Improvement of in silico strain engineering methods in Saccharomyces cerevisiae

PhD thesis in Bioengineering

The buildup of knowledge about microbial metabolism and the development of genome engineering techniques gave rise to the rational modification of microorganisms in order to use them to biosynthesize chemicals of industrial interest. Recently, the construction of genome-scale metabolic models (GSMMs) allowed the design of strain engineering strategies in silico. This thesis focused on the study and improvement of in silico strain engineering methodologies using Saccharomyces cerevisiae as a case study organism. Firstly, in order to investigate the accuracy of the GSMMs available for S. cerevisiae, their capacity to simulate the intracellular fluxes in central metabolism was tested. The results revealed that the simulations contained relevant errors in important areas of the central metabolism. A careful manual curation of the feasibility of all reactions producing or consuming NADH / NADPH resulted in the improvement of many fluxes in central metabolic pathways when compared to fluxes measured experimentally. The lack of a simulation method that could predict in quantitative terms the phenotype of strains with complex engineered genotypes, led to the development of a novel simulation method called turnover dependent phenotypic simulation (TDPS). This method was designed with the goal of simulating the majority of the genetic modifications usually implemented in engineered strains. The assumption that the production turnover of a metabolite can be used as an indication of its abundance was used in the formulation of TDPS in order to take into account the availability of resources when modelling genetic modifications. TDPS was validated using metabolically engineered S. cerevisiae strains available in the literature by comparing the production yields of the target metabolite. TDPS was then applied to the optimization of the availability of cytosolic acetyl-CoA in S. cerevisiae, by using an evolutionary algorithm to search for sets of genetic alterations that could improve the production yield of 3-hydroxypropionic acid (3-HP) derived from acetyl-CoA. Although the yields obtained experimentally were considerably lower than the simulations suggested, a positive effect on the 3-HP yield was observed for the downregulation of the pyruvate dehydrogenase complex and the deletion of ACH1 (succinyl- CoA:acetate CoA-transferase).

O progresso que tem sido feito na área da fisiologia microbiana, juntamente com o desenvolvimento de técnicas de engenharia genética, permitiu a criação de estirpes microbianas modificadas racionalmente com o intuito de optimizar a produção de compostos de interesse industrial. Mais recentemente, a construção de modelos metabólicos à escala genómica (MMEG) proporcionou o desenho de estirpes modificadas in silico. Esta tese focou-se no estudo e melhoramento de metodologias de manipulação de estirpes in silico, usando Saccharomyces cerevisiae como caso de estudo. De forma a investigar a precisão dos MMEG disponíveis para S. cerevisiae, a sua capacidade para simular os fluxos intracelulares foi testada. Os resultados mostraram que os fluxos simulados continham erros em áreas importantes do metabolismo central e que a curação manual das reacções envolvidas no metabolismo de NADH e NADPH resulta em melhorias significativas nos fluxos metabólicos centrais. A ausência de um método de simulação que conseguisse prever quantitativamente o fenótipo de estirpes com genótipos complexos, levou ao desenvolvimento de um método novo designado por turnover dependent phenotypic simulation (TDPS). Este método foi concebido com o objectivo de simular a maior parte das modificações genéticas normalmente implementadas em estripes modificadas. A formulação do TDPS teve como base o uso do nível de produção de um metabolito como indicador da sua abundancia, de forma a modelar as modificações genéticas em função da disponibilidade de recursos. A validação deste método foi feita usando dados da literatura sobre estirpes geneticamente modificadas de S. cerevisiae, através da comparação dos rendimentos simulados e reais. O método de simulação TDPS foi posteriormente aplicado na optimização da produção de acetil-CoA no citosol de S. cerevisiae, usando um algoritmo evolucionário para procurar conjuntos de alterações genéticas que aumentassem a produção de ácido 3- hidroxipropiónico derivado de acetil-CoA. Apesar dos rendimentos experimentais serem mais baixos que as simulações sugeriam, observou-se um efeito positivo da sub-regulação do complexo da piruvato desidrogenase e da eliminação do gene ACH1 (succinil- CoA:acetato CoA-transferase).

Esta investigação foi financiada pela Fundação para a Ciência e Tecnologia através da concessão de uma bolsa de doutoramento (SFRH/BD/51111/2010), co-financiada pelo POPH - QREN - Tipologia 4.1 -Formação Avançada - e comparticipados pelo Fundo Social Europeu (FSE) e por fundos nacionais do Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES).