¿Es el gen humano hPL-1 un pseudogen? análisis de su expresión in vivo usando técnicas de ingeniería genética y cultivo celular por Ramiro Ramírez Solís

Tesis (Maestría en Ciencias) U.A.N.L.

Estudo e desenvolvimento de algoritmos criptográficos para redes de sensores sem fio, utilizando técnicas de programação genética

Cryptography is the main form to obtain security in any network. Even in networks with great energy consumption restrictions, processing and memory limitations, as the Wireless Sensors Networks (WSN), this is no different. Aiming to improve the cryptography performance, security and the lifetime of these networks, we propose a new cryptographic algorithm developed through the Genetic Programming (GP) techniques. For the development of the cryptographic algorithm’s fitness criteria, established by the genetic GP, nine new cryptographic algorithms were tested: AES, Blowfish, DES, RC6, Skipjack, Twofish, T-DES, XTEA and XXTEA. Starting from these tests, fitness functions was build taking into account the execution time, occupied memory space, maximum deviation, irregular deviation and correlation coefficient. After obtaining the genetic GP, the CRYSEED and CRYSEED2 was created, algorithms for the 8-bits devices, optimized for WSNs, i.e., with low complexity, few memory consumption and good security for sensing and instrumentation applications.

Estudo e desenvolvimento de algoritmos criptográficos para redes de sensores sem fio, utilizando técnicas de programação genética

Cryptography is the main form to obtain security in any network. Even in networks with great energy consumption restrictions, processing and memory limitations, as the Wireless Sensors Networks (WSN), this is no different. Aiming to improve the cryptography performance, security and the lifetime of these networks, we propose a new cryptographic algorithm developed through the Genetic Programming (GP) techniques. For the development of the cryptographic algorithm’s fitness criteria, established by the genetic GP, nine new cryptographic algorithms were tested: AES, Blowfish, DES, RC6, Skipjack, Twofish, T-DES, XTEA and XXTEA. Starting from these tests, fitness functions was build taking into account the execution time, occupied memory space, maximum deviation, irregular deviation and correlation coefficient. After obtaining the genetic GP, the CRYSEED and CRYSEED2 was created, algorithms for the 8-bits devices, optimized for WSNs, i.e., with low complexity, few memory consumption and good security for sensing and instrumentation applications.

Aggravation of chronic stress effects on hippocampal neurogenesis and spatial memory in LPA₁ receptor knockout mice.

BACKGROUND The lysophosphatidic acid LPA₁ receptor regulates plasticity and neurogenesis in the adult hippocampus. Here, we studied whether absence of the LPA₁ receptor modulated the detrimental effects of chronic stress on hippocampal neurogenesis and spatial memory. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS Male LPA₁-null (NULL) and wild-type (WT) mice were assigned to control or chronic stress conditions (21 days of restraint, 3 h/day). Immunohistochemistry for bromodeoxyuridine and endogenous markers was performed to examine hippocampal cell proliferation, survival, number and maturation of young neurons, hippocampal structure and apoptosis in the hippocampus. Corticosterone levels were measured in another a separate cohort of mice. Finally, the hole-board test assessed spatial reference and working memory. Under control conditions, NULL mice showed reduced cell proliferation, a defective population of young neurons, reduced hippocampal volume and moderate spatial memory deficits. However, the primary result is that chronic stress impaired hippocampal neurogenesis in NULLs more severely than in WT mice in terms of cell proliferation; apoptosis; the number and maturation of young neurons; and both the volume and neuronal density in the granular zone. Only stressed NULLs presented hypocortisolemia. Moreover, a dramatic deficit in spatial reference memory consolidation was observed in chronically stressed NULL mice, which was in contrast to the minor effect observed in stressed WT mice. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE These results reveal that the absence of the LPA₁ receptor aggravates the chronic stress-induced impairment to hippocampal neurogenesis and its dependent functions. Thus, modulation of the LPA₁ receptor pathway may be of interest with respect to the treatment of stress-induced hippocampal pathology.

A engenharia genética

São abordados os progressos havidos com as técnicas de engenharia genética, capazes de alterar o potencial genético de um organismo, quer pela introdução, quer pela supressão de novos genes estruturais. São mencionadas algumas das aplicações em geral e, em particular, possibilidades de uso no campo da medicina. É feita uma análise crítica dos benefícios e riscos envolvidos.

Variabilidade genética de procedências e progênies de umbuzeiro via metodologia de modelos lineares mistos (REML/BLUP)

O umbuzeiro (Spondias tuberosa Arruda), espécie nativa do semi-árido brasileiro, é um dos recursos genéticos mais importantes para a produção de frutos destinados ao consumo in natura e à industrialização. No melhoramento de espécies perenes, o uso de técnicas de avaliação genética com base em modelos mistos do tipo REML/BLUP (máxima verossimilhança restrita /melhor predição linear não viciada) é fundamental para a predição de valores genéticos aditivos e genotípicos de indivíduos com potencial para seleção, tanto em nível intrapopulacional como interpopulacional. Este procedimento vem sendo aplicado com sucesso no Brasil, no melhoramento de várias espécies frutíferas e florestais. O presente trabalho teve como objetivos estudar a variabilidade genética, estimar parâmetros genéticos e realizar a predição de valores genéticos dos indivíduos, utilizando a metodologia REML/BLUP a partir da avaliação de procedências e progênies de umbuzeiro. O ensaio foi instalado em delineamento de blocos ao acaso, com arranjo hierárquico desbalanceado, constituído de três procedências e 42 progênies. Foram avaliados os caracteres altura de plantas (ALP), maior diâmetro de copa (MAC), menor diâmetro de copa (MEC), diâmetro do colo (DIC) e número de ramos primários (NRP), os quais são correlacionados à produção de frutos. Os resultados obtidos permitem afirmar que, no umbuzeiro, aos nove anos de idade, a maior parte da variabilidade genética encontrada concentra-se dentro de populações. Os caracteres MEC e MAC apresentaram, respectivamente, valores de herdabilidade individual no sentido restrito de 0,08 e 0,14 e ganhos de 6% e 9%, respectivamente, com a seleção dos dez melhores genitores.

Chaperonas moleculares y tolerancia a estrés abiótico en especies arbóreas

Las temperaturas extremas, la sequía y otros estreses abióticos limitan la producción forestal de forma significativa, causando grandes pérdidas económicas en el sector. Los árboles, al ser organismos sésiles, han desarrollado una serie de estrategias para percibir dichos factores, activando respuestas defensivas apropiadas. Entre ellas ocupa un lugar preeminente la síntesis de proteínas con actividad chaperona molecular. Las chaperonas moleculares interaccionan con proteínas desnaturalizadas total o parcialmente, promoviendo su correcto plegamiento y ensamblaje. Las chaperonas moleculares que se sintetizan de forma predominante en plantas, pero no en otros eucariotas, pertenecen a la familia sHSP (small heat-shock proteins). Se trata de una familia inusualmente compleja y heterogénea, cuyos miembros son de pequeño tamaño (16-42 kD) y poseen un dominio “alfa-cristalina” muy conservado. Estas proteínas están implicadas en protección frente a estrés abiótico mediante la estabilización de proteínas y membranas, si bien su mecanismo de acción se conoce de forma incompleta. A pesar del evidente potencial aplicado de las proteínas sHSP, son muy escasos los estudios realizados hasta el momento con un enfoque netamente biotecnológico. Por otra parte, casi todos ellos se han llevado a cabo en especies herbáceas de interés agronómico o en especies modelo, como Arabidopsis thaliana. De ahí que las sHSP de arbóreas hayan sido mucho menos caracterizadas estructural y funcionalmente, y ello a pesar del interés económico y ecológico de los árboles y de su prolongada exposición vital a múltiples factores estresantes. La presente Tesis Doctoral se centra en el estudio de sHSP de varias especies arbóreas de interés económico. El escrutinio exhaustivo de genotecas de cDNA de órganos vegetativos nos ha permitido identificar y caracterizar los componentes mayoritarios de tallo en dos especies productoras de madera noble: nogal y cerezo. También hemos caracterizado la familia completa en chopo, a partir de su secuencia genómica completa. Mediante expresión heteróloga en bacterias, hemos analizado el efecto protector de estas proteínas in vivo frente a distintos tipos de estrés abiótico, relevantes para el sector productivo. Los resultados demuestran que las proteínas sHSP-CI: (i) aumentan la viabilidad celular de E.coli frente a casi todos estos factores, aplicados de forma individual o combinada; (ii) ejercen un rol estabilizador de las membranas celulares frente a condiciones adversas; (iii) sirven para mejorar la producción de otras proteínas recombinantes de interés comercial. El efecto protector de las proteínas sHSP-CI también ha sido analizado in planta, mediante la expresión ectópica de CsHSP17.5-CI en chopos. En condiciones normales de crecimiento no se han observado diferencias fenotípicas entre las líneas transgénicas y los controles, lo que demuestra que se pueden sobre-expresar estas proteínas sin efectos pleiotrópicos deletéreos. En condiciones de estrés térmico, por el contrario, los chopos transgénicos mostraron menos daños y un mejor crecimiento neto. En línea con lo anterior, las actividades biológicas de varias enzimas resultaron más protegidas frente a la inactivación por calor, corroborando la actividad chaperona propuesta para la familia sHSP y su conexión con la tolerancia al estrés abiótico. En lo que respecta a la multiplicación y propagación de chopo in vitro, una forma de cultivo que comporta estrés para las plantas, todas las líneas transgénicas se comportaron mejor que los controles en términos de producción de biomasa (callos) y regeneración de brotes, incluso en ausencia de estrés térmico. También se comportaron mejor durante su cultivo ex vitro. Estos resultados tienen gran potencial aplicado, dada la recalcitrancia de muchas especies vegetales de interés económico a la micropropagación y a la manipulación in vitro en general. Los resultados derivados de esta Tesis, aparte de aportar datos nuevos sobre el efecto protector de las proteínas sHSP citosólicas mayoritarias (clase CI), demuestran por vez primera que la termotolerancia de los árboles puede ser manipulada racionalmente, incrementando los niveles de sHSP mediante técnicas de ingeniería genética. Su interés aplicado es evidente, especialmente en un escenario de calentamiento global. ABSTRACT Abiotic stress produces considerable economic losses in the forest sector, with extreme temperature and drought being amongst the most relevant factors. As sessile organisms, plants have acquired molecular strategies to detect and recognize stressful factors and activate appropriate responses. A wealth of evidence has correlated such responses with the massive induction of proteins belonging to the molecular chaperone family. Molecular chaperones are proteins which interact with incorrectly folded proteins to help them refold to their native state. In contrast to other eukaryotes, the most prominent stress-induced molecular chaperones of plants belong to the sHSP (small Heat Shock Protein) family. sHSPs are a widespread and diverse class of molecular chaperones that range in size from 16 to 42k Da, and whose members have a highly conserved “alpha-crystallin” domain. sHSP proteins play an important role in abiotic stress tolerance, membrane stabilization and developmental processes. Yet, their mechanism of action remains largely unknown. Despite the applied potential of these proteins, only a few studies have addressed so far the biotechnological implications of this protein family. Most studies have focused on herbaceous species of agronomic interest or on model species such as Arabidopsis thaliana. Hence, sHSP are poorly characterized in long-lived woody species, despite their economic and ecological relevance. This Thesis studies sHSPs from several woody species of economic interest. The most prominent components, namely cytosolic class I sHSPs, have been identified and characterized, either by cDNA library screening (walnut, cherry) or by searching the complete genomic sequence (poplar). Through heterologous bacterial expression, we analyzed the in vivo protective effects of selected components against abiotic stress. Our results demonstrate that sHSP-CI proteins: (i) protect E. coli cells against different stressful conditions, alone or combined; (ii) stabilize cell membranes; (iii) improve the production of other recombinant proteins with commercial interest. The effects of CsHSP17.5-CI overexpression have also been studied in hybrid poplar. Interestingly, the accumulation of this protein does not have any appreciable phenotypic effects under normal growth conditions. However, the transgenic poplar lines showed enhanced net growth and reduced injury under heat-stress conditions compared to vector controls. Biochemical analysis of leaf extracts revealed that important enzyme activities were more protected in such lines against heat-induced inactivation than in control lines, lending further support to the chaperone mode of action proposed for the sHSP family. All transgenic lines showed improved in vitro and ex vitro performance (calli biomass, bud induction, shoot regeneration) compared to controls, even in the absence of thermal stress. Besides providing new insights on the protective role of HSP-CI proteins, our results bolster the notion that heat stress tolerance can be readily manipulated in trees through genetic engineering. The applied value of these results is evident, especially under a global warming scenario.

Improvement of in silico strain engineering methods in Saccharomyces cerevisiae

PhD thesis in Bioengineering

Análise de fragmentos arqueológicos: um diálogo entre a Química, Biologia e Arqueologia

Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química

Organogênese in vitro a partir de diferentes regiões do epicótilo de Citrus sp

O estabelecimento de protocolos para regeneração de plantas in vitro é essencial para o uso de técnicas de transformação genética no melhoramento de citros. Visando à obtenção de um protocolo eficiente de regeneração in vitro para laranja-azeda (Citrus aurantium), laranjas 'Natal' e 'Pêra' (C. sinensis), limão 'Volkameriano' (C. volkameriana) e citrange 'Carrizo' (Poncirus trifoliata x C. sinensis), avaliou-se a resposta morfogênica de diferentes regiões do epicótilo (basal, mediana e apical) em relação a distância do nó cotiledonar, na presença (1,0 mg/L-1) ou ausência de 6-BAP, em meio de cultura MT. Após 60 dias, avaliaram-se a porcentagem de explantes responsivos e o número de gemas adventícias por explante. A resposta morfogênica em função da região do epicótilo e da presença ou ausência da citocinina (6-BAP) foi influenciada pelo genótipo. A presença de 6-BAP no meio de cultura promoveu aumento na porcentagem de explantes responsivos para citrange 'Carrizo'. A suplementação do meio de cultura com a citocinina 6-BAP proporcionou aumento no número de brotos por explante para citrange 'Carrizo', laranja 'Natal' e limão 'Volkameriano'.

Secuenciación de siguiente generación en mujeres afectadas por falla ovárica prematura no sindrómica para la identificación de nuevos genes etiológicos de la enfermedad y estudio funcional de la mutación p.thr943ile en adamts19

La infertilidad afecta en la actualidad a aproximadamente 1 de cada 7 parejas a nivel mundial. La falla ovárica prematura (FOP) es una condición común en la población femenina, afectando al 1% de mujeres menores de 40 años. La etiología de la FOP es idiopática entre el 50% y el 80% de los casos, lo que sugiere causas genéticas, epigenéticas y ambientales aún desconocidas. A pesar de los avances en las técnicas de cartografía genética y de sistematización de la técnica de Sanger, pocos genes etiológicos de FOP fueron identificados en los últimos 20 años. Este fracaso relativo se asoció principalmente a que cientos de genes, que abarcan grandes regiones del genoma, son candidatos pero la técnica de secuenciación directa sólo permite el análisis de unas 700bp en cada reacción. En el presente trabajo se empleó la secuenciación de siguiente generación (NGS) para la búsqueda de mutaciones en 70 genes candidatos que potencialmente contribuyen con el desarrollo de la patología. Se identificaron mutaciones en 3 de 12 pacientes. La paciente POF-7 presentaba una mutación no sinónima en el gen ADAMTS19 (c.2828C>T, p.Thr943Ile). La proteína ADAMTS19 se clasifica dentro de la familia ADAMTS como huérfana ya que no se ha identificado su sustrato. Mediante el sistema de doble hibrido en levaduras se buscó identificar las potenciales proteínas que interactúan con ADAMTS19. Permitió identificar, a partir de las versiones murinas, la interacción de Adamts19 y Col6a2. Para comprobar la interacción entre las proteínas ADAMTS19 y COL6A2 humanas se empleó el sistema de doble hibrido en células eucariotas. Los hallazgos no permitieron replicar los resultados obtenidos previamente. En síntesis de identificó una mutación potencialmente causal de FOP en un gen nuevo y una muy probable interacción entre ADAMTS19 y COL6A2.

Biotecnología : el arte de modificar a los seres vivos para beneficio del hombre.

Resumen literal de la revista. Para redactar este capítulo se han consultado las editoriales, comentarios y artículos originales de las revistas Nature, Bio/Technology, ASM News, SGM Quarterly y Scientific American

El comercio de los productos transgénicos: el estado del debate internacional

Incluye Bibliografía

Transgenia da área de alimentos: uma abordagem de desenvolvimento científico e de segurança alimentar

A produção de alimentos, em quantidade e qualidade suficientes para alimentar a crescente população mundial, é um constante desafio para os governantes, pois requer a conjunção do aumento da produtividade, proteção ambiental e redução do uso de agrotóxicos. O trabalho dos geneticistas nas metodologias tradicionais de pesquisa científica, que transferiam milhares de genes e eliminavam os indesejáveis em muitos anos de trabalho, atualmente pode ser realizado em tempo relativamente curto com as chamadas técnicas de engenharia genética, abrindo uma perspectiva de maior produção de alimentos, iniciada com as culturas de tomate, batata, soja e milho nas últimas décadas do século passado e amplamente empregada hoje. No entanto, o tema da transgenia de alimentos é ainda polêmico e provoca grandes discussões na comunidade científica, principalmente em relação aos possíveis riscos à saúde e prejuízo ao meio ambiente. Com o desenvolvimento de processos agroindustriais, especificamente ao cultivo de alimentos com tecnologia de DNA recombinante, denominados como alimentos transgênicos ou ainda como alimentos geneticamente modificados, criou-se um amplo debate acerca de seus benefícios e malefícios, envolvendo nesta questão interesses conflitantes de grandes conglomerados da biotecnologia, produtores rurais dos grandes aos pequenos e consumidores com seus representantes. Nesta revisão trataremos dos principais tipos.

Transgenia da área de alimentos: uma abordagem de desenvolvimento científico e de segurança alimentar

A produção de alimentos, em quantidade e qualidade suficientes para alimentar a crescente população mundial, é um constante desafio para os governantes, pois requer a conjunção do aumento da produtividade, proteção ambiental e redução do uso de agrotóxicos. O trabalho dos geneticistas nas metodologias tradicionais de pesquisa científica, que transferiam milhares de genes e eliminavam os indesejáveis em muitos anos de trabalho, atualmente pode ser realizado em tempo relativamente curto com as chamadas técnicas de engenharia genética, abrindo uma perspectiva de maior produção de alimentos, iniciada com as culturas de tomate, batata, soja e milho nas últimas décadas do século passado e amplamente empregada hoje. No entanto, o tema da transgenia de alimentos é ainda polêmico e provoca grandes discussões na comunidade científica, principalmente em relação aos possíveis riscos à saúde e prejuízo ao meio ambiente. Com o desenvolvimento de processos agroindustriais, especificamente ao cultivo de alimentos com tecnologia de DNA recombinante, denominados como alimentos transgênicos ou ainda como alimentos geneticamente modificados, criou-se um amplo debate acerca de seus benefícios e malefícios, envolvendo nesta questão interesses conflitantes de grandes conglomerados da biotecnologia, produtores rurais dos grandes aos pequenos e consumidores com seus representantes. Nesta revisão trataremos dos principais tipos.