Evaluación de cinco cepas de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli en el cultivo del frijol (Phaseolus vulgaris L.) var. Rev. 84

Esta investigación se realizó en el Centro Experimental "La Compañía" ubicada en San Marcos, Carazo, con el objetivo de evaluar la adaptabilidad de las cepas en las condiciones estudiadas, determinar cuál de las cepas es la más infectiva y efectiva en cuanto a la nodulación y determinar su efecto en el crecimiento y rendimiento del cultivo del frijol (Phaseolus vulgaris L.) var. Rev. 84. Los factores evaluados fueren 5 cepas de Rhisoblum leguminosearum by. phaseoli y 3 testigos: 1 Testigo Absoluto (no inoculado. no fertilizado) Y 2 Testigos Relativos (no inoculados y fertilizados). El diseño experimental utilizado fue el de bloques completos al azar (SCA), con 4 repeticiones. La parcela experimental del ensayo fue de 32 (8 m x 4 m), la distancia de siembra fue de 0.1 m entre plantas y 0.4 m entre surcos. Las variables analizadas fueron: número; eficiencia y peso seco de nódulos por planta, peso seco de área foliar y rendimiento. Los datos se procesaron usando análisis de varianza (AHUEVA) y se utilizó la prueba de rangos múltiples de DUNCAN (P ≤ 0. 05). No se observó diferencias significativas para las variables de nodulación y rendimiento, determinándose efecto significativo sólo para el peso seco de área foliar en la I y II etapa de evaluación Sin embargo, se determinó quo la cepa CR-436 fue la que presentó mayor infectividad en el sistema radicular y la cepa CIAT-899, la que presentó el mejor porcentaje de efectividad nodular y con la que se obtuvo el mayor promedio de peso seco de área foliar. El mejor rendimiento fue obtenido con la cepa CR-436.

Incremento de la productividad de frijol (Phaseolus vulgaris L.) a nivel de finca mediante la inoculación con Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli

El efecto de una mezcla de tres cepas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoll (CIAT-613, CR-477 y KIM-5) relacionado con los factores limitantes del suelo (P, Ca, Cu, y Zn) sobre la simbiosis en tres variedades de Phaseolus vulgaris L. (DOR-364, ESTELI-90B y FIEVOLUCION-84) fue estudiado en un suelo Molisol y un Aluvial en las localidades de San Diego (Nandaime) y San Lorenzo (La Trinidad, Estelí), respectivamente, bajo condiciones de labranza convencional para ambas localidades. En la localidad de San Lorenzo se trabajó con las variedades DOR-364 y EST-908 con la corrección del cobre (factor A) y el zinc (factor 8), mientras que en la localidad de San Diego, el trabajo se realizó con las variedades DOR-364 y REVOLUCION-84 y la corrección del calcio (factor A) y el fósforo (factor 8), Ambos estudios se llevaron a cabo en época de postrera de 1994. En los dos ensayos la inoculación se hizo directamente a la semilla. Los tratamientos a evaluar fueron los siguientes: Alto nitrógeno, bajo nitrógeno como testigos (sin inocular), mezcla de inoculantes con (-A,-B), (+A,-B), (-A,+B), y (+A,+B) para un total de seis tratamientos por cada variedad. El diseño usado fue de bloques completos al azar (B.C.A). Las variables evaluadas fueron: Número y peso seco de nódulos, peso de materia seca de la planta en R6, peso de mil granos y rendimiento de grano en R9. Los datos se procesaron usando análisis de varianza (ANDEVA) y se utilizó la prueba de rangos múltiples de DUNCAN (P ≤ 0,05). Se observó a nivel general en ambos experimentos que la variedad introducida mostró un mayor rendimiento y que el mejor rendimiento de grano se obtuvo con el tratamiento en el que se usó alta dosis de nitrógeno y sin inocular. Por otro lado el rendimiento de frijol fue afectado negativamente por las aplicaciones de zinc en el caso del experimento en San Lorenzo. Para la localidad de San Diego se obtuvo respuesta positiva a las aplicaciones de fósforo junto con la mezcla de inoculantes usados. En los dos experimentos no se encontró respuesta significativa con el uso de la mezcla de inoculantes relacionados con los elementos limitantes del suelo comparado con los testigos.

Incremento de la productividad de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) a nivel de finca mediante la inoculación con Rhizobium leguminosarum bv. Phaseoli

En el presente trabajo experimental se evaluó la respuesta a la inoculación de dos variedades de frijol común Phaseolus vulgaris L. con el objetivo de incrementar los rendimientos unitarios. Las variedades fueron DOR-364 y EST-90B, inoculadas con tres cepas de Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli (CR-477, KIM-5 y CIAT-613) bajo condiciones de labranza convencional en la localidad de San Lorenzo, ubicada a 1O km del municipio de La Trinidad en el departamento de Estelí. Este estudio se realizó en dos etapas, postrera (1993) y primera (1994). En la primera etapa experimental se aplicó el inoculante al suelo al momento de la siembra y en la segunda etapa la inoculación se hizo a la semilla. En la primera etapa se utilizaron dos inoculantes (KIM-5 y CR-477) comparados con dos testigos sin inocular, con bajo nitrógeno (20 kg/ha de N) y el testigo sin inocular y el otro con alto nitrógeno (90 kg/ha de N en forma fraccionada). En la segunda etapa experimental, los tratamientos inoculados (KIM-5, CR-477, CIAT-613 y mezcla de las tres cepas), se compararon siempre con dos testigos sin inocular, uno sin nitrógeno y otro con alto nitrógeno (50 kg/ha de N). El diseño utilizado para ambas fases fue el de parcelas divididas (DPD). En el primer ensayo las variables medidas fueron número y peso seco de nódulos, peso seco de la parte aérea en las etapas R6 y R8 así como el rendimiento de grano. En el segundo ensayo se hicieron las mismas mediciones con la excepción del peso seco de la parte aérea en la etapa R8 del cultivo. En el primer experimento hubo respuesta significativa a la inoculación con las cepas evaluadas en la etapa R8 del cultivo, mientras que en el segundo experimento no hubo respuesta significativa en el peso seco de la parte aérea en esta etapa, en donde el mejor tratamiento fue el fertilizado con alto nitrógeno en el primer ensayo. En la primera fase del estudio, el rendimiento aunque no significativo, se vio favorecido con la fertilización nitrogenada para ambas variedades. En el segundo experimento se observó diferencias significativas en el rendimiento de grano, obteniéndose los más altos rendimientos con el tratamiento CR-477 en ambas variedades. En este estudio los tratamientos fertilizados presentaron menor rendimiento comparado con los tratamientos sin nitrógeno.

Validación tecnológica de una mezcla de cepas de Rhizobium leguminosarum bv phaseoli en frijol común (Phaseolus vulgaris L.), en el municipio de Boaco durante la época de apante 1998-1999

El presente trabajo de validación tecnológica de inoculación de una mezcla de cepas de Rhizobium en frijol común (Phaseolus vulgaris L.) se llevó a cabo en el municipio de Boaco, departamento de Boaco, en la época de apante 1998-1999. Se evaluaron un tratamiento alternativo, como es el uso de inoculante y el tratamiento tradicional empleado por los productores, uso de fertilizante, en fincas de nueve productores. Las variables evaluadas fueron: altura de planta, diámetro de tallo, número de nódulos, peso seco de nódulos, número de vainas por planta, número de granos por vaina y rendimiento; evaluadas en las etapas R6 y R8. Los resultados obtenidos indican que se obtuvieron tres fincas con ambientes buenos, no encontrándose significancia estadística entre los rendimientos, ni en las variables de crecimiento, a excepción de la variable número de vainas por planta. Al realizar el análisis económico del presupuesto parcial se determinó que en seis fincas de los productores la tecnología tradicional resultó, dominada La percepción de los productores es positiva en cuanto al uso del inoculante, dado que permite obtener buenos rendimientos a un menor costo en comparación con la tecnología tradicional que ellos utilizan.

Validación tecnológica de una mezcla de cepas de Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli en frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en el municipio de Santa Lucía, Boaco, durante la época de primera, 1999

Con el presente trabajo, se validó una tecnología de inoculación de una mezcla de cepas de Rhizobium en frijol común (Phaseo/us vulgaris L). Esta se llevó a cabo en el municipio de Santa Lucía Departamento de Boaco, en la época de primera de 1999, con el objetivo de probar una tecnología alternativa (uso de inoculante), comparado al manejo tradicional que le dan los productores a sus parcelas, teniéndose en cuenta que en ambas parcelas no se les aplicó fertilizante. Esta validación se realizó en la finca de 9 productores, quienes se encargaron del manejo agronómico del cultivo. Las variables evaluadas fueron: Altura de planta, Número de granos por vaina, Diámetro de tallo, Número de nódulos, Peso seco de nódulos, Número de vainas por planta, evaluadas en las etapas R6 y R8 y Rendimiento. De acuerdo a los resultados, se obtuvieron 4 fincas con ambientes buenos, los rendimientos obtenidos oscilaron entre 215.43 a 2,154.33 kg/ha, todas las variables evaluadas presentaron significancia estadística, con excepción de la variable "Número de vainas por planta y Número de granos por vainas." En el análisis económico, en el presupuesto parcial, resultaron 7 parcelas dominadas por el tratamiento alternativo. Respecto a la percepción de los productores, a través de encuesta se logró determinar que el 83%, de los productores están dispuestos a optar la nueva alternativa

Efeitos da toxicidade por metais pesados em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii: diversidade e resposta de população isoladas de uma mina de chumbo

Nas últimas décadas verificou-se um aumento da contaminação dos solos com metais pesados resultante de processos antropogénicos. As descargas de efluentes industriais, a actividade mineira e a aplicação de lamas residuais e de fertilizantes são as principais fontes de metais pesados. Em certas regiões, a acumulação destes elementos nos solos tem atingido níveis preocupantes para o equilíbrio dos ecossistemas. Vários estudos têm demonstrado que os metais influenciam os microrganismos afectando adversamente o seu crescimento, morfologia e actividades bioquímicas resultando num decréscimo da biomassa e diversidade. Entre os microrganismos do solo, as bactérias pertencentes ao género Rhizobium têm um elevado interesse científico, económico e ecológico devido à sua capacidade para fixar azoto. Deste modo, o trabalho desenvolvido ao longo desta tese incidiu sobre o efeito da toxicidade imposta pelos metais nas bactérias fixadoras de azoto, em particular em Rhizobium leguminosarum bv. trifolii e teve como principais objectivos: determinar o efeito dos metais pesados na sobrevivência e na capacidade de fixar azoto dos isolados de rizóbio; avaliar a influência dos metais na diversidade das populações de rizóbio isoladas de solos contaminados; determinar os níveis de tolerância do rizóbio a diferentes metais e analisar a resposta ao stresse oxidativo imposto pelo cádmio. A Mina do Braçal foi o local de estudo escolhido uma vez que os seus solos estão muito contaminados com metais em resultado da extracção de minério durante mais de 100 anos. Foram escolhidos 3 solos com diferentes graus de contaminação, o solo BC com concentrações reduzidas de metais, escolhido por estar numa zona já fora da mina e designado por solo controlo e os solos BD e BA considerados medianamente e muito contaminados, respectivamente. O Pb e o Cd foram os metais predominantes nestes solos, assim como o metalóide As, cujas concentrações ultrapassaram largamente os limites previstos na lei. Sendo as enzimas do solo boas indicadoras da qualidade do mesmo, foi determinada a actividade de algumas como a desidrogenase (DHA) e a catalase (CAT). Ambas as enzimas correlacionaramse negativamente com as concentrações de metais nos solos. A dimensão das populações indígenas de rizóbio nos solos contaminados (BD e BA) foi bastante baixa, 9,1 bactérias g-1 de solo e 7,3 bactérias g-1 de solo, respectivamente, quando em comparação com a população do solo BC (4,24x104 bactérias g-1 de solo). Estes resultados parecem estar relacionados com o elevado conteúdo em metais e com o pH ácido dos solos. A capacidade simbiótica também foi afectada pela presença de metais, uma vez que os isolados originários do solo BD mostraram menor capacidade em fixar azoto do que os isolados do solo controlo. A diversidade das populações de rizóbio foi determinada com recurso à análise dos perfis de plasmídeos, perfis de REP e ERIC-PCR de DNA genómico e perfis de proteínas e lipopolissacarídeos. No conjunto dos 35 isolados analisados foram identificados 11 plasmídeos com pesos moleculares entre 669 kb e 56 kb. Embora a incidência de plasmídeos tenha sido superior nos isolados do solo BC verificou-se maior diversidade plasmídica na população isolada do solo BD. Resultados similares foram obtidos com os perfis de REP e ERIC-PCR e perfis de proteínas, que indicaram maior diversidade nas populações dos solos contaminados (BD e BA), contrariamente ao verificado por outros autores. O grau de tolerância aos metais pesados e ao arsénio dos vários isolados testados dependeu do metal e do local de origem. No geral, os isolados do solo BD mostraram maior tolerância aos metais do que os isolados do solo controlo, o que está de acordo com o esperado uma vez que geralmente as populações dos locais contaminados são mais tolerantes. Contudo, os isolados do local mais contaminado (BA) foram muito tolerantes apenas ao chumbo mostrando-se sensíveis aos restantes metais. A inoculação dos solos BC, BD e BA após irradiação com estirpes seleccionadas de rizóbio permitiu avaliar a sua sobrevivência ao longo de 12 meses em condições mais realistas. Verificou-se que após um decréscimo inicial, os isolados inoculados no solo BC conseguiram recuperar a dimensão das suas populações para números similares aos inicialmente introduzidos, contrariamente ao verificado no solo BD onde o número de rizóbios decresceu ao longo dos 12 meses. As condições adversas do solo BA apenas permitiram a sobrevivência de 4 isolados até aos 3 meses e apenas dois deles conseguiram sobreviver após 12 meses, designadamente C 3-1 e A 17-3. Estes isolados possuem um plasmídeo de 669 kb que poderá estar na base da sobrevivência destas estirpes. Por outro lado, o último isolado é originário do solo contaminado e por isso estará também mais adaptado a sobreviver às elevadas concentrações de Pb existentes no solo BA. Por fim, constatou-se que o cádmio, um dos metais presente em concentrações mais elevadas nos solos em estudo, é um indutor de stresse oxidativo nos isolados de rizóbio menos tolerantes o que foi confirmado pelo aumento de ROS e danos celulares ao nível dos lípidos.

Study of the Cd complexation mechanism by glutathione in Rhizobium leguminosarum

A associação simbiótica de plantas leguminosas com bactérias do género Rhizobium é o maior e mais eficiente contribuinte de azoto fixado biologicamente (Somasegaran e Hoben, 1994; Zahran, 1999). No entanto, o constante aumento da poluição em solos agrícolas, nomeadamente a contaminação por metais devido à aplicação de fertilizantes e de lamas, está a tornar-se um problema ambiental cada vez mais preocupante (Alloway, 1995a; Giller et al., 1998; Permina et al., 2006; Thorsen et al., 2009; Wani et al., 2008), influenciando de forma negativa a persistência destas bactérias nos solos agrícolas, assim como a sua eficácia de nodulação (Broos et al., 2005; Wani et al., 2008;. Zhengwei et al., 2005). Desta forma, o estudo dos mecanismos de tolerância de Rhizobium a metais tornou-se uma área de investigação de elevada importância. Com o trabalho apresentado nesta tese pretendeu-se perceber melhor a tolerância Rhizobium leguminosarum ao cádmio (Cd), dando particular atenção a um mecanismo de tolerância previamente descrito em R. leguminosarum (Lima et al., 2006): a complexação intracelular de Cd pelo tripéptido glutationa (GSH). Assim, o principal objectivo deste trabalho foi perceber melhor qual a importância deste mecanismo nos níveis de tolerância de rizóbio ao Cd. Como já tinha sido descrito em trabalhos anteriores (Figueira et al., 2005; Lima et al., 2006), foi possível verificar que a estirpe mais tolerante ao metal apresenta níveis mais elevados de Cd e GSH intracelulares. Demonstrou-se ainda que a tolerância ao Cd está dependente da maior eficiência no mecanismo de complexação observada na estirpe tolerante, logo durante as primeiras 12 h de crescimento. Gomes et al. (2002) verificou que a acumulação de complexos GSH-Cd no citoplasma inibe a entrada de metal na célula. Como neste trabalho se observou um aumento nos níveis de Cd intracelular na estirpe tolerante ao longo do tempo, surgiu a hipótese dos complexos serem excretados para o espaço periplasmático. Os elevados níveis de GSH e de Cd determinados no espaço periplasmático corroboraram esta hipótese. Neste trabalho demonstrou-se ainda que a eficácia do mecanismo de complexação, depende da actividade enzimática de uma isoforma específica de GST, que apresentou um elevado acréscimo de actividade na presença do metal. Desta forma, os resultados desta tese indicam que, a maior tolerância de R. leguminosarum ao Cd, depende da capacidade das estirpes para induzir a síntese de GSH na presença de Cd e, simultaneamente aumentar a actividade enzimática da GST específica, optimizando assim o mecanismo de complexação de Cd intracelular.

Transcriptomic analysis of rhizobium leguminosarum biovar viciae in symbiosis with host plants pisum sativum and Vicia cracca

Rhizobium leguminosarum bv. viciae forms nitrogen-fixing nodules on several legumes, including pea (Pisum sativum) and vetch (Vicia cracca), and has been widely used as a model to study nodule biochemistry. To understand the complex biochemical and developmental changes undergone by R. leguminosarum bv. viciae during bacteroid development, microarray experiments were first performed with cultured bacteria grown on a variety of carbon substrates (glucose, pyruvate, succinate, inositol, acetate, and acetoacetate) and then compared to bacteroids. Bacteroid metabolism is essentially that of dicarboxylate-grown cells (i.e., induction of dicarboxylate transport, gluconeogenesis and alanine synthesis, and repression of sugar utilization). The decarboxylating arm of the tricarboxylic acid cycle is highly induced, as is gamma-aminobutyrate metabolism, particularly in bacteroids from early (7-day) nodules. To investigate bacteroid development, gene expression in bacteroids was analyzed at 7, 15, and 21 days postinoculation of peas. This revealed that bacterial rRNA isolated from pea, but not vetch, is extensively processed in mature bacteroids. In early development (7 days), there were large changes in the expression of regulators, exported and cell surface molecules, multidrug exporters, and heat and cold shock proteins. fix genes were induced early but continued to increase in mature bacteroids, while nif genes were induced strongly in older bacteroids. Mutation of 37 genes that were strongly upregulated in mature bacteroids revealed that none were essential for nitrogen fixation. However, screening of 3,072 mini-Tn5 mutants on peas revealed previously uncharacterized genes essential for nitrogen fixation. These encoded a potential magnesium transporter, an AAA domain protein, and proteins involved in cytochrome synthesis.

Characterization of a gamma-aminobutyric acid transport system of rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841

Spontaneous mutants of Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 were isolated that grow faster than the wild type on gamma-aminobutyric acid (GABA) as the sole carbon and nitrogen source. These strains (RU1736 and RU1816) have frameshift mutations (gtsR101 and gtsR102, respectively) in a GntR-type regulator (GtsR) that result in a high rate of constitutive GABA transport. Tn5 mutagenesis and quantitative reverse transcription-PCR showed that GstR regulates expression of a large operon (pRL100242 to pRL100252) on the Sym plasmid that is required for GABA uptake. An ABC transport system, GtsABCD (for GABA transport system) (pRL100248-51), of the spermidine/putrescine family is part of this operon. GtsA is a periplasmic binding protein, GtsB and GtsC are integral membrane proteins, and GtsD is an ATP-binding subunit. Expression of gtsABCD from a lacZ promoter confirmed that it alone is responsible for high rates of GABA transport, enabling rapid growth of strain 3841 on GABA. Gts transports open-chain compounds with four or five carbon atoms with carboxyl and amino groups at, or close to, opposite termini. However, aromatic compounds with similar spacing between carboxyl and amino groups are excellent inhibitors of GABA uptake so they may also be transported. In addition to the ABC transporter, the operon contains two putative mono-oxygenases, a putative hydrolase, a putative aldehyde dehydrogenase, and a succinate semialdehyde dehydrogenase. This suggests the operon may be involved in the transport and breakdown of a more complex precursor to GABA. Gts is not expressed in pea bacteroids, and gtsB mutants are unaltered in their symbiotic phenotype, suggesting that Bra is the only GABA transport system available for amino acid cycling.

In vivo expression technology (IVET) selection of genes of Rhizobium leguminosarum biovar viciae A34 expressed in the rhizosphere

IVET was used to identify genes that are specifically expressed in the rhizosphere of the pea-nodulating bacterium Rhizobium leguminosarum A34. A library of R. leguminosarum A34 cloned in the integration vector pIE1, with inserts upstream of a promoter-less purN:gfp:gusA, was conjugated into purN host RU2249 and recombined into the genome. After removal of colonies that expressed the reporter genes of the vector under laboratory conditions, the library was inoculated into a nonsterile pea rhizosphere. The key result is that 29 rhizosphere-induced loci were identified. Sequence analysis of these clones showed that a wide variety of R. leguminosarum A34 genes are expressed specifically in the rhizosphere including those encoding proteins involved in environmental sensing, control of gene expression, metabolic reactions and membrane transport. These genes are likely to be important for survival and colonization of the pea rhizosphere.

Characterization of the quaternary amine transporters of Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841

Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841 contains six putative quaternary ammonium transporters (Qat), of the ABC family. Qat6 was strongly induced by hyperosmosis although the solute transported was not identified. All six systems were induced by the quaternary amines choline and glycine betaine. It was confirmed by microarray analysis of the genome that pRL100079-83 (qat6) is the most strongly upregulated transport system under osmotic stress, although other transporters and 104 genes are more than threefold upregulated. A range of quaternary ammonium compounds were tested but all failed to improve growth of strain 3841 under hyperosmotic stress. One Qat system (gbcXWV) was induced 20-fold by glycine betaine and choline and a Tn5::gbcW mutant was severely impaired for both transport and growth on these compounds, demonstrating that it is the principal system for their use as carbon and nitrogen sources. It transports glycine betaine and choline with a high affinity (apparent K-m, 168 and 294 nM, respectively).

Thiamine is synthesized by a salvage pathway in Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain 3841

In the absence of added thiamine, Rhizobium leguminosarum bv. viciae strain 3841 does not grow in liquid medium and forms only "pin" colonies on agar plates, which contrasts with the good growth of Sinorhizobium meliloti 1021, Mesorhizobium loti 303099, and Rhizobium etli CFN42. These last three organisms have thiCOGE genes, which are essential for de novo thiamine synthesis. While R. leguminosarum bv. viciae 3841 lacks thiCOGE, it does have thiMED. Mutation of thiM prevented formation of pin colonies on agar plates lacking added thiamine, suggesting thiamine intermediates are normally present. The putative functions of ThiM, ThiE, and ThiD are 4-methyl-5-(beta-hydroxyethyl) thiazole (THZ) kinase, thiamine phosphate pyrophosphorylase, and 4-amino-5-hydroxymethyl-2-methyl pyrimidine (HMP) kinase, respectively. This suggests that a salvage pathway operates in R. leguminosarum, and addition of HMP and THZ enabled growth at the same rate as that enabled by thiamine in strain 3841 but elicited no growth in the thiM mutant (RU2459). There is a putative thi box sequence immediately upstream of the thiM, and a gfp-mut3.1 fusion to it revealed the presence of a promoter that is strongly repressed by thiamine. Using fluorescent microscopy and quantitative reverse transcription-PCR, it was shown that thiM is expressed in the rhizosphere of vetch and pea plants, indicating limitation for thiamine. Pea plants infected by RU2459 were not impaired in nodulation or nitrogen fixation. However, colonization of the pea rhizosphere by the thiM mutant was impaired relative to that of the wild type. Overall, the results show that a thiamine salvage pathway operates to enable growth of Rhizobium leguminosarum in the rhizosphere, allowing its survival when thiamine is limiting.

The genome of Rhizobium leguminosarum has recognizable core and accessory components

Background: Rhizobium leguminosarum is an alpha-proteobacterial N-2-fixing symbiont of legumes that has been the subject of more than a thousand publications. Genes for the symbiotic interaction with plants are well studied, but the adaptations that allow survival and growth in the soil environment are poorly understood. We have sequenced the genome of R. leguminosarum biovar viciae strain 3841. Results: The 7.75 Mb genome comprises a circular chromosome and six circular plasmids, with 61% G+C overall. All three rRNA operons and 52 tRNA genes are on the chromosome; essential protein-encoding genes are largely chromosomal, but most functional classes occur on plasmids as well. Of the 7,263 protein-encoding genes, 2,056 had orthologs in each of three related genomes ( Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, and Mesorhizobium loti), and these genes were overrepresented in the chromosome and had above average G+C. Most supported the rRNA-based phylogeny, confirming A. tumefaciens to be the closest among these relatives, but 347 genes were incompatible with this phylogeny; these were scattered throughout the genome but were over-represented on the plasmids. An unexpectedly large number of genes were shared by all three rhizobia but were missing from A. tumefaciens. Conclusion: Overall, the genome can be considered to have two main components: a 'core', which is higher in G+C, is mostly chromosomal, is shared with related organisms, and has a consistent phylogeny; and an 'accessory' component, which is sporadic in distribution, lower in G+C, and located on the plasmids and chromosomal islands. The accessory genome has a different nucleotide composition from the core despite a long history of coexistence.

Regulation of L-alanine dehydrogenase in Rhizobium leguminosarum bv. viciae and its role in pea nodules

Alanine dehydrogenase (AldA) is the principal enzyme with which pea bacteroids synthesize alanine de novo. In free-living culture, AMA activity is induced by carboxylic acids (succinate, malate, and pyruvate), although the best inducer is alanine. Measurement of the intracellular concentration of alanine showed that AldA contributes to net alanine synthesis in laboratory cultures. Divergently transcribed from aldA is an AsnC type regulator, aldR. Mutation of aldR prevents induction of AldA activity. Plasmid-borne gusA fusions showed that aldR is required for transcription of both aldA and aldR; hence, AldR is autoregulatory. However, plasmid fusions containing the aldA-aldR intergenic region could apparently titrate out AldR, sometimes resulting in a complete loss of AldA enzyme activity. Therefore, integrated aldR::gusA and aldA::gusA fusions, as well as Northern blotting, were used to confirm the induction of aldA activity. Both aldA and aldR were expressed in the II/III interzone and zone III of pea nodules. Overexpression of aldA in bacteroids did not alter the ability of pea plants to fix nitrogen, as measured by acetylene reduction, but caused a large reduction in the size and dry weight of plants. This suggests that overexpression of aldA impairs the ability of bacteroids to donate fixed nitrogen that the plant can productively assimilate. We propose that the role of AldA may be to balance the alanine level for optimal functioning of bacteroid metabolism rather than to synthesize alanine as the sole product of N-2 reduction.

Arabinose and protocatechuate catabolism genes are important for growth of Rhizobium leguminosarum biovar viciae in the pea rhizosphere

Background and aims: To form nitrogen-fixing nodules on pea roots, Rhizobium leguminosarum biovar viciae must be competitive in the rhizosphere. Our aim was to identify genes important for rhizosphere fitness. Methods: Signature-tagged mutants were screened using microarrays to identify mutants reduced for growth in pea rhizospheres. Candidate mutants were assessed relative to controls for growth in minimal medium, growth in pea rhizospheres and for infection of peas in mixed inoculants. Mutated genes were identified by DNA sequencing and confirmed by transduction. Results: Of 5508 signature-tagged mutants, microarrays implicated 50 as having decreased rhizosphere fitness. Growth tests identified six mutants with rhizosphere-specific phenotypes. The mutation in one of the genes (araE) was in an arabinose catabolism operon and blocked growth on arabinose. The mutation in another gene (pcaM), encoding a predicted solute binding protein for protocatechuate and hydroxybenzoate uptake, decreased growth on protocatechuate. Both mutants were decreased for nodule infection competitiveness with mixed inoculants, but nodulated peas normally when inoculated alone. Other mutants with similar phenotypes had mutations predicted to affect secondary metabolism. Conclusions: Catabolism of arabinose and protocatechuate in the pea rhizosphere is important for competitiveness of R.l. viciae. Other genes predicted to be involved in secondary metabolism are also important.