Caratterizzazione dell'attivita pirofosfatasica associata al dominio php della DNA Polimerasi III di Escherichia coli

Il presente lavoro si incentra sulla parziale caratterizzazione del sito attivo del dominio PHP della subunità alpha, componente fondamentale dell'Oloenzima polimerasi III di E. coli. E' stato messo in luce il coinvolgimento di questo dominio nel meccanismo di idrolisi del pirofosfato generato dalla reazione polimerasica, valutando inoltre il grado di associazione tra queste due attività.

Valutazione del Beta Carba test per il rapido rilevamento di enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE)

L’antibiotico resistenza negli enterobatteri produttori di carbapenemasi (CPE) rappresenta una problematica emergente in sanità pubblica, dato che le opzioni alternative per il trattamento di pazienti infetti sono limitate. L’andamento epidemiologico di CPE a livello globale appare ad oggi molto variegato con differenze significative tra paesi. In Italia la diffusione di K. pneumoniae produttrice di KPC è endemica ed è stimata essere un terzo (32,9%) delle infezioni invasive (sangue e liquor) da K. pneumoniae. Pertanto, diventa indispensabile implementare gli studi di farmaco-resistenza per valutare e ridurre il potenziale di crescita di tali microrganismi. Questo studio presenta come fine la valutazione del Beta Carba test, metodo cromogeno, per il rapido rilevamento di CPE in confronto con il metodo standard di riferimento. Lo studio è stato svolto presso l’U.O. Microbiologia AUSL della Romagna ed è di natura retrospettiva, di tipo esclusivamente qualitativo. Sono stati analizzati 412 campioni completamente anonimizzati: 50 emocolture, 250 urine e 112 tamponi rettali di sorveglianza. La valutazione del test è stata condotta sia direttamente a partire dalle matrici biologiche (emocolture e urinocolture positive) che dalle colonie isolate di CPE da tamponi rettali di sorveglianza, urine o emocolture. I risultati sperimentali ottenuti in vitro con il β Carba, mostrano una totale concordanza con i metodi sia fenotipici che genotipici utilizzati come riferimento: sono state ottenute sensibilità e specificità del 100%. Inoltre, a favore del test si inserisce il parametro fondamentale della rapidità, consentendo quindi una celere rilevazione di CPE direttamente su campioni clinici con un tempo di risposta piuttosto veloce e affidabile pari a 15-30 minuti. In definitiva, grazie alla performance dimostrata in vitro, il test può rappresentare un valido strumento per arginare e limitare lo spreading di CPE, svolgendo un buon ruolo nella gestione dei pazienti infetti.

Determinazione dello stato di stress ossidativo in tessuti di topo trattati con sale sodico di clorofilliana magnesiaca

Gli esperimenti condotti in questo progetto di ricerca sono volti allo studio degli effetti di integratori a base di clorofillina magnesiaca sullo stato di stress ossidativo sui tessuti murini. Per le analisi sono state prese in esame due corti di topi femmine da 48 e 44 esemplari ciascuna. Le due corti sono state sottoposte a un diverso tipo di trattamento, rispettivamente: trattamento cronico con diverse quantità di soluzione idroalcolica di clorofillina magnesiaca e trattamento acuto con unica dose standard di soluzione idroalcolica di clorofillina magnesiaca. In questo modo è stato possibile studiare l'efficacia degli integratori in base al tipo di trattamento. Le analisi sono state fatte con saggio TBARS sui topi della prima corte e con saggio FRAP sui topi di entrambe le corti. Il saggio TBARS mostra lo stato di tress ossidativo dei tessuti mediante quantificazione della malondialdeide. Il saggio FRAP descrive la capacità riducente della clorofilliana estratta dai campioni di tessuto. In un progetto parallelo a quello descritto in questa tesi è stata quantificata la clorofilla tramite spettrofluorimetria per costruire un parallelo fra quantità e potere riducente rilevato. Grazie all'analisi dei risultati è possibile dire che la clorofillina magnesiaca non è proossidante e presenta potere riducente. Tuttavia un trattamento acuto non è sufficiente a farla accumulare nei tessuti.

Studio della correlazione fra la percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR e la risposta a farmaci TKI nell'adenocarcinoma polmonare

Il gene EGFR e' un marcatore molecolare fondamentale per determinare la sensibilita' o meno ai farmaci inibitori delle tirosin-chinasi (TKI) in pazienti affetti da adenocarcinoma polmonare. Lo scopo del lavoro e' di determinare se la percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR correli con la risposta ai farmaci TKI. Sono stati analizzati 18 casi; di ogni caso e' stato analizzato il gene EGFR (esoni 18, 19, 20 e 21) mediante Next Generation Sequencing (NGS). La quantita' di cellule neoplastiche presenti nell'area analizzata e' stata valutata da un patologo, su un vetrino colorato con Ematossilina-Eosina, e tale quantita' e' stata normalizzata alla percentuale di alleli mutati rilevata mediante NGS. E' stata rilevata una correlazione fra la percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR e la risposta ai TKI, ed e' stato osservato che pazienti con una percentuale di cellule neoplastiche mutate al di sopra del 56% presentano una migliore "overall survival" rispetto ai pazienti con una percentuale inferiore. I dati suggeriscono che, oltre al valore predittivo, la definizione della percentuale di cellule neoplastiche mutate in EGFR potrebbe avere un valore prognostico.

Valutazione della localizzazione e della tossicità di nanoparticelle di silice fluorescenti su linee cellulari tumorali umane

Lo scopo di questa tesi è valutare l’attività di uptake delle cellule nei confronti di nanoparticelle di silice fluorescenti e il loro possibile effetto citotossico. Per verificare l’attività di uptake delle cellule abbiamo utilizzato 4 diverse linee cellulari tumorali umane e abbiamo studiato il comportamento delle nanoparticelle all’interno delle cellule grazie all’utilizzo del microscopio a fluorescenza, con cui abbiamo potuto valutare se le particelle sono in grado di penetrare nel nucleo, soprattutto ad alte concentrazioni o a lunghi tempi di incubazione. Per questa valutazione abbiamo effettuato incubazioni a concentrazioni crescenti di nanoparticelle e a tempi di incubazione sempre più lunghi. Inoltre, abbiamo coltivato le cellule sia in condizioni di crescita ottimali, addizionando il terreno con FBS, che in condizioni subottimali, senza l’aggiunta di FBS nel terreno, perché abbiamo ipotizzato che le proteine presenti nell’FBS potessero disporsi come una corona esternamente alle cellule, ostacolando l’uptake delle nanoparticelle. Infine, abbiamo valutato se le diverse linee cellulari avessero dei comportamenti diversi nei confronti dell’internalizzazione delle nanoparticelle. Per quanto riguarda la valutazione di un possibile effetto citotossico delle nanoparticelle, invece, abbiamo effettuato dei saggi di vitalità cellulare, anche in questo caso utilizzando 4 linee cellulari differenti. Come per l’analisi in microscopia, abbiamo effettuato l’incubazione a concentrazioni crescenti di nanoparticelle, a tempi di incubazione sempre più lunghi e in condizioni ottimali, aggiungendo FBS al terreno, o subottimali, senza FBS. Queste variazioni nelle condizioni di incubazione erano necessarie per capire se la vitalità cellulare potesse dipendere da un’alta concentrazione di nanoparticelle, da lunghi tempi di incubazione e dalla presenza o assenza di FBS e se l’effetto fosse diverso a seconda della linea cellulare sottoposta al trattamento.

Analisi di 3 microdelezioni implicate nel disturbo autistico

Nella Tesi viene riportata l’analisi genetica di un campione di 128 famiglie con Disturbo dello Spettro Autistico, tramite il sistema di SNP array “PsychArray” (Illumina ), contenente oltre 500.000 sonde sull’intero genoma. Questi dati sono stati utilizzati per individuare Copy Number Variants (CNVs) rari e rilevanti da un punto di vista clinico. Sono stati quindi selezionati tre CNVs per un ulteriore approfondimento: due microdelezioni già descritte come patologiche (rispettivamente nella regione 1p36.32 e 22q13.33 comprendente il gene SHANK3) sono risultate essere “de novo”, mentre una terza microdelezione nel gene CTNNA3 è ereditata dalla madre. Tutti e tre i CNV sono stati validati tramite Real Time-PCR, definendone i confini. Per quanto riguarda la microdelezione in CTNNA3, poiché difetti di questo gene sono stati implicati nell’autismo con un meccanismo recessivo, è stata anche condotta un’analisi di sequenza di tutti gli esoni del gene negli individui della famiglia interessata, al fine di ricercare eventuali mutazioni puntiformi sull’allele non deleto. Questa analisi non ha individuato nessuna variante potenzialmente dannosa, pertanto il difetto in CTNNA3 non risulta essere la causa principale del fenotipo autistico in questa famiglia, anche se potrebbe avere un ruolo come fattore di suscettibilità.

Studio dell'autofagia come meccanismo patogenetico della Neuropatia Ottica Ereditaria di Leber

Questo elaborato di tesi presenta uno studio volto a identificare il ruolo dell’autofagia nella patogenesi della neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON), una patologia neurodegenerativa mitocondriale dovuta a mutazioni nel mtDNA. Tali mutazioni generano difetti nella catena respiratoria, nelle vie apoptotiche mediate dai mitocondri e nella produzione di ROS; dati preliminari hanno dimostrato una correlazione tra le mutazioni LHON e l’omeostasi mitocondriale, regolata dai processi contrapposti di autofagia e mitobiogenesi. Secondo questa ipotesi, le alterazioni LHON aumentano il flusso autofagico soprattutto negli individui affetti, mentre i portatori di mutazione sani (carrier) risultano protetti da un importante incremento nella mitobiogenesi che agisce da meccanismo compensatorio. È stata dunque caratterizzata tramite Western Blotting l’espressione proteica di due marker autofagici, LC3 e p62, in PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) estratte da pazienti LHON, affetti e carrier, e individui di controllo. Sono stati inoltre quantificati i livelli cellulari di due proteine della membrana interna mitocondriale, COX IV e SDHA, al fine di valutare la massa mitocondriale come parametro di confronto rispetto ai livelli di autofagia. È stata infine analizzata l’influenza dell’idebenone sull’autofagia e sulla massa mitocondriale, confrontando pazienti affetti in terapia con questo farmaco e pazienti affetti non trattati. Lo studio ha in parte avvalorato i risultati preliminari; l’elevata variabilità riscontrata porta però all’esigenza, nelle analisi future, di una maggiore campionatura, nonché di indagini di diversa natura condotte in parallelo per validare i risultati.

Sea organisms as a source of collagen-derived polymers for skin tissue engineering applications

Advanced therapies combating acute and chronic skin wounds are likely to be brought about using our knowledge of regenerative medicine coupled with appropriately tissue engineered skin substitutes. At the present time, there are no models of an artificial skin that completely replicate normal uninjured skin and they are usually accompanied by fibrotic reactions that result in the production of a scar. Natural biopolymers such as collagen have been a lot investigated as potential source of biomaterial for skin replacement in Tissue Engineering. Collagens are the most abundant high molecular weight proteins in both invertebrate and vertebrate organisms, including mammals, and possess mainly a structural role in connective tissues. From this, they have been elected as one of the key biological materials in tissue regeneration approaches, as skin tissue engineering. In addition, industry is constantly searching for new natural sources of collagen and upgraded methodologies for their production. The most common sources are skin and bone from bovine and porcine origin. However, these last carry high risk of bovine spongiform encephalopathy or transmissible spongiform encephalopathy and immunogenic responses. On the other hand, the increase of jellyfish has led us to consider this marine organism as potential collagen source for tissue engineering applications. In the present study, novel form of acid and pepsin soluble collagen were extracted from dried Rhopilema hispidum jellyfish species in an effort to obtain an alternative and safer collagen. We studied different methods of collagen purification (tissues and experimental procedures). The best collagen yield was obtained using pepsin extraction method (34.16 mg collagen/g of tissue). The isolated collagen was characterized by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and circular dichroism spectroscopy.

L'epcidina e il suo ruolo nell'omeostasi del ferro a livello cardiaco.

L’epcidina (HAMP) è un ormone peptidico coinvolto nella regolazione sistemica dell’omeostasi del ferro e risulta essere espresso anche a livello cardiaco. Questo studio è stato condotto per approfondire le conoscenze riguardo al ruolo dell’epcidina e dei geni regolatori del ferro e il loro coinvolgimento nella patologie cardiache. Sono stati condotti studi sull’atassia di Friedreich (FRDA), una patologia neurodegenerativa caratterizzata dallo sviluppo di una cardiomiopatia da sovraccarico di ferro. A tale scopo, sono stati derivati cardiomiociti da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) di un paziente affetto da FRDA e da un soggetto sano (Ctr) e in queste cellule è stata analizzata l’espressione del gene HAMP. I risultati ottenuti hanno evidenziato un aumento significativo dell’espressione genica di HAMP nei cardiomiociti FRDA rispetto ai controlli. Parallelamente, l’espressione genica di HAMP e di altri geni regolatori del ferro è stata analizzata in un modello animale murino sottoposto a ipossia intermittente (IH) e a un danno ischemico indotto dalla legatura coronarica (LAD). Nel gruppo di topi normossici sottoposti alla legatura coronarica (Normo LAD) è stata evidenziato un aumento dell’espressione genica di HAMP simile a quello riscontrato nei cardiomiociti FRDA, suggerendo che questo gene potrebbe essere indotto in presenza di un danno cardiaco. Inoltre, l’espressione della ferritina, una proteina coinvolta nello storage del ferro con attività antiossidante, rimane invariata nei topi sottoposti a un danno cardiaco come la LAD, mentre risulta essere aumentata nei topi sottoposti a IH. Pertanto, l’aumento di espressione della ferritina potrebbe contribuire ai meccanismi di cardioprotezione indotti dall’ipossia intermittente. I risultati di espressione genica ottenuti in questo studio saranno validati mediante studi di espressione proteica.

Analisi cinematica del nuoto tramite IMU: Stima della durata delle fasi e della velocità.

Nell’ambito del nuoto, la scelta della strumentazione è legata all’ambiente, il metodo più utilizzato per analizzare il movimento degli atleti, ancora oggi, è quello dell’analisi video, che utilizza videocamere subacquee. L’analisi video in acqua ha diversi limiti: presenta errori legati alla turbolenza e alla rifrazione aria/acqua, necessità di elevati tempi sia per la calibrazione sia per l’elaborazione dei dati, non consente un feedback in tempo reale e quindi non fornisce informazioni immediate all’allenatore e ha costi elevati. Da qui la necessità di investigare altri metodi. Il metodo alternativo proposto, per la prima volta da Oghi et al. nel 2000 utilizza i sensori inerziali (IMU- Inertial Measurements Units) che possono essere indossati dall’atleta, previa impermeabilizzazione. Non sono invasivi e non limitano eccessivamente il movimento, non richiedono un setup di calibrazione complesso e hanno costi ridotti. Per questo elaborato sono stati stimati i parametri che vengono tipicamente utilizzati dagli allenatori per valutare le performance degli atleti durante l’allenamento: parametri temporali legati alle fasi della bracciata e la velocità istantanea. Sono state effettuate prove sul campo, presso il Laboratorio di Biomeccanica della Scuola di Farmacia, Biotecnologie e Scienze Motorie, situato nella palestra Record del CUSB di Bologna.

Annali della Scuola normale superiore di Pisa, Classe di scienze

Mode of access: Internet.

Annali delle università toscane.

At head of title, 1916- : R. Università di Pisa.

La trasposizione didattica nell'insegnamento delle scienze sociali : dalla storia degli storici alla storia per la scuola. 'La transposición didáctica en la enseñanza de las Ciencias Sociales : de la historia de los hitoriadores a la historia para la escuela'.

Se plantea la preocupación por la ausencia de una conciencia de la génesis transpositiva del saber histórico que incide en una deficiente enseñanza de la historia. La noción de transposición obliga a una nueva visión de la didáctica al considerar el saber histórico y el texto que lo comunica, como un problema y no como un supuesto previo.

Inibizione selettiva delle istone-deacetilasi nelle cellule neoplastiche come approccio innovativo alla terapia antitumorale

Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nel valutare l’efficacia di inibizione delle HDAC e la selettività per le cellule tumorali di nuove molecole basate su coniugati poliamminici (PC1, PC2, PC3, PC4, PC5). I modelli sperimentali utilizzati saranno una linea cellulare tumorale di glioblastoma umano (U87), paragonata a una linea cellulare sana di fibroblasti fetali umani (IMR90). Il progetto nasce dalla collaborazione con la Prof.ssa Anna Minarini del Dipartimento di Farmacia e BioTecnologie di Bologna e con il Dott. Andrea Milelli del Dipartimento di Scienze per la Qualità della Vita di Rimini che hanno progettato e sintetizzato i composti poliamminici utilizzati negli esperimenti condotti nel laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare “S. Cavalcanti” a Cesena. Gli obiettivi del progetto consistono nel valutare i potenziali vantaggi che sembrano offrire le poliammine se coniugate a molecole con specifiche funzioni antitumorali, quali l’acido idrossamico e il gruppo intercalante il DNA, naftalene-diimide. L’aggiunta della coda poliamminica al composto, infatti, permetterebbe alla molecola risultante di sfruttare il sistema di trasporto delle poliammine, tipicamente sovraespresso o iperattivo nelle cellule neoplastiche, favorendo così l’ingresso in cellula del farmaco e conferendogli selettività per le cellule tumorali. Inoltre, l’affinità elettrostatica che intercorre tra la coda policationica poliamminica e il DNA, carico negativamente, direzionerebbe con maggior efficacia l’intera molecola, compresa la parte intercalante e l’acido idrossamico (HDACi), verso il loro bersaglio, la doppia elica dell’acido nucleico e le HDAC. Gli effetti dei PC valutati in questo lavoro di tesi comprendono l’influenza dei farmaci sulla vitalità cellulare e l’efficacia di inibizione delle HDAC. Si effettueranno test di crescita cellulare in seguito ai trattamenti farmacologici per confrontare i diversi composti poliamminici, individuare quelli con maggior effetto citotossico e stabilire se il tipo di trattamento risulti idoneo per il proseguimento dell’indagine. Il grado di inibizione delle HDAC, relativo ai diversi farmaci, verrà valutato indirettamente mediante la tecnica del Western Blotting quantificando il livello di iperacetilazione istonica globale indotta. I vantaggi che queste nuove molecole potenzialmente possiedono e che andranno verificati con ulteriori studi, inducono ad attribuire loro un grande potenziale per la terapia antitumorale, come induttori dell’apoptosi e/o riprogrammazione dell’assetto epigenetico, risultante nella riattivazione di geni oncosoppressori silenziati nelle cellule neoplastiche. L’azione antitumorale di queste molecole potrà essere più efficace se combinata con altri farmaci, quali chemioterapici standard o demetilanti del DNA. Inoltre la variazione della coda poliamminica potrà essere utile per lo sviluppo di inibitori specifici per le diverse isoforme delle HDAC. La selettività per le cellule tumorali e l’affinità per il DNA di questi nuovi composti potrebbe infine limitare gli eventuali effetti collaterali in clinica.

Goffredo Fofi, Caro ministro: non vede che la scuola è morta?

Testo da commentare sotto l'aspetto prevalentemente linguistico