propriedades antifúngica, antineoplásica e imunomodulatória, entre outras. O objetivo deste trabalho foi a conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea obtido de diferentes populações ocorrentes no Rio de Janeiro, através de métodos baseados em cultura de tecidos e criopreservação. Plantas obtidas através da germinação in vitro foram utilizadas como matrizes para a micropropagação através da multiplicação de meristemas pré-existentes em meio MS sem reguladores de crescimento, e embriões somáticos foram obtidos de forma direta a partir da cultura de explantes foliares das linhagens estudadas (Magé MG; Marechal Hermes MH; Niterói NT; Vila Isabel VI e Planta envasada AL), em presença de PIC (20μM) e 2,4D (22,6 μM), após 60 dias de cultivo. Os ápices caulinares das plantas micropropagadas e os embriões somáticos obtidos foram submetidos à criopreservação através de técnicas de vitrificação, encapsulamento-vitrificação e encapsulamento-desidratação, com a avaliação da pré-cultura e de soluções crioprotetoras (PVS2 e PVS3), em diferentes concentrações e tempos de exposição. Os resultados mostraram uma taxa de 100% de germinação in vitro. As condições para a pré-cultura de ápices foram padronizadas, entretanto não foram obtidos resultados positivos após o descongelamento. Por outro lado, os embriões da linhagem AL (linhagem embriogênica em cultura há 24 meses) mantiveram sua capacidade multiplicativa (100%) (embriogênese secundária) quando submetidos à desidratação em sacarose (0,5M) e expostos às soluções de vitrificação PVS2 e PVS3 pelos menores tempos (15 e 30 minutos). Os diferentes meios de recuperação apresentaram respostas variáveis em relação à capacidade multiplicativa dos embriões. O encapsulamento/vitrificação foi a técnica que promoveu maior tolerância dos embriões ao congelamento. A recuperação dos embriões através de multiplicação após a criopreservação abre uma perspectiva de conservação de genótipos com alta produção de polissulfetos, de interesse para a indústria farmacêutica

The review of recent advances in fish genetics and biotechnology

Great advances have been, and are being made in our knowledge of the genetics and molecular biology (including genomics, proteomics and structural biology). Global molecular profiling technologies such as microassays using DNA or oligonucleotide chip, and protein and lipid chips are being developed. The application of such biotechnological advances are inevitable in aquaculture in the areas of improvement of aquaculture stocks where many molecular markers such as RFLPs, AFLDs and RAPD are now available for genome analysis, finger printing and genetic linkage mapping. Transgenic technology has been developed in a number of fish species and research is being pursed to produce transgenic fish carrying genes that encode antimicrobial peptides such as lysozyme thereby achieving disease resistance in fish. Also it is a short cut to achieving genetic change for fast growth and other desirable traits like early sexual maturity, temperature tolerance and feed conversion efficiency. KEYWORDS: Fish genetics, transgenesis, monoploidy, diploidy, polyploidy,gynogenesis, androgenesis, cryopreservation.

Comparação interlaboratorial entre metodologias e estabilidade da amostra na dosagem do perfil lipídico e PCR-US

Segundo O`Kane et al, em 2008, foi demonstrado que 88,9% dos erros laboratoriais são realizados na fase pré-analítica. No laboratório de análises clínicas, o sistema de controle da qualidade pode ser definido como toda a ação sistemática necessária para dar confiança e segurança em todos os exames e prevenir a ocorrência de erros. O tempo de armazenamento pode variar de dias a meses ou mesmo anos, influenciando na definição da temperatura de estocagem. O armazenamento de longo prazo pode resultar na criopreservação inadequada para determinados analitos e pode desnaturar as lipoproteínas. Objetivos: Este trabalho teve como objetivo avaliar a fase pré-analítica, controle da qualidade interno e também avaliar o efeito do congelamento (- 80C) quanto ao tempo de armazenamento do soro e plasma de sangue colhido com ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). As dosagens foram realizadas no Laboratório de Lípides LabLip, e estocadas em - 80 C por três anos, as mesmas foram redosadas no Serviço de Patologia Clínica da Policlínica Piquet Carneiro da UERJ com metodologias iguais e realizada a comparabilidade dos resultados. Foram analisados o perfil lipídico (CT, HDLc e TG) e PCR-US de 103 amostras, 73 no soro e 30 no plasma em dois laboratórios altamente qualificados. Discussão: Após redosagem foram encontrados nas dosagens de HDLc e CT resultados diminuídos respectivamente (correlação coeficiente no soro 0,48 e 0,62) teste t pareado no soro (CT p 0,0012 e HDLc p 0,0001). Conclusões: Os dados obtidos nas avaliações dos resultados de diferentes laboratórios e tempo de estocagem revelaram que as amostras quando armazenadas por um longo período após redosagem no soro, apresentaram diferenças em certos analitos, tais como CT e HDLc, no qual obteve-se resultados significativamente diminuídos, diferentemente no plasma, que após três anos de estocagem a -80C foram redosados e aplicados no teste t pareado, os analitos CT e PCR-US mantiveram a estabilidade.

玉米原生质体培养、超低温保存和组织培养的研究

本文叙述了两个玉米基因型（小八趟×水白和白17）原生质体培养的植株再生;用基因型（小八趟×水白）为材料研究影响玉米原生质体培养的各种因素，并此基因型的原生质体经超低温保存后获得植株再生;以及用多种基因型玉米幼胚为材料诱导愈伤组织与植株再生。 影响玉米原生质体游离、分裂与植株再生的因素是多方面的。酶液组合0.2% Onozuka RS + 1% Hemicellulase + 0.1% Pectolyase，利用继代8-16天的愈伤组织，所获原生质体的数量与质量最佳。在原生质体植板率方面，结果表明：N6作为基本培养基是理想的;氮源中，NO3-具有明显的促进作用，而NH4+具有明显的抑制作用;有机氮源是不能缺少的，所使用的四种有机氮源中L-脯氨酸效果最明显。2,4-D浓度以1.0 mg/l最佳。原生质体培养后的渗透压浓度降低的时间以培养四星期后为宜。利用三步诱导，成功地获得胚胎发生的植株再生，并且还指出原生质体起始材料的保存年限大大影响原生质体所再生愈伤组织的分化。 采用上述筛选出的最佳游离、培养以及植株再生的方法，成功地培养了基因型（白17）的原生质体，并获得植株再生。原生质体再生细胞培养4-5天后开始一次分裂;培养15天后，植板率为3-4%。一个月后，原生质体所再生的肉眼可见的愈伤组织，分步转至分化培养基。最后，愈伤组织通过胚胎发生获得植株再生，频率约10%。 玉米原生质体，利用5%DMSO与0.55 M葡萄糖作为混合保护剂，经慢速（1 ℃/分钟）降至－40 ℃，停留二小时后直接投入液氮保存。保存3天后，原生质体在40 ℃的温水浴中快速化冻，成活率高达30-40%。成活原生质体培养后生长正常，植板率高达8-10%。培养5-6星期后，再生愈伤组织转至分化培养基;最后获得植株再生，频率为5-10%。 本文最后叙述了玉米七种基因型的幼胚诱导获得愈伤组织，再生植株频率可达70-80%。 上述各方面的研究结果，对玉米的遗传操作和细胞抗寒性研究、生理代谢的研究等都是十分有价值的。

Reproductive engineering in crustacean aquaculture

Crustacean aquaculture industry in India suffers greatly from lack of technological developments. A major constraint in this enterprise is the limitation of seed stock availability. A critical appraisal is made of the techniques used in the manipulation of reproductive processes in order to augment year-round production of seeds. A new possibility of induced ovarian maturation in crustaceans is by administering steroid hormones of vertebrate source. Environmental factors are known to govern the gametogenic cycle of marine crustaceans. Cryopreservation of male gametes and artificial insemination by way of spermatophore transfer could solve some of the problems of mating under laboratory conditions.

苦苣苔科植物的组织培养和离体保存

苦苣苔科(Gesneriaceae)植物种类繁多, 全世界约150属3700余种,我国有58属470余种，大部分具有极高的观赏价值，许多是传统的民间草药。虽然我国苦苣苔科植物资源丰富，然而很多种类分布区域狭窄，种群数量稀少，加之生境受到破坏，许多已经面临灭绝的危险。本研究拟通过组织培养、玻璃化超低温保存以及快速繁殖，达到保护和扩繁珍稀濒危苦苣苔科植物的目的。 以药用唇柱苣苔（Chirita medica D. Fang ex W. T. Wang）和粉绿异裂苣苔（Pseudochirita guangxiensis W.T.Wang var. glauca Y. G. Wei et Y. Liu）为材料，取幼嫩叶片为外植体，通过组织培养实验得到最佳诱导不定芽培养基：MS培养基附加30 g l-1蔗糖，7.5 g l-1琼脂，药用唇柱苣苔附加0.10 mg l-1 BA ，0.10 mg l-1 NAA，粉绿异裂苣苔附加0.05 mg l-1IAA，1.00 mg l-1BA。最高不定芽诱导率分别为：90.3%和85.0%。最佳生根培养基：1/2MS培养基附加30 g l-1蔗糖，5 g l-1活性炭，7 g l-1琼脂，生根率为100%，诱导产生6.11条根，根长为18.8mm（药用唇柱苣苔）；1/2MS培养基附加10-20g l-1蔗糖，1 g l-1活性炭，7 g l-1琼脂，诱导生成6.8-7.4条根，均长17.7-22.0mm（粉绿异裂苣苔）。 在组织培养的基础上进行了苦苣苔科植物的玻璃化超低温冷冻保存研究。以烟叶唇柱苣苔（C. heterotricha Merr.）和濒危植物药用唇柱苣苔叶片外植体为材料，经过自然干燥、装载液处理、玻璃化溶液处理、液氮冷冻保存，成功实现了玻璃化超低温冷冻保存，经过液氮冷冻保存后的材料可以继续分化、生长。适当时间的玻璃化试剂处理对于材料无致死作用，不经液氮冷冻，可以达到100%存活。-20 oC 、-40 oC、液氮保存后，存活率随温度下降而下降，表明冷冻致死的原因在于冰晶形成；提高冷冻后成活率的关键是控制干燥脱水，经过适当的自然干燥，材料存活率分别达到50.0%和27.8%。 以叶片为外植体材料，通过组织培养和快速繁殖可以大规模扩繁苦苣苔科植物。主要步骤为：外植体叶片消毒→不定芽诱导培养→生根诱导培养→继代保存或炼苗移栽，经过3-4个月时间可获得大量栽培植株。已成功保存并培养了40余种苦苣苔科植物，包括濒危苦苣苔及高观赏价值苦苣苔。

哺乳动物胚胎冷冻技术的研究进展

胚胎冷冻保存已广泛用于胚胎移植、动物克隆以及动物资源保护。此技术的应用需保证胚胎在冷冻—解冻后具有较高的成活率。自从1972年小鼠胚胎冷冻保存获得成功以来,许多学者在简化冷冻程序、缩短冷冻时间等方面进行了深入的研究。文章就胚胎冷冻的原理、保护剂、冷冻方法以及解冻方法等方面进行了综述。

不同渗透压的稀释液对猕猴精子低温冷冻保存的影响

以稀释液TTE (382 mOsm/ kg) 为对照, 研究了5 种渗透压(688 、389 、329 、166 、43 mOsm/ kg) 的TEST 稀释液(TEST、mTEST1、mTEST2、mTEST3、mTEST4) 在冷冻过程中对猕猴精子功能的影响。精液一 步稀释于含甘油的防冻液中, 甘油的终浓度为5 % (v/ v) 。在冷冻前后分别检测精子的运动度和质膜完整性, 后者用Hoechst 33342 和碘化丙锭双色标记流式细胞术分析。结果表明: 冷冻之前, 与鲜精相比, 用TEST 和 mTEST4 稀释的精子运动度和质膜完整性显著降低( P < 01001) , 其余组中除mTEST2 稀释的精子质膜完整性显 著降低( P < 0105) 外, 精子运动度无差异; 冷冻复苏后, TTE、mTEST3 和mTEST1 冻存精子的运动度和质膜 完整性最高, 其次是mTEST2 , TEST和mTEST4 冷冻效果最差( P < 0105) 。提示等渗、适当高渗或低渗的稀释 液适合猕猴精子的冷冻保存; 对精子产生高渗毒害作用是导致猕猴精子用TEST 冷冻存活率低的主要原因。

四种渗透性防冻剂在猕猴精子低温冷冻保存中对精子功能状态的影响

以冷冻精子的复苏运动度、荧光染料Hoechst 33258 检测的细胞膜完整率、异硫氰酸荧光素标记的 花生凝集素(FITC2PNA) 检测的顶体完整率作为精子功能状态的指标, 对甘油、二甲亚砜、乙二醇和丙二醇4 种常用渗透性防冻剂在猕猴精子冷冻保存过程中的作用进行了比较。结果表明: 冷冻保存精子的复苏运动度, 甘油(4713 ±517 %) 和乙二醇(4418 ±617 %) > 二甲亚砜(2219 ±019 %) > 丙二醇(0 ±0 %) ; 细胞膜完整 率, 甘油(5418 ±312 %) 和乙二醇(5410 ±617 %) > 二甲亚砜(3715 ±710 %) > 丙二醇(2813 ±615 %) ; 顶 体完整率, 甘油(8212 ±214 %) 和乙二醇(8214 ±214 %) > 二甲亚砜(6817 ±517 %) 和丙二醇(7213 ± 315 %) ( P < 0105) 。结果提示: 二甲亚砜和丙二醇, 尤其是丙二醇并不适合猕猴精子的冷冻保存; 而乙二醇具 有和甘油相似的保护作用, 是一种极具潜力的猕猴精子冷冻保存的渗透性防冻剂。

Vitrification of Yunnan Yellow Cattle oocytes: work in progress

The objective of this study was to provide a simple cryopreservation method for oocytes from Yunnan Yellow Cattle and facilitate preservation efforts in this native Chinese breed, which is threatened by agricultural modernization. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected from slaughterhouse ovaries and matured in vitro for 22-24 h, then selected for cryopreservation. Vitrification in open pulled straws (OPS) or in microdrops on a cooled metal surface (solid surface vitrification, SSV) was compared. The OPS vitrification solution consisted of 20% ethylene glycol (EG) and 20% DMSO. The SSV solution was a mixture of 35% EG, 5% polyvinyl-pyrrolidon (PVP) and 0.4 M trehalose. Vitrified and warmed oocytes were either fertilized in vitro or parthenogenetically activated. The rates of cleavage and development to blastocysts of fertilized oocytes following OPS versus SSV were not statistically different (38.3 and 12.5% versus 35.8 and 6.0%, respectively). The corresponding rates of parthenogenetic development to blastocysts were also not different (8.2 versus 3.5%, respectively). Development to blastocysts of non-vitrified controls following fertilization was significantly higher than that of the vitrified oocytes (22.6%, P < 0.05). These results demonstrate for the first time, that although both OPS and SSV procedures reduced embryonic development, Yunnan Yellow Cattle oocytes are capable of developing to blastocysts following cryopreservation. (C) 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved.

Effect of sugar type on the survival of frozen-thawed rhesus monkey (Macaca mulatta) sperm

Sperm-freezing extenders supplemented with sugar or a combination of different sugars are widely used for the cryopreservation of nonhuman primate spermatozoa. Understanding which sugar or combination of sugars offers the highest level of cryoprotection w

兔胚胎干细胞冷冻保存的研究

胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES 细胞)起源于着床前胚胎内的细胞群，对 鼠ES 细胞研究已经有20 多年，但直到1998 年才首次报道从人的胚胎中获得ES 细胞，2006 年本实验室从兔体外受精胚胎的内细胞团分离建立了兔胚胎干细胞 系RF。ES 细胞是能在体外长期培养，高度未分化的全能细胞系，可在适合的条 件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。根据这一特性，它们可用于再生 细胞或组织移植。胚胎干细胞的成功冻存是其应用于临床的前提。成功的冻存是 在冷冻、解冻和复苏培养过程中，细胞具有较高的存活率，且仍能保持胚胎干细 胞的自我更新和全能性的特性。目前除了小鼠ES 细胞用常规慢速冷冻方法可以 达到95%以上的未分化集落复苏率外(Yao & Yuan, 2005)，其它物种尤其是灵长 类的许多ES 细胞系用常规慢速冷冻方法的复苏率极低，极大地限制了这些细胞 的临床应用。为提高兔胚胎干细胞RF 在慢速冷冻中的保存效果, 本研究比较了 二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇（ethylene glycol，EG）对兔胚胎干细胞冷冻保护效 果。对冷冻复苏后的细胞进行台盼蓝染色，并研究其胚胎干细胞的分子特性，结 果表明， DMSO 比EG 具有更好的冷冻保护效果。再在以10% DMSO 为基础的 防冻液中添加膜稳定剂海藻糖或谷氨酰胺，细胞冷冻复苏后结果显示, 谷氨酰胺 对兔胚胎干细胞有明显的冷冻保护作用，使细胞存活率从71%提高到83.7%。当 谷氨酰胺浓度为0、5、10、20、40mmol/L 分别加入防冻液中后，20mmol/L 的 谷氨酰胺具有最佳的冷冻保护效果。以上结果得出兔胚胎干细胞慢速冷冻的防冻 液改进配方为：胚胎干细胞培养液中添加10% DMSO+20 mmol/L 谷氨酰胺.