Funktionelle Charakterisierung der Protein-Kinase CK2 in der Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch regulatorische T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) leisten durch ihre suppressiven Eigenschaften einen essenziellen Beitrag zur Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz. Sie verhindern schädliche Immunreaktionen gegen Autoantigene, kommensale Bakterien, sowie harmlose Nahrungsmittel-bestandteile. Gleichzeitig gewährleisten sie die Entwicklung effektiver Immunantworten gegen eindringende Pathogene, wie z.B. Parasiten, Bakterien und Viren. Damit haben Tregs direkten Einfluss auf das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz. Fehler in der suppressiven Funktionsweise von Tregs begünstigen daher auf der einen Seite die Entstehung zahlreicher autoimmuner Erkrankungen und Allergien. Auf der anderen Seite können Tregs Immunreaktionen bei chronischen Infektionen reduzieren, sowie die Entstehung effektiver Immunantworten gegen Tumore hemmen. Ihre Beteiligung an der Ätiologie all dieser Krankheiten macht Tregs zu einem bedeutenden potenziellen Zielobjekt, um diese Krankheiten effektiv zu therapieren. Die Erweiterung des Grundwissens um die molekularen Mechanismen der Treg-vermittelten Suppression ist daher ein notwendiger Schritt bei der Entwicklung Treg-basierter Theraphieansätze. 2003 konnte mit Foxp3 ein Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der maßgeblich die suppressiven Funktionen von Tregs steuert. Um weiteren Einblick in die der Suppression zugrundeliegenden Signalwege zu erhalten, wurde im Institut für Immunologie ein komparativer Kinomarray durchgeführt, anhand dessen die Casein Kinase 2 (CK2) als eine der aktivsten Kinasen in Tregs identifiziert wurde (Daten freundlicherweise von Prof. Dr. Tobias Bopp bereitgestellt). rnBasierend auf den Ergebnissen des Kinomarrays wurde in dieser Arbeit die Funktion der CK2 in Tregs untersucht. Dabei konnte in in vitro Experimenten die Treg-vermittelte Suppression durch den pharmakologische CK2 Inhibitor DMAT aufgehoben werden. Weil derartige Inhibitoren jedoch nicht absolut spezifisch die Aktivität nur einer Kinase supprimieren, wurden außerdem Mäuse mit konditionalem „knockout“ der CK2β Untereinheit spezifisch in Tregs gekreuzt (CK2βTreg-/- Mäuse). Die Analyse dieser Tiere offenbarte eine essenzielle Beteiligung der CK2 an den suppressiven Funktionen von Tregs. So entwickeln CK2βTreg-/- Mäuse mit zunehmendem Alter Splenomegalien und Lymphadenopathien, von denen in besonderem Maße die Mukosa-assoziierten Lymphknoten betroffen sind. Eine Analyse des Aktivierungsstatus der T-Zellen in den Tieren konnte zudem einen erhöhten Anteil sogenannter Effektor-Gedächtnis T-Zellen aufdecken, die charakteristische Merkmale eines Th2 Phänotyps zeigten. Erhöhte Titer des Antikörperisotyps IgE in den Seren von CK2βTreg-/- Mäusen suggerieren zusätzlich eine fehlerhafte Suppression speziell Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs. In Th2-vermittelten Asthma Experimenten in vivo konnte der Verdacht der fehlerhaften Kontrolle von Th2-Antwort bestätigt werden, wobei zusätzlich aufgedeckt wurde, dass bereits unbehandelte CK2βTreg-/- Mäuse Zeichen einer Entzündungsreaktion in der Lunge aufweisen. Bei der Suche nach den molekularen Ursachen der fehlerhaften Suppression Th2-vermittelter Immunantworten durch CK2β-defiziente Tregs konnten zwei mögliche Erklärungsansätze gefunden werden. Zum einen zeigen CK2β-defiziente Tregs eine verringerte Expression von Foxp3, was, in Analogie zu Ergebnissen der Gruppe von R. Flavell (Wang Y.Y. Nature. 445, 766-770 (2007)), zu einer Konversion von Tregs zu Th2 Zellen und damit zur Entstehung eines Th2-basierten, autoimmunen Phänotyps führt. Des Weiteren weisen CK2β-defiziente Tregs eine reduzierte Expression des Transkriptionsfaktors IRF4 auf, der in Tregs entscheidend für die Kontrolle Th2-basierter Immunreaktionen ist (Zheng Y. Nature. 19; 351-356 (2009)). Die dargelegten Ergebnisse identifizieren die CK2 damit als Kinase, die entscheidend an der Treg-vermittelten Suppression speziell Th2-basierter Immunantworten beteiligt ist. Demnach könnten pharmakologische CK2 Inhibitoren beispielsweise dazu eingesetzt werden, um die Treg-vermittelte Suppression im Rahmen chronischer Parasiten-Infektionen aufzuheben. Die in CK2βTreg-/- Mäusen beobachtete Prävalenz der Funktion der CK2 für Mukosa-assoziierte Organe stellt dabei einen zusätzlichen Vorteil dar, weil systemische Nebenwirkungen, die durch die Blockade der Treg-vermittelte Suppression entstehen, zumindest in nicht-Mukosa-assoziierten Geweben nicht zu erwarten sind.rn

Molekulare Mechanismen der Kontrolle von T-Helferzellen durch natürlich vorkommende CD4 +CD25 + regulatorische T-Zellen

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind in der Lage die Proliferation und Cytokin-Produktion konventioneller T-Zellen zu supprimieren. Obwohl ein entscheidender Mechanismus dieses Prozesses die Inhibition der Interleukin-2 Produktion ist, sind die beteiligten Moleküle weitestgehend unbekannt. Interessanterweise entwickeln NFATc2-, NFATc3-doppeldefiziente Mäuse (DKO Mäuse) schwerste Autoimmunerkrankungen, so dass im Rahmen dieser Arbeit die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 bei der Entstehung von CD4+CD25+ Tregs und der CD4+CD25+ Treg-vermittelten Suppression konventioneller T-Zellen untersucht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass zwar die Gesamtheit der peripheren CD4+CD25+ T-Zellen keinerlei suppressives Potential besitzt, eine Subpopulation dieser Zellpopulation, die sehr stark CD25 und GITR exprimiert (CD4+CD25++GITR++ T-Zellen), jedoch in der Lage ist kokultivierte konventionelle CD4+ T-Zellen in ihren Effektorfunktionen zu inhibieren. Allerdings ließen sich die konventionellen CD4+ T-Zellen aus DKO Mäusen nicht von CD4+CD25+ Tregs in ihrer Proliferation und Zytokinproduktion inhibieren. Es kann also abschließend gesagt werden, dass das Fehlen der Transkriptionsfaktoren NFATc2 und NFATc3 die Entstehung und Funktion von CD4+CD25+ Tregs nicht beeinflusst, jedoch konventionelle CD4+ T-Zellen resistent gegen eine CD4+CD25+ Treg-vermittelte Suppression werden lässt.

Der Einfluss von TGF-beta1 auf regulatorische T-Zellen in einem murinen Modell für Asthma

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von regulatorischen T-Zellen (Treg) auf die Pathogenese des Asthmas in einem murinen Modell zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Co-Expression von TGF-ß1 und IL-10 auf Treg notwendig ist, um im Tiermodell vor einer Atemwegs-Hyperreagibilität (AHR) zu schützen. Natürliche Treg konnten keinen Schutz vermitteln. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Schutz vor AHR durch TGF-ß1 über Empfänger T-Zellen vermittelt wird. Dabei reichte die alleinige Anwesenheit von TGF-ß1 nicht aus, vielmehr musste das Zytokin von Treg exprimiert werden. Ein Einfluss von TGF-ß1 überexprimierenden Treg auf die peribronchiale Entzündung konnte nicht festgestellt werden, wohingegen adoptiver Transfer von natürlichen Treg die Eosinophilen Anzahl in der Bronchiallavage signifikant verringern konnte. Dabei korrelierte die Eosinophilie mit den IL-5 Spiegeln in der Bronchiallavage. In dieser Arbeit konnte also eine Entkopplung der Mechanismen von AHR und Entzündung festgestellt werden. Die weitere Aufklärung der Mechanismen der Suppression der AHR durch TGF-ß1 und IL-10 produzierende Treg könnte daher die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze bei Atemwegserkrankungen ermöglichen.

Humane CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen: Charakterisierung von Subpopulationen und Identifizierung eines Markers

CD4+CD25+ regulatorische T-Zellen (CD4+CD25+ Tregs) sind essentiell an der Homöostase des Immunsystems beteiligt, indem sie eine antigenspezifische Toleranzinduktion in der Peripherie vermitteln und vor der Entstehung von Autoimmunerkrankungen schützen. Darüber hinaus sind diese Zellen wesentlich an der Kontrolle von Allergien, Infektionen und Tumoren beteiligt. Innerhalb dieser Arbeit konnten zwei bisher unbekannte Subpopulationen humaner CD4+CD25+ Tregs, isoliert aus dem peripheren Blut des Menschen, nachgewiesen werden. Diese Subpopulationen unterscheiden sich in ihrer Oberflächenexpression und exprimieren die Integrine a4b1 bzw. a4b7. Beide Treg-Subpopulationen supprimieren kokultivierte CD4+ T-Helferzellen Zellkontakt-abhängig und konvertieren gleichzeitig einen Teil dieser Zellen in sekundäre Suppressorzellen (iTregs). a4b1+ Tregs induzieren TGF-β-sezernierende iTregs, a4b7+ Tregs führen zur Bildung von IL-10-produzierenden iTregs. Differentielle Proteomanalysen humaner CD4+CD25+ Tregs, im Vergleich zu CD4+CD25- T-Helferzellen, führten zur Identifizierung von Galectin-10 als Markerprotein, das fast ausschließlich von CD4+CD25+ Tregs und nicht von CD4+ T-Helferzellen exprimiert wird. Galectin-10 ist ein intrazelluläres Protein, das essentiell für die funktionellen Eigenschaften humaner CD4+CD25+ Tregs ist. Die Blockade der Galectin-10-Bildung in den CD4+CD25+ Tregs durch RNA-Interferenz führte zu wesentlichen funktionellen Veränderungen der CD4+CD25+ Tregs. In Abwesenheit von Galectin-10 verlieren humane CD4+CD25+ Tregs ihre suppressiven Eigenschaften und ihren anergischen Phänotyp. Somit konnte mit Galectin-10 erstmals ein spezifischer Marker für humane CD4+CD25+ Tregs identifiziert werden, der wesentlich für den funktionellen Phänotyp dieser Regulatoren peripherer T-Zelltoleranz ist.

Einfluss des Treg-Aktivierungsmarkers GARP auf die Differenzierung und Funktion von T-Zellen

CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen (Treg) spielen eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung von schädlichen Immunreaktionen. Da aktivierte CD4+ T-Helferzellen auch CD25 und FoxP3 exprimieren, können diese nicht als spezifische Marker zur Identifikation von Treg verwendet werden. Die Analyse der Membranproteinexpression beider Populationen führte zur Identifikation von GARP (glycoprotein A repetitions predominant) als spezifischer Marker auf aktivierten Treg. GARP bindet LAP und TGF-beta, welches für die Unterdrückung von entzündlichen T-Zellantworten von Bedeutung ist. Um die Funktion von GARP unabhängig von Treg zu untersuchen, wurde ein lösliches GARP Protein (sGARP) synthetisiert und sein Effekt auf die Aktivierung und Differenzierung von humanen T-Zellen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass sGARP die Proliferation von naiven CD4+ T-Zellen supprimiert und zu einer Phosphorylierung von SMAD2/3 sowie zu der Induktion von FoxP3 führt. Zusätzlich inhibiert sGARP die Produktion von Effektorzytokinen wie IL-2 und IFN-gamma. Die Stimulation von naiven CD4+ T-Zellen mit sGARP induziert die Differenzierung zu Treg, welche in Kokultur die Aktivierung von T-Effektorzellen supprimieren. Die Wirkung war vergleichbar in naiven CD4+ und ruhenden CD4+CD45RA+ T-Zellen, konnte aber in differenzierten CD4+CD45RO+ T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Die Induktion von FoxP3 und die Phosphorylierung von SMAD2/3 konnte durch eine Blockade des TGF-beta-Signalweges inhibiert werden. Dies lässt vermuten, dass die Funktion von sGARP zumindest teilweise von TGF-beta abhängig ist. Zusätzlich zu seiner passiven Rolle als TGF-beta-Transporter, induzierte sGARP die TGF-beta-Produktion in naiven T-Zellen und trägt so zum Mechanismus der infektiösen Toleranz bei. Des Weiteren fördert die Stimulation von sGARP in Anwesenheit von IL-6 und IL-23 die Differenzierung zu Th17 Zellen. rnNeben dem Einfluss von sGARP auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, supprimiert sGARP die Proliferation und Granzyme B-Expression in CD8+ T-Zellen. rnFür die Analyse der immunmodulatorischen Funktion von sGARP in vivo wurde ein Modell einer xenogenen GvHD (graft-versus-host disease) verwendet. Der Transfer von humanen PBMC in neugeborene, immundefiziente Rag2-/-gamma-chain-/--Mäuse führt zu einer letalen GvHD, welche durch die Applikation von humanen Treg dosisabhängig unterdrückt werden kann. In diesem Modell konnte die repetitive Gabe von sGARP, ohne zusätzliche Zugabe von Treg, ebenfalls die GvHD unterdrücken. Dies lässt auf einen synergistischen Effekt von sGARP und Treg bei der Suppression inflammatorischer T-Zellantworten schließen. rnZusammengefasst lassen die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von GARP in der Modulation der peripheren Toleranz folgern und zeigen sGARP als potentes Biological für die Behandlung von unerwünschten inflammatorischen Immunantworten.

Suppression des allergischen Asthmas durch regulatorische T-Zellen: Mechanismen und potenzielle therapeutische Ansätze

Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Prävalenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikamentöser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch für diese Erkrankung sind entzündliche Veränderungen in der Lunge, erhöhte Atemwegsüberempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen Fällen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anfälliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unschädlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im Körper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Großteil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erhöhter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaphänotypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erhöhte Mengen IFN-γ in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollständig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte natürlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- Mäuse konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erhöhte AHR induzieren. Während der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveolären Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschränkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentzündung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekundäre Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle übertragen und führt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die Störung des intrazellulären cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verstärkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entzündung, korrelierend mit erhöhten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen äußerst limitiert und die Übertragbarkeit größerer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko während mehrtägiger In vitro-Expansion fragwürdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazität der allergenspezifischen nTregs deutlich erhöhte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu unterstützen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.

Untersuchungen zum Einfluss des malignen Melanoms auf die Frequenz und Funktion regulatorischer T-Zellen

Im Immunsystem spielen regulatorische T-Zellen (Treg) eine essentielle Rolle bei der Unterdrückung und Eindämmung von überschüssigen oder schädlichen Immunreaktionen. Ihre suppressiven Eigenschaften wirken aber auch bei Immune Escape Mechanismen von Tumoren mit und können den Erfolg von Tumorimmuntherapien deutlich mindern.rnIn dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die Frequenz verschiedener Treg Subpopulationen im peripheren Blut von gesunden Spendern und Melanompatienten in verschiedenen Stadien der Erkrankung verglichen werden. Dabei wurden Treg-Subpopulationen mit den Markerkombinationen CD4+CD25++, CD4+CD25+CD127low, CD4+CD25+HLA DR+, CD4+Foxp3+, CD4+Foxp3+CD25+, CD4+Foxp3+CD127low und CD4+Foxp3+HLA DR+ untersucht. Insbesondere bei den Subpopulationen, die durch die Expression von Foxp3 charakterisiert sind, konnten in Patienten im Spätstadium IV der Melanomerkrankung, verglichen mit Patienten im Stadium I-II oder gesunden Spendern, erhöhte Treg Frequenzen im peripheren Blut festgestellt werden. Diese Funde korrelierten mit der Beobachtung einer verminderten antigenspezifischen T Zellreaktivität in solchen Melanompatienten. Des Weiteren zeigte sich, dass eine DC basierte Tumorantigen-spezifische Immuntherapie bei einem Teil der behandelten Stadium IV Melanompatienten eine Abnahme der Treg Frequenzen im peripheren Blut zur Folge hatte. Dies korrelierte mit Beobachtungen aus vorangegangenen Studien unserer Arbeitsgruppe, bei denen sich zeigte, dass eine solche Immuntherapie die zuvor supprimierten T Zellantworten zumindest vorübergehend wiederherstellen kann. Bei Untersuchungen zur Expression des IL 1-Rezeptors-1 konnte dieser auf Proteinebene als verstärkt exprimierter Aktivierungsmarker auf Treg bestätigt werden. In Anwesenheit von IL-1 wird die Suppressorfunktion der Treg inhibiert. Eine Konversion von humanen Treg zu nicht suppressorischen TH-17-Zellen durch die Kostimulation mit IL 1 konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Vielmehr scheint die Induktion von IL 2 die entscheidende Wirkung von IL 1 auf humane Treg und Teff darzustellen.rn

Untersuchungen zur Regulation von T-Effektorzellen im peripheren Blut von MS-Patienten und humanisierten Mäusen mit einer induzierten autoimmunen Enzephalitis

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit des zentralen Nervensystems, bei der sich autoreaktive T-Effektorzellen der Kontrolle durch regulatorische T-Zellen (Treg) entziehen. Innerhalb dieser Arbeit wurde gezeigt, dass T-Effektorzellen von MS-Patienten insensitiv gegenüber der Suppression durch Treg sind. Hervorgerufen wird diese Treg-Resistenz durch Interleukin-6 (IL-6). Die Inhibition des IL-6-Signalweges stellt die Treg-vermittelte Suppression der T-Effektorzellen wieder her. Es zeigte sich, dass die Bildung von IL-6 und die Expression des IL-6-Rezeptors in MS-Patienten in einer positiven Rückkopplungsschleife von IL-6 selbst induziert werden.rnZur Analyse humaner Immunantworten in vivo und deren Modulation durch humanspezifische Therapeutika wurden humanisierte Mausmodelle etabliert. Der adoptive Transfer humaner Immunzellen in immundefiziente Mäuse erlaubte die Untersuchung von T-Lymphozyten, die aus dem Blut von MS-Patienten isoliert wurden. Es zeigte sich, dass Treg-resistente T-Effektorzellen aus den MS-Patienten in den Tieren eine letale Graft-versus-Host-Erkrankung auslösten, die nicht durch aktivierte Treg therapiert werden konnte. Erst eine Behandlung mit dem humanspezifischen anti-IL-6-Antikörper Tocilizumab in vivo konnte die Erkrankung der Tiere deutlich abmildern.rnIm zweiten Modell wurden immundefiziente Mäuse mit humanen CD34+ Blutstammzellen immunologisch rekonstituiert. Diese Tiere entwickelten ein nahezu vollständig humanes Immunsystem. Die Immunisierung mit dem murinen Myelin-Oligodenrozyten-Glykoprotein löste in den humanisierten Mäusen eine MS-ähnliche Autoimmunität aus. Die Neuroinflammation wurde durch humane T- und B-Zellen vermittelt, korrelierte mit erhöhter IL-17-Produktion und führte zu einer IL-6-abhängigen Treg-Resistenz der T-Effektorzellen. Somit eignen sich die etablierten Modelle, um zukünftig die Wirksamkeit neuer Therapeutika zur Behandlung der MS präklinisch zu testen.rn

Regulatorische und supprimierte T-Zellen

Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind in der Lage die Proliferation und Cytokin-Produktion konventioneller T-Zellen zu supprimieren, wobei die beteiligten Moleküle weitestgehend unbekannt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden differentielle Analysen sowohl auf mRNA - als auch auf Proteinebene durchgeführt um Moleküle zu identifizieren, welche präferentiell in regulatorischen bzw. in supprimierten T-Zellen (Tsups) exprimiert werden. Der Transkriptionsfaktor Pur-alpha konnte als präferentiell in murinen Tsups exprimiert identifiziert werden. Die präferentielle Expression von Pur-alpha in murinen Tsups konnte durch quantitative PCR-Analysen bestätigt werden. In humanen Tregs konnte mittels „differentieller Proteom-Analyse“ das Lektin Galectin-10 als das am stärksten präferentiell exprimierte Protein identifiziert werden. Die differentielle Expression von Galectin-10 konnte sowohl auf mRNA-Ebene als auch mit Hilfe eines spezifischen Antiserums gegen Galectin-10 bestätigt werden. Zur Untersuchung einer möglichen Beteiligung von Galectin-10 am anergen Phänotyp sowie an den suppressiven Eigenschaften von Tregs wurde ein Galectin-10-Expressionskonstrukt generiert. Die Überexpression von Galectin-10 in konventionellen T-Zellen führte zur Apoptose der transfizierten Zellen. Die Überexpression von Galectin-10 in der humanen T-Zell-Linie „Jurkat“ konnte hingegen problemlos durchgeführt werden, führte aber nicht zur Vermittlung suppressiver Eigenschaften. Zum Nachweis einer Beteiligung von Galectin-10 an den funktionellen Eigenschaften regulatorischer T-Zellen werden in weiterführenden Versuchen momentan siRNA-Experimente etabliert, um die Galectin-10-Biosynthese in Tregs spezifisch zu unterdrücken.

Die Rolle regulatorischer T-Zellen im experimentellen allergischen Asthma

Im ersten Teil der Dissertation wurde in einem experimentellen Asthmamodell demonstriert, dass die Signaltransduktion über IL-6 das Gleichgewicht zwischen Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen durch verschiedene Rezeptorkomponenten kontrolliert. Hierbei zeigte sich, dass speziell das IL-6 Trans-Signaling über den sIL-6R die TH2 Cytokinproduktion steuert. Dagegen führt die Blockade des mIL-6R zur Expansion regulatorischer T-Zellen mit suppressiven Eigenschaften. Diese CD4+CD25+ Tregs induzieren außerdem IFN gamma produzierende CD4+ T-Zellen in der Lunge und verbessern daneben die AHR. Im Überblick konnte in der vorliegenden Dissertation demonstriert werden, dass IL-6 die Balance zwischen der Funktion von Effektorzellen und regulatorischen T-Zellen in der Lunge über unterschiedliche Wege kontrolliert, dem sIL-6R und dem mIL-6R. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die lokale Blockade der IL-2R alpha- und IL-2R beta-Kette untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass die Blockade der IL-2R beta-Kette zur Verbesserung der AHR als auch der Rekrutierung eosinophiler Granulozyten in den Atemwegen führt. Beide Blockaden führen zur Reduktion der TH2 Cytokine IL-4 und IL-5, wohingegen IL-13 nur nach Blockade der IL-2R beta-Kette vermindert sezerniert wird. In diesem Zusammenhang wurde auch die Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T-Zellen untersucht, wobei eine Induktion dieser Population in den Lymphknoten nach Blockade der IL-2R beta-Kette nachgewiesen werden konnte. Die Blockade der IL-2R beta-Kette wirkt sich positiv auf experimentelle Asthmastudien aus und stellt somit ein mögliches therapeutisches Potential dar, erfordert aber teilweise noch weitere Untersuchungen.

Einfluss prebiotischer Oligosaccharide und probiotischer Bakterien auf den Phänotyp und die Funktion dendritischer Zellen

Neben der Therapie allergischer Erkrankungen, wie dem allergischen Asthma oder der atopischen Dermatitis, nehmen präventive Maßnahmen zur Vermeidung einer Sensibilisierung einen immer höheren Stellenwert ein. Hierbei scheint der Einsatz von Pre- und Probiotika vielversprechend zu sein. rnrnIm Rahmen dieser Dissertation wurde der Einfluss von Pre- und Probiotika auf den Phänotyp und die Funktion von DCs untersucht. Hierzu wurden unreife DCs aus Vorläuferzellen im Knochenmark von Mäusen differenziert (BM-DCs). Nach Behandlung der Kulturen während der Differenzierung der BM-DCs mit neutrale Humanmilch-analoge Oligosaccharide-enthaltenden Präparationen (NOS-Präparationen) konnte ein Einfluss auf die Zellen nachgewiesen werden; die NOS-Präparationen sind in der Lage, die durch LPS induzierte Ausreifung der BM-DCs zu supprimieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die primärstimulatorische Kapazität LPS-stimulierter BM-DCs, die in Anwesenheit von NOS-Präparationen differenziert wurden, sowohl für allogene als auch für syngene T-Zellen signifikant vermindert war. Die Charakterisierung dieser T-Zellen ergab zwar eine verstärkte Expression des für regulatorische T-Zellen charakteristischen Transkriptionsfaktors FoxP3, auf funktioneller Ebene konnte jedoch keine Induktion von regulatorischen T-Zellen beobachtet werden; allerdings wurde in diesen T-Zellen eine Anergie induziert. Der Befund, dass verschiedene NOS-Präparationen unterschiedliche Wirkungen auf die Differenzierung von BM-DCs aufweisen, muss weitergehend untersucht werden. rnrnWeiterhin wurden im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen einer Kultivierung der BM-DCs mit den beiden probiotischen Bakterien Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) und Lactobacillus fermentum analysiert. Hier induzierte ein Kontakt unreifer BM-DCs mit den Bakterien eine Maturierung der Zellen. Das Potential zur Produktion von IL-10 konnte dabei nicht erhöht werden. Im Gegensatz dazu induzierte eine Supplementierung der Kulturen während der Differenzierungsphase der DCs konträre Effekte; die LGG-Gabe resultierte hier in einer unvollständigen Ausreifung der DCs nach LPS-Stimulus. Dies konnte auch auf funktioneller Ebene als stark vermindertes Potential zur T-Zellstimulation bestätigt werden. Inwieweit die Supplementierung mit LGG in tolerogenen DCs resultiert, welche Tregs induzieren können, muss weiter analysiert werden.

Identifizierung und Überexpression immunregulatorischer Moleküle in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften verändern. In dieser Doktorarbeit sollten zunächst mediatorinduzierte tolerogene Schlüsselmoleküle identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpräsentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Phänotyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Moleküle. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Moleküle für eine Überexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 überexprimierten, einen protolerogenen Phänotyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazelluläre Proteine oder Oberflächenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften überexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazität gekennzeichnet und veränderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen für ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits können diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erwägungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschränkt. Um diese Limitationen zu überwinden und translationale immunologische Experimente zu ermöglichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) Mäuse wurden mit humanen CD34+ hämatopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielfältige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den Mäusen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Phänotyp, welcher mit höchster Suppressivität assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalität unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten Mäusen nicht abgestoßen und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als mögliche Ursache hierfür zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erhöhten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell ermöglicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

Der Einfluss der T-Zellavidität und der TLR-vermittelten Aktivierung Dendritischer Zellen der Haut auf die Funktion zytotoxischer T-Zellen

Zytotoxische T-Zellen (CTL) vermitteln die effektive und gezielte Lyse Virus-infizierter und maligner Zellen. Um den Einfluss der T-Zellavidität auf die Immunodominanz von CTL-Antworten zu untersuchen, wurde ein neues Mausmodell mit zwei T-Zellrezeptor (TCR)-transgenen Stämmen etabliert. Die T-Zellen der beiden Stämme exprimieren denselben TCR in unterschiedlicher Dichte. Studien mit diesem Modell zeigten, dass bei identischen Vorläuferfrequenzen die hochaviden T-Zellen nach Immunisierung auf Kosten der niederaviden T-Zellen proliferieren. Sind die niederaviden T-Zellen jedoch im Überschuss vorhanden, so können sie die Antwort dominieren. Hieraus lässt sich schließen, dass die CTL Immunodominanz durch die Avidität und die Vorläuferfrequenz der T-Zellklone bestimmt wird. Darüber hinaus wurde ein neues transkutanes Immunisierungsverfahren (TCI) entwickelt. Die Applikation eines CTL Epitops zusammen mit dem synthetischen Toll-like Rezeptor 7 Liganden Imiquimod führt zur effizienten Aktivierung TCR-transgener CTLs. Eine in Wild-typ Mäusen generierte CTL-Antwort gegen das SIINFEKL Epitop aus dem Ovalbumin vermittelt die effiziente Lyse inokulierter Ovalbumin-transgener Thymomzellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass regulatorische T-Zellen die durch TCI vermittelte CTL Aktivierung inhibieren.

Induktion regulatorischer T-Zellen zur Inhibition allergenspezifischer Immunantworten im Mausmodell der Typ I-Allergie

Die Induktion regulatorischer T-Zellen (Treg) spielt im Zusammenhang mit der Kontrolle allergenspezifischer Reaktionen, insbesondere auch im Rahmen einer erfolgreichen Hyposensibilisierung mit hohen Allergendosen, eine zentrale Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Mechanismen der Rekrutierung allergenspezifischer Treg daher in einem Mausmodell untersucht, in dem analog zur spezifischen Immuntherapie (SIT) die repetitive Verabreichung von hohen Antigendosen einen IgE-spezifischen Suppressionsmechanismus aktiviert, während die Injektion niedriger Antigendosen eine potente IgE-Antwort induziert. Th1-Zellen sowie konventionelle CD4+CD25+ oder CD8+CD28- Treg konnten als Vermittlerpopulationen des suppressiven Effektes in hochdosig immunisierten Mäusen ausgeschlossen werden. Mittels Transferexperimenten wurden erstmals CD4-CD8- doppelt negative Treg als eine die IgE-Suppression vermittelnde Zellpopulation identifiziert. Desweiteren wurden DNA-Transferexperimente durchgeführt, mit dem Ziel, adaptive Treg zum Zwecke der Inhibition allergenspezifischer Immunreaktionen zu induzieren. Dazu wurden IL-10- bzw. TGF-ß-kodierende Plasmide (pCMV-IL-10, pCMV-TGF-ß) hergestellt und in Kombination mit einem Plasmid, welches das Modellallergen ß-Galaktosidase (ßGal) unter der Kontrolle des DC-spezifischen Fascin-Promotors (pFascin-ßGal) kodierte, Mäusen mit der Genpistole appliziert. Die Expression des Modellallergens in Verbindung mit der konstitutiven Produktion von immunsuppressiven Zytokinen sollte bei den mit den transfizierten DC interagierenden antigenspezifischen T-Zellen zu einer verstärkten Differenzierung von Treg führen. Die Experimente zeigten, dass die Koapplikation von IL-10-kodierenden Plasmiden eine Immunsuppression induziert, die sich in einer verminderten antigenspezifischen Antikörperproduktion, Zytokinproduktion und CTL-Induktion zeigt, die jedoch bei nachfolgender Sensibilisierung mit ßGal-Protein nicht aufrechterhalten werden kann. Dahingegen führte die Koapplikation von TGF-ß-kodierenden Plasmiden verbunden mit einer nachfolgenden Sensibilisierung zu einer leichten Inhibition der IgG1- und IgG2a-Produktion verglichen mit der Vakzinierung mit pFascin-ßGal allein. Dieser inhibitorische Effekt von pCMV-TGF-ß wurde interessanterweise nicht bereits nach der DNA-Immunisierung, sondern erst nach Sensibilisierung mit dem Protein beobachtet.