UHPLC-epäpuhtausmenetelmän kehittäminen ja validointi inhalaatiovalmisteelle

Tämän diplomityön tarkoituksena on kehittää menetelmä, jolla voidaan seurata inhalaatiovalmisteen sisältämiä epäpuhtauksia. Menetelmä kehitetään erittäin korkean suorituskyvyn kromatografialaitteistolle (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) jo olemassa olevan HPLC-epäpuhtausmenetelmän pohjalta. Uusi menetelmä kehitetään analyysiajan lyhentämiseksi ja erotuksen resoluution parantamiseksi. Työn kirjallisuusosa esittelee lyhyesti inhalaatiovalmisteet sekä nestekromatografian perusteet. Korkean erotuskyvyn nestekromatografia ja analysoinnin apuna käytettävät parametrit selvitetään laskukaavoineen. Kirjallisuusosa keskittyy epäpuhtausmenetelmän kehittämisen kulkuun ja menetelmän validoinnissa suoritettaviin kokeisiin. Soveltavassa osassa Orion Oyj:n kehitteillä olevalle kahden vaikuttavan aineen inhalaatiovalmisteelle kehitetään UHPLC-epäpuhtausmenetelmä kirjallisuusosiossa esitellyn menetelmäkehitysrungon pohjalta. Menetelmäkehityksen kulku ja analyysin olosuhteiden valinta esitellään pääpiirteittäin, jonka jälkeen kehitetty menetelmä validoidaan sille tehdyn validointisuunnitelman mukaisesti. Kehitetystä UHPLC-epäpuhtausmenetelmästä saatiin 16 minuuttia lyhyempi kuin vastaava HPLC-epäpuhtausmenetelmä. Myös analyysin resoluutio parantui merkittävästi. Toistuvien injektioiden jälkeen kromatogrammissa esiintyi kuitenkin häntimistä, joka johti merkittävään resoluution heikkenemiseen. Häntimisen syyksi epäiltiin toisen vaikuttavan aineen kiinnittymistä kolonnimateriaaliin, mutta sen estämiseksi ehdotetut toimenpiteet eivät sopineet kehitettyyn menetelmään.

Prevention of type 2 diabetes with lifestyle intervention - emphasis on dietary composition and identification of high-risk individuals

Type 2 diabetes is an increasing, serious, and costly public health problem. The increase in the prevalence of the disease can mainly be attributed to changing lifestyles leading to physical inactivity, overweight, and obesity. These lifestyle-related risk factors offer also a possibility for preventive interventions. Until recently, proper evidence regarding the prevention of type 2 diabetes has been virtually missing. To be cost-effective, intensive interventions to prevent type 2 diabetes should be directed to people at an increased risk of the disease. The aim of this series of studies was to investigate whether type 2 diabetes can be prevented by lifestyle intervention in high-risk individuals, and to develop a practical method to identify individuals who are at high risk of type 2 diabetes and would benefit from such an intervention. To study the effect of lifestyle intervention on diabetes risk, we recruited 522 volunteer, middle-aged (aged 40 - 64 at baseline), overweight (body mass index > 25 kg/m2) men (n = 172) and women (n = 350) with impaired glucose tolerance to the Diabetes Prevention Study (DPS). The participants were randomly allocated either to the intensive lifestyle intervention group or the control group. The control group received general dietary and exercise advice at baseline, and had annual physician's examination. The participants in the intervention group received, in addition, individualised dietary counselling by a nutritionist. They were also offered circuit-type resistance training sessions and were advised to increase overall physical activity. The intervention goals were to reduce body weight (5% or more reduction from baseline weight), limit dietary fat (< 30% of total energy consumed) and saturated fat (< 10% of total energy consumed), and to increase dietary fibre intake (15 g / 1000 kcal or more) and physical activity (≥ 30 minutes/day). Diabetes status was assessed annually by a repeated 75 g oral glucose tolerance testing. First analysis on end-points was completed after a mean follow-up of 3.2 years, and the intervention phase was terminated after a mean duration of 3.9 years. After that, the study participants continued to visit the study clinics for the annual examinations, for a mean of 3 years. The intervention group showed significantly greater improvement in each intervention goal. After 1 and 3 years, mean weight reductions were 4.5 and 3.5 kg in the intervention group and 1.0 kg and 0.9 kg in the control group. Cardiovascular risk factors improved more in the intervention group. After a mean follow-up of 3.2 years, the risk of diabetes was reduced by 58% in the intervention group compared with the control group. The reduction in the incidence of diabetes was directly associated with achieved lifestyle goals. Furthermore, those who consumed moderate-fat, high-fibre diet achieved the largest weight reduction and, even after adjustment for weight reduction, the lowest diabetes risk during the intervention period. After discontinuation of the counselling, the differences in lifestyle variables between the groups still remained favourable for the intervention group. During the post-intervention follow-up period of 3 years, the risk of diabetes was still 36% lower among the former intervention group participants, compared with the former control group participants. To develop a simple screening tool to identify individuals who are at high risk of type 2 diabetes, follow-up data of two population-based cohorts of 35-64 year old men and women was used. The National FINRISK Study 1987 cohort (model development data) included 4435 subjects, with 182 new drug-treated cases of diabetes identified during ten years, and the FINRISK Study 1992 cohort (model validation data) included 4615 subjects, with 67 new cases of drug-treated diabetes during five years, ascertained using the Social Insurance Institution's Drug register. Baseline age, body mass index, waist circumference, history of antihypertensive drug treatment and high blood glucose, physical activity and daily consumption of fruits, berries or vegetables were selected into the risk score as categorical variables. In the 1987 cohort the optimal cut-off point of the risk score identified 78% of those who got diabetes during the follow-up (= sensitivity of the test) and 77% of those who remained free of diabetes (= specificity of the test). In the 1992 cohort the risk score performed equally well. The final Finnish Diabetes Risk Score (FINDRISC) form includes, in addition to the predictors of the model, a question about family history of diabetes and the age category of over 64 years. When applied to the DPS population, the baseline FINDRISC value was associated with diabetes risk among the control group participants only, indicating that the intensive lifestyle intervention given to the intervention group participants abolished the diabetes risk associated with baseline risk factors. In conclusion, the intensive lifestyle intervention produced long-term beneficial changes in diet, physical activity, body weight, and cardiovascular risk factors, and reduced diabetes risk. Furthermore, the effects of the intervention were sustained after the intervention was discontinued. The FINDRISC proved to be a simple, fast, inexpensive, non-invasive, and reliable tool to identify individuals at high risk of type 2 diabetes. The use of FINDRISC to identify high-risk subjects, followed by lifestyle intervention, provides a feasible scheme in preventing type 2 diabetes, which could be implemented in the primary health care system.

Die mündliche Sprachkompetenz finnischer Deutschlernender aus Sicht der grammatikalischen Korrektheit : Eine Fehleranalyse im Rahmen des HY-TALK-Projekts

Tutkielman päätavoitteena on analysoida suomalaisten, saksaa opiskelevien lukiolaisten suullisen testin suorituksia kielen oikeellisuuden näkökulmasta virheanalyysin avulla. Aineistona on osa Helsingin yliopiston HY-TALK-hankkeen saksan kielen tutkimusaineistosta: videoinnit suullisen kielitaidon testeistä sekä asiantuntijaraadin arvioinnit suorituksista. Koska aineisto on suullinen, tutkielmassa tarkastellaan aluksi suullisen kielen piirteitä. Virheanalyysin pohjana ovat muun muassa Corderin, Nickelin, Kleppinin ja Jamesin esittämät teoriat. Tutkielmassa analysoidaan kolmentoista, selkeästi joko A1.3- tai A2.2-taitotasolle arvioidun opiskelijan suoritukset. Virheanalyysin tavoitteena on saada selville kielioppivirheiden määrät, kullekin taitotasolle tyypilliset kielioppivirheet sekä selvittää tasojen välisiä eroja. Virheanalyysissä ei huomioida leksikaalisia eikä ääntämisvirheitä, vaan keskitytään morfologisiin ja syntaktisiin virheisiin. Virheet jaotellaan eri virheluokkiin (nominaalilausekkeiden deklinaatio, pronomini, taipumattomat sanaluokat, kysymyssanat, kieltoilmaukset, verbit ja lauserakenne) ja ne tilastoidaan taulukoihin. Lisäksi pohditaan virheiden syitä sekä virheiden vaikutusta kielen ymmärrettävyyteen. Jälkimmäistä selvitetään saksaa äidinkielenään puhuvan, kolmihenkisen raadin avulla. Raadin sekä numeeriset että verbaaliset arvioinnit ovat myös osa tutkielman aineistoa. Toinen tutkielman päätavoite on opetussuunnitelman taitotasoasteikon validointi. Tarkoituksena on selvittää oikeellisuuden taitotasokuvausten toimivuutta arvioinnissa A1.3- ja A2.2-tasojen osalta. Tätä tavoitetta varten selvitetään myös kielitaidon arvioinnin taustalla olevia teorioita. HY-TALK-asiantuntijaraadin arviointeja verrataan virheanalyysin tuloksiin korrelaatiokertoimen ja regressiosuoran avulla. Virheanalyysin perusteella voidaan todeta, että molemmilla tasoilla olevat opiskelijat tekevät eniten virheitä nominaalilausekkeiden deklinaatiossa (A2.2-tasolla 60,0 prosenttia kaikista virheistä ja A1.3-tasolla 42,2 prosenttia). A1.3-tasolle arvioidut opiskelijat tekevät paljon virheitä myös verbeissä ja lauserakenteissa, kun taas A2.2-tason opiskelijat hallitsevat nämä rakenteet paremmin. A1.3-tasolle arvioidut opiskelijat tekevät enemmän virheitä (22,10 virhettä sataa sanaa kohden) kuin A2.2-tasolle arvioidut (9,80 virhettä sataa sanaa kohden). Virheiden syitä ovat muun muassa testitilanne, puhekumppanin vaikutus ja interferenssi. Kielen ymmärrettävyyteen vaikuttavat saksalaisen raadin mukaan kielioppivirheiden lisäksi muun muassa puheen sujuvuus ja leksikaaliset ongelmat. Vakavimpina virheinä pidetään virheitä lauserakenteessa, sillä ne haittaavat usein ymmärrettävyyttä. Deklinaatiovirheitä puolestaan ei yleensä pidetä vakavina virheinä. Taitotasokuvaukset toimivat A1.3- ja A2.2-tasojen osalta hyvin, sillä virheanalyysin virhemäärät ja HY-TALK-raadin arvioinnit korreloivat keskenään, kun otetaan huomioon molemmat tasot A1.3 ja A2.2. Kielioppivirheiden määrä siis vaikuttaa kielen oikeellisuuden arviointiin. Taitotasokuvauksia olisi kuitenkin joiltain osin syytä tarkentaa ja yhtenäistää esimerkiksi konkreettisten esimerkkien avulla (esim. mikä on peruskielioppivirhe?) ja kuvaamalla myös kielen ymmärrettävyyttä joka tasolla.

The challenge of LC/MS/MS multi-mycotoxin analysis - Heracles battling the Hydra?

Mycotoxins are secondary metabolites of filamentous fungi. They pose a health risk to humans and animals due to their harmful biological properties and common occurrence in food and feed. Liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) has gained popularity in the trace analysis of food contaminants. In this study, the applicability of the technique was evaluated in multi-residue methods of mycotoxins aiming at simultaneous detection of chemically diverse compounds. Methods were developed for rapid determination of toxins produced by fungal genera of Aspergillus, Fusarium, Penicillium and Claviceps from cheese, cereal based agar matrices and grains. Analytes were extracted from these matrices with organic solvents. Minimal sample clean-up was carried out before the analysis of the mycotoxins with reversed phase LC coupled to tandem MS (MS/MS). The methods were validated and applied for investigating mycotoxins in cheese and ergot alkaloid occurrence in Finnish grains. Additionally, the toxin production of two Fusarium species predominant in northern Europe was studied. Nine mycotoxins could be determined from cheese with the method developed. The limits of quantification (LOQ) allowed the quantification at concentrations varying from 0.6 to 5.0 µg/kg. The recoveries ranged between 96 and 143 %, and the within-day repeatability (as relative standard deviation, RSDr) between 2.3 and 12.1 %. Roquefortine C and mycophenolic acid could be detected at levels of 300 up to 12000 µg/kg in the mould cheese samples analysed. A total of 29 or 31 toxins could be analysed with the method developed for agar matrices and grains, with the LOQs ranging overall from 0.1 to 1250 µg/kg. The recoveries ranged generally between 44 and 139 %, and the RSDr between 2.0 and 38 %. Type-A trichothecenes and beauvericin were determined from the cereal based agar and grain cultures of F. sporotrichioides and F. langsethiae. T-2 toxin was the main metabolite, the average levels reaching 22000 µg/kg in the grain cultures after 28 days of incubation. The method developed for ten ergot alkaloids from grains allowed their quantification at levels varying from 0.01 to 10 µg/kg. The recoveries ranged from 51 to 139 %, and the RSDr from 0.6 to 13.9 %. Ergot alkaloids were measured in barley and rye at average levels of 59 and 720 µg/kg, respectively. The two most prevalent alkaloids were ergocornine and ergocristine. The LC/MS methods developed enabled rapid detection of mycotoxins in such applications where several toxins co-occurred. Generally, the performance of the methods was good, allowing reliable analysis of the mycotoxins of interest with sufficiently low quantification limits. However, the variation in validation results highlighted the challenges related to optimising this type of multi-residue methods. New data was obtained about the occurrence of mycotoxins in mould cheeses and of ergot alkaloids in Finnish grains. In addition, the study revealed the high mycotoxin-producing potential of two common fungi in Finnish crops. The information can be useful when risks related to fungal and mycotoxin contamination will be assessed.

Kirjallisuusosa: Alzheimerin taudin rottamallien vastaavuus tautiin ihmisessä ja mallien käyttökelpoisuus

Kirjallisuusosa: Alzheimerin taudin hoitoon olisi tarvetta uusille taudinkulkuun vaikuttaville lääkeaineille. Niiden kehittämiseksi tarvitaan eläinmalleja, joissa esiintyy taudin patofysiologisia piirteitä. Rottamalleista vanhemmat skopolamiini- tai MK-801-häirintä sekä ikääntyneiden rottien käyttö eivät kovin hyvin vastaa taudin patofysiologiaa, vaikka niissä eläimen muisti käyttäytymiskokeissa onkin heikentynyt. Uudemmat transgeeniset rottamallit ja mallit, joissa annetaan Aβ:a aivoihin, ilmentävät huomattavasti paremmin Alzheimerin taudin kaltaista tilaa aivoissa ainakin Aβ:n osalta. Taupatofysiologiaa ei silti kummassakaan näistä malleista juuri esiinny. Toisaalta Aβ:lla näyttäisi olevan huomattavasti tau:ta suurempi rooli taudissa, joten sen ilmeneminen mallissa onkin keskeisempi tekijä. Nämä mallit ilmentävät melko suurelti osin yhtä hyvin Alzheimerin taudin patofysiologiaa. Aβ:n antaminen on hieman yksinkertaisempi suorittaa käytännössä, sillä siinä ei tarvitse luoda transgeenista kantaa. Toisaalta transgeenisessa mallissa Aβ-patofysiologia syntyy enemmän Alzheimerin taudin kaltaisesti solujen sisällä eikä valmiita aggregoituvia Aβ-peptidejä anneta ulkopuolelta aivoihin. Molemmat mallit ovat kuitenkin käyttökelpoisia, ja soveltuvat erityisesti Aβ:an vaikuttavien lääkeaineiden kehittämiseen. Kokeellinen osa: Kokeen tarkoituksena oli validoida kohotettu ristikko-sokkelo (elevated plus-maze, EPM) hiirillä kognitiomallina. Kokeessa käytettiin kahden koekerran (trial, T) menetelmää, jossa koekertojen pituus oli viisi minuuttia. Näin saatiin useita oppimista kuvaavia parametreja. Hiirille yritettiin saada muistihäiriö aikaviiveen avulla (koekertojen väli 1-18 vrk) tai antamalla muskariinireseptoriantagonistia skopolamiinia (0,1-0,8 mg/kg i.p.) 30 minuuttia ennen T1:tä. Nämä kokeet suoritettiin sekä C57BL/6J- että ICR:(CD-1)-hiirillä. Aikaviivekokeissa ainut ryhmä, jolla oli viitettä unohtamisesta, oli ICR:(CD-1)-hiirien 18 vrk:n ryhmä. Tämän perusteella tutkittiin vielä 21 vuorokauden aikaväli, mutta selvää muistihäiriötä ei esiintynyt. Skopolamiini ei häirinnyt muistia ICR:(CD-1)-hiirillä, mutta C57BL/6J-hiirillä 0,2 mg/kg:n annoksesta ylöspäin merkitsevä muistihäiriö esiintyi. Näin ollen jatkokokeissa käytettäväksi valittiin skopolamiinin annos 0,2 mg/kg C57BL/6J-hiirillä, ja siinä tutkittiin donepetsiilin (0,3, 0,8 ja 1,5 mg/kg s.c), memantiinin (5,0 ja 10,0 mg/kg s.c) ja kokeellisen 5-HT6-antagonistin SB742457:n (1,5 ja 6,0 mg/kg s.c) muistia parantavia vaikutuksia. Tutkittavat lääkeaineet annettiin 40 minuuttia ennen T1:tä ja skopolamiini 30 minuuttia ennen. Memantiinilla (5,0 mg/kg) oli selkeä skopolamiinin heikentämää kognitiota parantava vaikutus ja donepetsiilillakin (1,5 mg/kg) suuntaus tähän. Tulosten perusteella malli näyttäisi soveltuvan muisti- ja oppimisvaikutusten tutkimiseen käytettäväksi malliksi.

Adaptive MCMC methods with applications in environmental and geophysical models

This work presents new, efficient Markov chain Monte Carlo (MCMC) simulation methods for statistical analysis in various modelling applications. When using MCMC methods, the model is simulated repeatedly to explore the probability distribution describing the uncertainties in model parameters and predictions. In adaptive MCMC methods based on the Metropolis-Hastings algorithm, the proposal distribution needed by the algorithm learns from the target distribution as the simulation proceeds. Adaptive MCMC methods have been subject of intensive research lately, as they open a way for essentially easier use of the methodology. The lack of user-friendly computer programs has been a main obstacle for wider acceptance of the methods. This work provides two new adaptive MCMC methods: DRAM and AARJ. The DRAM method has been built especially to work in high dimensional and non-linear problems. The AARJ method is an extension to DRAM for model selection problems, where the mathematical formulation of the model is uncertain and we want simultaneously to fit several different models to the same observations. The methods were developed while keeping in mind the needs of modelling applications typical in environmental sciences. The development work has been pursued while working with several application projects. The applications presented in this work are: a winter time oxygen concentration model for Lake Tuusulanjärvi and adaptive control of the aerator; a nutrition model for Lake Pyhäjärvi and lake management planning; validation of the algorithms of the GOMOS ozone remote sensing instrument on board the Envisat satellite of European Space Agency and the study of the effects of aerosol model selection on the GOMOS algorithm.