Aufbau eines flugzeuggetragenen Massenspektrometers zur Messung von HNO 3 und HONO und Quantifizierung der HNO 3-Aufnahme in Eispartikel in Kondensstreifen und Zirren

Im Zuge dieser Arbeit ist ein Massenspektrometer zur flugzeuggetragenen Messung von HNO3 und HONO auf dem neuen deutschen Forschungsflugzeug HALO aufgebaut worden (AIMS - Atmospheric chemical Ionization Mass Spectrometer). Die Ionisation der HNO3- und HONO-Moleküle erfolgt chemisch durch Reaktion mit SF5- -Ionen. Basierend auf den Ergebnissen von Laborversuchen wurden die Betriebsparameter optimiert, die Einzelkomponenten im HALO-Rack zusammengestellt und eine Einlassleitung entworfen, die Wandeffekte minimiert und Untergrundmessungen und HNO3-Kalibrationen im Flug ermöglicht. Die Empfindlichkeit der Messung von HNO3 und HONO wurde ebenso im Labor untersucht wie Interferenzen mit Wasserdampf und Ozon. Die HONO-Vergleichskampagne FIONA am Europäischen Photoreaktor (EUPHORE) in Valencia war die erste Messkampagne mit AIMS. Bei den offenen Vergleichsmessungen stimmten die von AIMS gemessenen HONO-Mischungsverhältnisse innerhalb +-20% mit dem Median von 9 weiteren HONO-Messungen überein. Die ersten flugzeuggetragenen Messungen mit AIMS werden im Verlauf der HALO-Missionen ML-CIRRUS und TACTS stattfinden. Neben dem Aufbau und der Charakterisierung von AIMS war die Analyse der Aufnahme von HNO3 in Eispartikel von Kondensstreifen und Zirren Gegenstand dieser Arbeit. Die Aufnahme von HNO3 in Kondensstreifeneispartikel wurde erstmals systematisch anhand einer Flugzeugmesskampagne (CIRRUS-III) untersucht. Während CIRRUS-III im November 2006 wurden Zirren und zufällig knapp 40 persistente Kondensstreifen über Deutschland und Nordeuropa beprobt. Die Messungen fanden in Höhen zwischen 10 und 11.5 km und bei Temperaturen zwischen 210 und 230 K statt. Die HNO3-Konzentration wurde mit Hilfe von NOy-Messungen bestimmt. Im Mittel war in Kondensstreifen ein größerer Anteil des Gesamt-HNO3 in den Eispartikeln gebunden (6 %) als in Zirren (3 %). Das Gasphasenäquivalent des eisgebundenen HNO3 betrug in Zirren durchschnittlich 6 pmol/mol, in Kondensstreifen 14 pmol/mol und in jungen Kondensstreifen (Alter<1 h) 21 pmol/mol. Das Mischungsverhältnis von HNO3 zu H2O in Eispartikeln war in Kondensstreifen leicht höher als in Zirren unter ähnlichen meteorologischen Bedingungen. Ursächlich für die höheren Werte in persistenten Kondensstreifen sind wahrscheinlich die hohen HNO3-Konzentrationen in den Abgasfahnen der Flugzeuge bei der Kondensstreifenbildung. Die beobachtete Abnahme des HNO3/H2O-Molverhältnisses mit zunehmendem Effektivdurchmesser der Eispartikel deutet an, dass die HNO3-Konzentrationen in Eispartikeln von jungen Kondensstreifen durch die Aufnahme von Abgas-HNO3 in die gefrierenden Aerosolpartikel bestimmt wird. Die Konzentrationen in älteren Kondensstreifen werden zunehmend durch das Vergraben von Umgebungs-HNO3 in wachsenden Eispartikeln kontrolliert. Diese Studie leistet einen Beitrag zu einem besseren Prozessverständnis der HNO3-Aufnahme in atmosphärische Eispartikel. Sie motiviert die Nutzung persistenter Kondensstreifen als atmosphärisches Labor zur Untersuchung der Spurengasaufnahme in wachsende Eispartikel.

Lokalisation und Quantifizierung von 4-Hydroxynonenal in der Kochlea des Meerschweinchens nach Applikation von Gentamicin

Einleitung und Literaturdiskussion: Gentamicin ist ein aus Bakterien gewonnenes Aminoglykosid-Antibiotikum, das seit vielen Jahren im klinischen Alltag zur Therapie von bakteriellen Infektionen und zur Behandlung des Morbus Ménière eingesetzt wird. Ein bedeutender, jedoch noch nicht vollständig verstandener, Pathomechanismus ist dabei die Entstehung von 4-HNE durch Lipid Peroxidation und die konsekutive Schädigung durch das gebildete Aldehyd. Ziel dieser Arbeit war es, die Beeinflussung der Expression von 4-HNE in sieben verschiedenen Regionen der Kochlea (SV, SL, CO, NF, LF, IDZ und SGZ) durch Gentamicin zu beschreiben und quantitativ zu ermitteln.rnMaterial und Methoden: Die Meerschweinchen wurden in vier Gruppen unterteilt: eine unbehandelte Kontrollgruppe und je eine Gruppe 1, 2 und 7 Tage nach Gentamicin-Applikation. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Kochleae den Tieren entnommen, das Gewebe fixiert, geschnitten und auf Objektträgern aufgebracht. Die Schnitte wurden mit 4-HNE-Antikörpern behandelt und die Immunreaktion mikroskopisch lokalisiert und zelluläre quantitative Unterschiede am Computer berechnet.rnErgebnisse: Die Auswertung der Daten ergab signifikante Anstiege der Immunreaktion auf 4-HNE von der Kontrollgruppe zu allen drei Behandlungsgruppen in vier der sieben untersuchten Regionen (Stria vascularis, Spirales Ligament, Cortisches Organ und Nervenfasern). In zwei Bereichen (Fibrozyten im Limbus und Interdentalzellen) kam es zwischen Kontrollgruppe und nur einer Behandlungsgruppe D (7d) zu einer signifikanten Erhöhung. Lediglich die Spiralganglionzellen erbrachten keine signifikanten Differenzen. Der Vergleich der Einzelwindungen erbrachte für die Stria vascularis, das Spirale Ligament, das Cortische Organ und die Nervenfasern signifikante Anstiege innerhalb der drei Windungen von der Kontrollgruppe zu den drei Behandlungsgruppen. Bei der Stria vascularis zeigte sich als einzige Region eine signifikant erhöhte Immunfärbung in allen drei Einzelwindungen von der Kontrollgruppe zu allen Behandlungsgruppen. Beim Vergleich der Gesamtwindungen ließ sich ausschließlich für die Region der Stria vascularis von der ersten zur dritten Windung ein Anstieg der Braunfärbung feststellen. Zudem konnten Korrelationen der Färbeintensitäten einerseits zwischen den beiden Regionen der Lateralen Wand und andererseits zwischen zwei Zelltypen im Limbus aufgezeigt werden.rnDiskussion: Die durch Gentamicin-gesteigerte 4-HNE-Expression kann durch genomische und nicht-genomische Prozesse hervorgerufen werden.

Species specific nitrogen isotope analysis by NanoSIMS

Der atmosphärische Kreislauf reaktiver Stickstoffverbindungen beschäftigt sowohl die Naturwissenschaftler als auch die Politik. Dies ist insbesondere darauf zurückzuführen, dass reaktive Stickoxide die Bildung von bodennahem Ozon kontrollieren. Reaktive Stickstoffverbindungen spielen darüber hinaus als gasförmige Vorläufer von Feinstaubpartikeln eine wichtige Rolle und der Transport von reaktivem Stickstoff über lange Distanzen verändert den biogeochemischen Kohlenstoffkreislauf des Planeten, indem er entlegene Ökosysteme mit Stickstoff düngt. Die Messungen von stabilen Stickstoffisotopenverhältnissen (15N/14N) bietet ein Hilfsmittel, welches es erlaubt, die Quellen von reaktiven Stickstoffverbindungen zu identifizieren und die am Stickstoffkeislauf beteiligten Reaktionen mithilfe ihrer reaktionsspezifischen Isotopenfraktionierung genauer zu untersuchen. rnIn dieser Doktorarbeit demonstriere ich, dass es möglich ist, mit Hilfe von Nano-Sekundärionenmassenspektrometrie (NanoSIMS) verschiedene stickstoffhaltige Verbindungen, die üblicherweise in atmosphärischen Feinstaubpartikeln vorkommen, mit einer räumlichen Auflösung von weniger als einem Mikrometer zu analysieren und zu identifizieren. Die Unterscheidung verschiedener stickstoffhaltiger Verbindungen erfolgt anhand der relativen Signalintensitäten der positiven und negativen Sekundärionensignale, die beobachtet werden, wenn die Feinstaubproben mit einem Cs+ oder O- Primärionenstrahl beschossen werden. Die Feinstaubproben können direkt auf dem Probenahmesubstrat in das Massenspektrometer eingeführt werden, ohne chemisch oder physikalisch aufbereited zu werden. Die Methode wurde Mithilfe von Nitrat, Nitrit, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Aminosären, biologischen Feinstaubproben (Pilzsporen) und Imidazol getestet. Ich habe gezeigt, dass NO2 Sekundärionen nur beim Beschuss von Nitrat und Nitrit (Salzen) mit positiven Primärionen entstehen, während NH4+ Sekundärionen nur beim Beschuss von Aminosäuren, Harnstoff und Ammoniumsalzen mit positiven Primärionen freigesetzt werden, nicht aber beim Beschuss biologischer Proben wie z.B. Pilzsporen. CN- Sekundärionen werden beim Beschuss aller stickstoffhaltigen Verbindungen mit positiven Primärionen beobachtet, da fast alle Proben oberflächennah mit Kohlenstoffspuren kontaminiert sind. Die relative Signalintensität der CN- Sekundärionen ist bei kohlenstoffhaltigen organischen Stickstoffverbindungen am höchsten.rnDarüber hinaus habe ich gezeigt, dass an reinen Nitratsalzproben (NaNO3 und KNO3), welche auf Goldfolien aufgebracht wurden speziesspezifische stabile Stickstoffisotopenverhältnisse mithilfe des 15N16O2- / 14N16O2- - Sekundärionenverhältnisses genau und richtig gemessen werden können. Die Messgenauigkeit auf Feldern mit einer Rastergröße von 5×5 µm2 wurde anhand von Langzeitmessungen an einem hausinternen NaNO3 Standard als ± 0.6 ‰ bestimmt. Die Differenz der matrixspezifischen instrumentellen Massenfraktionierung zwischen NaNO3 und KNO3 betrug 7.1 ± 0.9 ‰. 23Na12C2- Sekundärionen können eine ernst zu nehmende Interferenz darstellen wenn 15N16O2- Sekundärionen zur Messung des nitratspezifischen schweren Stickstoffs eingesetzt werden sollen und Natrium und Kohlenstoff im selben Feinstaubpartikel als interne Mischung vorliegt oder die natriumhaltige Probe auf einem kohlenstoffhaltigen Substrat abgelegt wurde. Selbst wenn, wie im Fall von KNO3, keine derartige Interferenz vorliegt, führt eine interne Mischung mit Kohlenstoff im selben Feinstaubpartikel zu einer matrixspezifischen instrumentellen Massenfraktionierung die mit der folgenden Gleichung beschrieben werden kann: 15Nbias = (101 ± 4) ∙ f − (101 ± 3) ‰, mit f = 14N16O2- / (14N16O2- + 12C14N-). rnWird das 12C15N- / 12C14N- Sekundärionenverhältnis zur Messung der stabilen Stickstoffisotopenzusammensetzung verwendet, beeinflusst die Probematrix die Messungsergebnisse nicht, auch wenn Stickstoff und Kohlenstoff in den Feinstaubpartikeln in variablen N/C–Verhältnissen vorliegen. Auch Interferenzen spielen keine Rolle. Um sicherzustellen, dass die Messung weiterhin spezifisch auf Nitratspezies eingeschränkt bleibt, kann eine 14N16O2- Maske bei der Datenauswertung verwendet werden. Werden die Proben auf einem kohlenstoffhaltigen, stickstofffreien Probennahmesubstrat gesammelt, erhöht dies die Signalintensität für reine Nitrat-Feinstaubpartikel.

Reaktive Polymere zur funktionellen Oberflächenbeschichtung

Ziel dieser Arbeit war die gezielte Modifizierung von Oberflächen mittels multifunktioneller Polymere, die ausgehend von Aktivesterpolymeren durch polymeranaloge Reaktionen unter milden Bedingungen hergestellt werden konnten. Dazu wurden die neuartigen Akivestermonomere Pentafluorphenylacrylat PFA und Pentafluorphenylmethacrylat PFMA hergestellt und polymerisiert. PFMA konnte unter RAFT-Bedingungen mittels Cumyldithiobenzoat bzw. 4-Cyano-4-((thiobenzoyl)sulfanyl)pentansäure kontrolliert polymerisiert werden. Durch den RAFT-Prozess wurden weiterhin reaktive Blockcopolymere aus PFMA und Methylmethacrylat, N Acryloylmorpholin bzw. N,N Diethylacrylamid synthetisiert. Zur Herstellung alpha, omega-endfunktionalisierter Polymere wurde PFA mit Dithiobenzoesäure-(4-dodecylbenzyl)ester polymerisiert und durch anschließende polymeranaloge Reaktionen zu thermoschaltbaren Polymeren mit unterschiedlichem LCST-Verhalten umgesetzt, die den Aufbau polymerunterstützter Lipiddoppelschichten ermöglichen. Ausgehend von poly(PFA) wurden oberflächenaktiven multifunktionellen Polymeren hergestellt und zur Oberflächenmodifizierung von anorganischen TiO2 Nanopartikeln, TiO2-Nanodrähten und MoS2-Nanopartikeln eingesetzt. Es konnten so lösliche fluoreszierende TiO2-Nanopartikel sowohl durch in situ- als auch post-Funktionalisierung hergestellt werden. Zudem konnte durch Verwendung eines multifunktionellen Polymers mit NTA-Einheiten das Enzym Silicatein auf TiO2-Nanodrähten immobilisert werden, das durch Biokristallisation Aggregate aus TiO2-Nanodrähten und Goldnanopartikeln erzeugte.

Uber Hippursaure-vergahrende Bakterien : ein Beitrag zur Kenntnis der Umsetzung der Stickstoffverbindungen im Dunger.

Thesis (doctoral)--Georg-August-Universitat, Gottingen.

Thermische Stabilität und Modifizierung der magnetischen Austauschanisotropie in Schichtsystemen

In dünnen Schichtsystemen, in denen es Grenzflächen zwischen antiferromagnetischen (AF) und ferromagnetischen (FM) Bereichen gibt, kann eine unidirektionale magnetische Anisotropie beobachtet werden: die Austauschanisotropie, auch "Exchange-Bias Effekt" genannt. Die Austauschanisotropie ist die Folge einer magnetischen Kopplung zwischen AF und FM. Makroskopisch äußert sich diese Anisotropie in einer Verschiebung der Magnetisierungskurve entlang der Magnetfeldachse. Anwendung findet die Austauschanisotropie z. B. in Spin-Valve Sensoren, deren Funktionsprinzip auf dem Riesen-Magnetowiderstand (engl. giant magnetoresistance, GMR) beruht. Die (thermische) Stabilität der Austauschanisotropie ist eine wichtige Voraussetzung für technische Anwendungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, durch welche Materialeigenschaften die Austauschanisotropie in Schichtsystemen mit antiferromagnetischem Nickeloxid (NiO) bestimmt wird. Die Schichten wurden durch (reaktive) Kathodenzerstäubung hergestellt. Durch Variation der Depositionsbedingungen wurden Zusammensetzung und Struktur der NiO-Schichten verändert. Die Ergebnisse systematischer Analysen dieser Größen werden aufgeführt. Der Vergleich dieser Materialanalysen mit magnetischen Messungen an NiO/NiFe Schichtsystemen fšuhrt zu dem Ergebnis, dass die chemische Zusammensetzung und die Struktur der NiO-Schichten die thermische Stabilität der Austauschanisotropie entscheidend beeinflussen. Es wird zusätzlich gezeigt, dass die Stabilität der Austauschanisotropie durch einen Temperprozess im Anschluss an die Herstellung der Schichtsysteme entscheidend verbessert werden kann. Thermisch aktivierte, magnetische Relaxationsprozesse können außerdem zur Erhöhung der Austauschanisotropie führen. Des Weiteren werden zwei neuartige Methoden zur Modifizierung der Austauschanisotropie vorgestellt. Dabei wird gezeigt, dass durch die Bestrahlung der Schichtsysteme mit Helium-Ionen die magnetischen Eigenschaften der Schichtsysteme gezielt verändert und optimiert werden können. Der Einfluss der Ionenbestrahlung auf die Austauschanisotropie in NiO/NiFe Schichtsystemen und auf den Magnetowiderstand in FeMn basierten Spin-Valves steht dabei im Vordergrund der experimentellen Untersuchungen. Eine weitere Möglichkeit zur Modifizierung der Austauschanisotropie ist die Bestrahlung der Schichtsysteme mit kurzen Laserpulsen. Durch einen thermomagnetischen Prozess kann die Austauschanisotropie lokal verändert werden. Experimentelle Ergebnisse von diesem hier erstmals verwendeten Verfahren werden vorgestellt und interpretiert. Mit den beiden genannten Methoden ist es möglich, die Eigenschaften der Austauschanisotropie in Schichtsystemen nachträglich gezielt zu modifizieren.

Einfluß endogener und exogener Faktoren auf Bildung und Reparatur oxidativer DNA-Schäden

Für die Krebsentstehung sind nach heutigen Vorstellungen Mutationen in bestimmten Genen somatischer Zellen verantwortlich, die ihrerseits durch chemische Modifikationen der DNA (DNA-Schäden) verursacht werden. Von besonderem Interesse als DNA-schädigende Agentien sind reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die endogen - wie z.B. in der Lipidperoxidation oder mitochondrialen Atmungskette - oder exogen - z.B. durch Arzneimittel oder andere aus der Umwelt stammende Chemikalien - gebildet werden können. Dem Schutz der DNA vor dieser Schädigung und ihren Folgen dienen antioxidative Systeme und DNA-Reparatur, deren Effizienz von verschiedenen Genen der Zelle abhängig ist. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses bestimmter Faktoren auf die Bildung, Inhibierung (antioxidative Wirkung) und Reparatur oxidativer DNA-Schäden. Als Beispiel für exogene Stoffe, die zur Bildung oxidativer DNA-Schäden führen, wurden die Gyrasehemmer Ofloxacin und Norfloxacin nach Bestrahlung mit UV-360 untersucht. Unter Verwendung spezifischer DNA-Reparatur-endonukleasen als Sonden (Fpg-Protein, Endonuklease III, Endonuklease IV, Exonuklease III, T4 Endonuklease V) wurden spezifisch DNA-Modifikationen an zellfreier und zellulärer DNA quantifiziert. Es zeigte sich, daß es sich im Falle des Ofloxacins bei der ultimal mit der DNA reagierenden reaktiven Spezies um Hydroxylradikale handelt, während durch Norfloxacin Singulettsauerstoff entsteht. Durch Zusatz verschiedener Antioxidantien konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Im Gegensatz zu Hydroxylradikalen ist über die DNA-Schäden und Mutationen durch Alkoxyl-Radikale, die endogen bei der Lipidperoxidation entstehen, nichts bekannt. Die Substanz BCBT ([4-[(tert-Butyldioxy)carbonyl]benzyl]-triethyl-ammonium-chlorid) generiert Alkoxyl-Radikale. BCBT + UV-360 induzierte vorwiegend Fpg-sensitive Modifikationen, die durch Bestimmung mittels HPLC/ECD zu 83 ± 18% als 8-Hydroxyguanin identifiziert wurden. Der Vergleich des Einflusses der Zusätze tert-Butanol und Natriumazid auf die Schädigung mit BCBT mit anderen reaktiven Spezies zeigte klar, daß die Schädigung hier über Alkoxyl-Radikale verläuft. Die Analyse und Sequenzierung der durch BCBT induzierten Mutanten zeigte, daß vorwiegend GC->TA Transversionen gebildet werden, die auf 8-oxoG zurückzuführen sind. Auf der Ebene der Antioxidantien wurde der Einfluß des zelleigenen Glutathions untersucht. Mit der Depletion des Glutathion-Gehalts durch Vorbehandlung mit L-Buthionin-SR-sulfoximin (BSO) ging eine Erhöhung des Steady-State-Spiegels in den untersuchten AS52 Zellen einher. Selen ist ein wichtiges Spurenelement und u.a. Bestandteil von Glutathionperoxidasen (GPx). Um die Bedeutung von Selen bei der oxidativer DNA-Modifikationen bzw. deren Inhibierung zu untersuchen, wurden Natriumselenit und Ebselen eingesetzt. Ab einer Konzentration von 50 µM trat durch Natriumselenit eine Erhöhung des Steady-State-Spiegels auf (prooxidativer Effekt). Parallel mit der oxidativen Schädigung der DNA ist eine Erhöhung des zellulären Gehalts an Glutathion feststellbar. Ebselen bedingte in Konzentrationen bis 200 µM keine Erhöhung des Steady-State-Spiegels oder des Gehalts an reduziertem Glutathion. Beide Substanzen waren in der Lage, die durch sichtbares Licht und UV-B-Strahlung induzierten Einzelstrangbrüche zu reduzieren. Mikrokerne, die durch Schädigung mit den Agentien Kaliumbromat, Ro 19-8022 + Licht und Wasserstoffperoxid entstanden, waren ebenso durch Natriumselenit und Ebselen reduzierbar. In dieser Arbeit konnte ferner gezeigt werden, daß p53 keinen Einfluß auf die Reparatur UV-induzierter Modifikationen (Nukleotidexzisionsreparatur) und die Reparatur Fpg-sensitiver Modifikationen (Basenexzisionsreparatur) hat.

Einfluß von Ernährung und Umweltfaktoren auf oxidative DNA-Schäden

Nach heutigen Erkenntnissen sind für die Krebsentstehung Mutationen in Genen somatischer Zellen verantwortlich, die vor allem durch chemische Modifikationen der DNA (DNA-Schäden) hervorgerufen werden. Als DNA-schädigende Agentien sind besonders reaktive Sauerstoffspezies (ROS) von Bedeutung, die sowohl endogen, z.B. in der Lipidperoxidation und der mitochondrialen Atmungskette, als auch exogen, z.B. durch Xenobiotika und Strahlung, entstehen können. Der stets in jeder Zelle vorhandene Untergrundspiegel an DNA-Modifikationen ergibt sich aus dem Gleichgewicht zwischen Schadensbildung und den zellulären antioxidativen Schutz- und den Reparaturmechanismen. Ziel dieser Arbeit war, die Beeinflussung oxidativer DNA-Schäden durch verschiedene, vom Menschen zumeist oral aufgenommene Stoffe (Ascorbinsäure, Derivat des Carazostatin (MMPDCD), Eicosapentaensäure (EPA) und Ethanol) unter Bedingungen ohne weitere exogene Schädigung und unter zusätzlich induziertem oxidativem Stress zu untersuchen. Zur Induktion von oxidativen Stress wurden AS52-Zellen (CHO-Zellen) mit UVB, sichtbarem Licht oder sichtbarem Licht und Photosensibilisator bestrahlt. Die Bestimmung der oxidativen DNA-Schäden in den Zellen (AS52 oder humane Lymphozyten) erfolgte mit Hilfe der Alkalischen Elution, wobei als Sonde das Fpg-Protein, eine DNA-Reparaturendonuklease, die vor allem 8-Hydroxyguanin erkennt, verwendet wurde. Darüberhinaus wurde der Einfluß der jeweiligen Vorbehandlung auf die Bildung von Mikrokernen und auch deren Zytotoxizität untersucht. Außerdem lag ein besonderes Augenmerk auch auf Untersuchungen von Effekten in humanen Lymphozyten in vivo.Bei den Untersuchungen an kultivierten Säugerzellen zeigte sich bei keiner Substanz in dem untersuchten Konzentrationsbereich ein Einfluß auf oxidative DNA-Schäden. Lediglich bei MMPDCD war ein geringer, protektiver Effekt zu erkennen, der abhängig von der eingesetzten Konzentration war. Dagegen konnte die Induktion von Mikrokernen sowohl durch Präinkubation mit Vitamin C, EPA als auch mit MMPDCD effektiv verhindert werden, obwohl sie z.T. die spontane Mikrokernrate erhöhten. In den in vivo Studien hatte weder eine akute Gabe von Vitamin C noch eine dreimonatige Supplementation mit EPA einen Einfluß auf die Untergrundspiegel oxidativer DNA-Schäden in humanen Lymphozyten. Bei der Studie zum Einfluß von chronischem Alkoholmißbrauch auf oxidative DNA-Schäden in Lymphozyten fand sich in der Patientengruppe ein signifikant erhöhter Spiegel an Schäden. Dieser erniedrigte sich nach erfolgter Entgiftung nicht auf das Niveau der Kontrollgruppe sondern erhöhte sich noch weiter.Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß Vitamin C und EPA zwar in vitro einen teilweise protektiven Effekt haben, sich dieser aber nicht in vivo finden läßt. Außerdem hat Ethanol eine schädigende Wirkung auf den DNA-Schaden in vivo, was dem vielfach propagierten protektiven Effekt alkoholischer Getränke widerspricht.

Einfluss von Stickstoffmonoxid, Hydroxylradikalen und Peroxynitrit auf DNA-Schäden, DNA-Reparatur und Mutationen

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht über welche Mechanismen und unter welchen Bedingungen Stickstoffmonoxid (NO) und verwandte reaktive Spezies wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale zur Krebsentstehung beitragen können. NO führte an zellfreier DNA kaum zu oxidativen DNA-Schäden. Peroxynitrit, generiert aus 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1), induzierte neben Einzel-strangbrüchen und AP-Läsionen vor allem oxidierte Purinmodifikationen (50 % 8-Hydroxyguanin (8-oxoG)). Hydroxylradikale, freigesetzt aus 4-Hydroxypyridinthion, induzierten neben Einzelstrangbrüchen und AP-Läsionen oxidierte Pyrimidinmodifikationen in der DNA. Nach Transformation und Replikation der geschädigten DNA in E. coli DT-2 wurden überwiegend GC nach AT Transitionen (Hydroxylradikalschädigung), wahrscheinlich verursacht durch das in der DNA induzierte 5-Hydroxycytidin, bzw. GC nach TA Transversionen (Peroxynitrit), verursacht durch das induzierte 8-oxoG, detektiert. In Zellkulturexperimenten führte endogenes NO, freigesetzt von B6-INOS-Zellen (8µM) nicht zu einem Anstieg der Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden, hatte keinen Einfluss auf deren Induzierbarkeit und Reparatur, die Zellpro-liferation und den Glutathionspiegel, schützte jedoch vor der Induktion von Einzelstrangbrüchen und Mikrokernen durch Wasserstoffperoxid. Exogenes NO, freigesetzt durch den Zerfall von Dipropylentriamin-NONOat, hemmte in Konzentrationen ab 0,5 mM spezifisch die Reparatur oxidativer DNA-Schäden, nicht jedoch die von Pyrimidindimeren, AP-Läsionen und Einzelstrangbrüchen,und führte in Konzentrationen > 1 mM zu einer Induktion von DNA-Schäden in den B6-Mausfibroblasten. Dabei ähnelte das induzierte Schadensprofil sehr dem von SIN-1.

Charakterisierung von Tumorantigenen des kutanen T-Zell Lymphoms

Immuntherapien stellen basierend auf gut charakterisierten, tumorspezifischen Antigenen ein vielversprechendes Konzept in der Tumor-Therapie dar. Für das kutane T-Zell Lymphom (CTCL) sind bislang nur wenige tumorassoziierte Antigene bekannt. In dieser Arbeit konnten ein mögliches Onkogen (PAR-3ta), ein weiteres, putativ Virus-induziertes Antigen (se57-1), neue Antigene und ihre Splicing-Varianten (se70-2, cTAGE-1/2, cTAGE-5), sowie lymphozytenspezifische Differenzierungsantigene (se20-10-Familie) für das CTCL gefunden werden. Auf Grund des Cancer-Testis spezifischen Expressionsprofils kommen die Antigene cTAGE-1 (46% CTCL-Expression), cTAGE-1B (31%) und cTAGE-5A (44%) für eine CTCL-Immuntherapie in Frage. Einige bekannte, spezifische Tumorantigene konnten auch im CTCL nachgewiesen werden: MAGE-A9 (21%), GAGE 3-7b (46%) und MUC-1 (44%). Die Immunogenität konnte mittels der SEREX-Technologie durch reaktive Antikörper gegen rekombinantes MAGE-A9 in 22% der getesteten CTCL-Seren, gegen GAGE in 16% und gegen cTAGE-5A in 15% bewiesen werden. Die cTAGE-mRNAs bilden eine neue Cancer-Testis Antigenfamilie. Die Multigenfamilie ist durch Retrotransposition eines aktiven Gens (cTAGE-5) entstanden, wobei 7 aktive, transkribierte und 7 nicht transkribierte Pseudogene unterschieden werden müssen. Die aktiven Gene cTAGE-1, cTAGE-1B und cTAGE-5A werden tumorspezifisch aus den Chromosomen 18p11.2 und 14 gespliced. Die Testis-CTCL spezifischen mRNAs können häufig auch in anderen Tumoren gefunden werden. Die Antigene cTAGE-1, cTAGE-5, MAGE-A9 und GAGE 3-7b gehören zu den ersten spezifischen Zielstrukturen des CTCLs, die somit für mögliche Immuntherapien in Betracht kommen.

Bedeutung endogener und exogener Quellen reaktiver Sauerstoffspezies für die Entstehung des malignen Melanoms

Bedeutung endogener und exogener Quellen reaktiver Sauerstoffspezies für die Entstehung des malignen Melanoms Um zu überprüfen, ob reaktive Sauerstoffspezies (ROS) an der Entstehung des malignen Melanoms ursächlich beteiligt sind, wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Mitochondrien als endogener und Licht als exogener ROS-Quelle untersucht.Nach Bestrahlung mit Licht (Halogenlampe 1000 W, 1125 kJ/m² zwischen 400-800 nm) reagierten M8,99-Melanomzellen sensitiver mit der Bildung oxidativer DNA-Basenmodifikationen als Hautfibroblasten des gleichen Melanompatienten. In einer anderen Melanomzelle (M2/02) war ein klarer Reparaturdefekt oxidativer DNA-Schäden zu beobachten. Bei viermaliger Bestrahlung mit Licht im Abstand von zwei Stunden (je 450 k/m²) nahm die Zahl induzierter oxidativer DNA-Modifikationen und Mikrokerne stetig zu. Durch Mehrfachbestrahlung mit Kantenfilter (? > 395 nm) konnte gezeigt werden, dass ein Teil der Mikrokerne im Bereich sichtbaren Lichts entsteht. Mitochondrien könnten als endogene Hauptquelle für ROS an der Entstehung oxidativer DNA-Modifikationen und des malignen Melanoms beteiligt sein. Die Abwesenheit der mitochondrialen Atmungskette bewirkte in dieser Arbeit eine nachhaltige Abnahme der intrazellulären ROS-Bildung bzw. ihre Stimulation durch mitochondriale Gifte eine starke Zunahme. Da in beiden Fällen kein Effekt auf die Zahl der oxidativen DNA-Modifikationen zu beobachten war, kann die mitochondriale ROS-Produktion nicht auf diesem Weg zur Melanom-Entstehung beitragen.

Identifizierung und Quantifizierung von sauren Markersubstanzen für troposphärisches sekundäres organisches Aerosol aus biogenen Kohlenwasserstoffen mittels Kapillar-HPLC-ESI-MS n

Sekundäres organisches Aerosol (SOA) ist ein wichtiger Bestandteil von atmosphärischen Aerosolpartikeln. Atmosphärische Aerosole sind bedeutsam, da sie das Klima über direkte (Streuung und Absorption von Strahlung) und indirekte (Wolken-Kondensationskeime) Effekte beeinflussen. Nach bisherigen Schätzungen ist die SOA-Bildung aus biogenen Kohlenwasserstoffen global weit wichtiger als die SOA-Bildung aus anthropogenen Kohlenwasserstoffen. Reaktive Kohlenwasserstoffe, die in großen Mengen von der Vegetation emittiert werden und als die wichtigsten Vorläufersubstanzen für biogenes SOA gelten, sind die Terpene. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die Quantifizierung von aciden Produkten der Terpen-Oxidation ermöglicht. Die Abscheidung des größenselektierten Aerosols (PM 2.5) erfolgte auf Quarzfilter, die unter Zuhilfenahme von Ultraschall mittels Methanol extrahiert wurden. Nach Aufkonzentrierung und Lösungsmittelwechsel auf Wasser sowie Standardaddition wurden die Proben mit einer Kapillar-HPLC-ESI-MSn-Methode analysiert. Das verwendete Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQ-DECA) bietet die Möglichkeit, Strukturaufklärung durch selektive Fragmentierung der Qasimolekülionen zu betreiben. Die Quantifizierung erfolgte teilweise im MS/MS-Modus, wodurch Selektivität und Nachweisgrenze verbessert werden konnten. Um Produkte der Terpen-Oxidation zu identifizieren, die nicht als Standards erhältlich waren, wurden Ozonolysexperimente durchgeführt. Dadurch gelang die Identifizierung einer Reihe von Oxidationsprodukten in Realproben. Neben schon bekannten Produkten der Terpen-Oxidation konnten einige Produkte erstmals in Realproben eindeutig als Produkte des α Pinens nachgewiesen werden. In den Proben der Ozonolyseexperimente konnten auch Produkte mit hohem Molekulargewicht (>300 u) nachgewiesen werden, die Ähnlichkeit zeigen zu den als Dimeren oder Polymeren in der Literatur bezeichneten Substanzen. Sie konnten jedoch nicht in Feldproben gefunden werden. Im Rahmen von 5 Messkampagnen in Deutschland und Finnland wurden Proben der atmosphärischen Partikelphase genommen. Die Quantifizierung von Produkten der Oxidation von α-Pinen, β-Pinen, 3-Caren, Sabinen und Limonen in diesen Proben ergab eine große zeitliche und örtliche Variationsbreite der Konzentrationen. Die Konzentration von Pinsäure bewegte sich beispielsweise zwischen etwa 0,4 und 21 ng/m³ während aller Messkampagnen. Es konnten stets Produkte verschiedener Terpene nachgewiesen werden. Produkte einiger Terpene eignen sich sogar als Markersubstanzen für verschiedene Pflanzenarten. Sabinen-Produkte wie Sabinsäure können als Marker für die Emissionen von Laubbäumen wie Buchen oder Birken verwendet werden, während Caren-Produkte wie Caronsäure als Marker für Nadelbäume, speziell Kiefern, verwendet werden können. Mit den quantifizierten Substanzen als Marker wurde unter zu Hilfenahme von Messungen des Gehaltes an organischem und elementarem Kohlenstoff im Aerosol der Anteil des sekundären organischen Aerosols (SOA) errechnet, der von der Ozonolyse der Terpene stammt. Erstaunlicherweise konnten nur 1% bis 8% des SOA auf die Ozonolyse der Terpene zurückgeführt werden. Dies steht im Gegensatz zu der bisherigen Meinung, dass die Ozonolyse der Terpene die wichtigste Quelle für biogenes SOA darstellt. Gründe für diese Diskrepanz werden in der Arbeit diskutiert. Um die atmosphärischen Prozesse der Bildung von SOA vollständig zu verstehen, müssen jedoch noch weitere Anstrengungen unternommen werden.

Application of reactive fluid transport modeling to hydrothermal systems

A one-dimensional multi-component reactive fluid transport algorithm, 1DREACT (Steefel, 1993) was used to investigate different fluid-rock interaction systems. A major short coming of mass transport calculations which include mineral reactions is that solid solutions occurring in many minerals are not treated adequately. Since many thermodynamic models of solid solutions are highly non-linear, this can seriously impact on the stability and efficiency of the solution algorithms used. Phase petrology community saw itself faced with a similar predicament 10 years ago. To improve performance and reliability, phase equilibrium calculations have been using pseudo compounds. The same approach is used here in the first, using the complex plagioclase solid solution as an example. Thermodynamic properties of a varying number of intermediate plagioclase phases were calculated using ideal molecular, Al-avoidance, and non-ideal mixing models. These different mixing models can easily be incorporated into the simulations without modification of the transport code. Simulation results show that as few as nine intermediate compositions are sufficient to characterize the diffusional profile between albite and anorthite. Hence this approach is very efficient, and can be used with little effort. A subsequent chapter reports the results of reactive fluid transport modeling designed to constrain the hydrothermal alteration of Paleoproterozoic sediments of the Southern Lake Superior region. Field observations reveal that quartz-pyrophyllite (or kaolinite) bearing assemblages have been transformed into muscovite-pyrophyllite-diaspore bearing assemblages due to action of fluids migrating along permeable flow channels. Fluid-rock interaction modeling with an initial qtz-prl assemblage and a K-rich fluid simulates the formation of observed mineralogical transformation. The bulk composition of the system evolves from an SiO2-rich one to an Al2O3+K2O-rich one. Simulations show that the fluid flow was up-temperature (e.g. recharge) and that fluid was K-rich. Pseudo compound approach to include solid solutions in reactive transport models was tested in modeling hydrothermal alteration of Icelandic basalts. Solid solutions of chlorites, amphiboles and plagioclase were included as the secondary mineral phases. Saline and fresh water compositions of geothermal fluids were used to investigate the effect of salinity on alteration. Fluid-rock interaction simulations produce the observed mineral transformations. They show that roughly the same alteration minerals are formed due to reactions with both types of fluid which is in agreement with the field observations. A final application is directed towards the remediation of nitrate rich groundwaters. Removal of excess nitrate from groundwater by pyrite oxidation was modeled using the reactive fluid transport algorithm. Model results show that, when a pyrite-bearing, permeable zone is placed in the flow path, nitrate concentration in infiltrating water can be significantly lowered, in agreement with proposals from the literature. This is due to nitrogen reduction. Several simulations investigate the efficiency of systems with different mineral reactive surface areas, reactive barrier zone widths, and flow rates to identify the optimum setup.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden.

In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common γ-chain deficient (NOD/SCID IL2Rγnull) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2Rγnull was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.