Combining HPLC-DAD and ICP-MS data for improved analysis of complex samples: Classification of the root samples from Cortex moutan

A combined data matrix consisting of high performance liquid chromatography–diode array detector (HPLC–DAD) and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) measurements of samples from the plant roots of the Cortex moutan (CM), produced much better classification and prediction results in comparison with those obtained from either of the individual data sets. The HPLC peaks (organic components) of the CM samples, and the ICP-MS measurements (trace metal elements) were investigated with the use of principal component analysis (PCA) and the linear discriminant analysis (LDA) methods of data analysis; essentially, qualitative results suggested that discrimination of the CM samples from three different provinces was possible with the combined matrix producing best results. Another three methods, K-nearest neighbor (KNN), back-propagation artificial neural network (BP-ANN) and least squares support vector machines (LS-SVM) were applied for the classification and prediction of the samples. Again, the combined data matrix analyzed by the KNN method produced best results (100% correct; prediction set data). Additionally, multiple linear regression (MLR) was utilized to explore any relationship between the organic constituents and the metal elements of the CM samples; the extracted linear regression equations showed that the essential metals as well as some metallic pollutants were related to the organic compounds on the basis of their concentrations

牡丹复合体的研究

牡丹复合体属芍药属(Paconia)牡丹组(Sect. Moutan)．原有6个种名，包括花壬 牡丹、名贵野生花卉紫斑牡丹，著名中药牡丹皮原植物，野生种类为我国特有，仅分 布在以秦岭为中心的较小区域．本研究从山西、陕西、河南、湖北、甘肃共采集14 个居群（包括复合体不同类型）．通过野外居群调查、样方研究，移栽实验，以及细 胞学观察、孢粉学观察分析、种子蛋白和DNA水平多样性的探索性的工作，并结合 聚类分析方法，对牡丹复合体进行了分类学和保护生物学两方面的研究，主要结论 为： 1．本复合体为多年生木本植物，生长缓慢，在天然状况下，从种子播种到开花结实长达7年．枝条通常具隔年开花习性．严格单花顶生，花期短(5-10天)．雄蕊先熟，以异花传粉为主（主要传粉者有甲虫和野蜂）．自交亲和，甲虫在传粉过程中常常破坏心皮和胚珠．胚珠败育比例很高，紫斑牡丹50%．其它类群达90%． 2．种子生物学特性研究，发现本复合体种子属正统种子，但种子衰变快．种子萌发时间长，一般的化学及物理处理对种子萌发无明显促进作用，种子具上胚轴休眠特性．打破休眠需要两个条件：一是胚根长足3 cm．二是10℃左右的低温或GA3处理，野生紫斑牡丹种子较大，复合体其它野生类群种子较小．野生牡丹的种子活力相当低，萌发时间更长． 3．样方的调查统计表明，稷山和永济两地区的矮牡丹株数一龄级分布规律是2—5年生个体最多，随年龄级的增加，个体数目减少．居群呈增长趋势．紫斑牡丹株数一龄级分布规律是青壮年时期个体数目多，幼年时间和老年时期个体数目少，居群呈衰退的趋势，这与其本身繁殖方式和人为破坏程度相关． 4．对13个居群花粉扫描电镜观察表明，本复合体紫斑牡丹(P. rockii)为粗网纹，网眼大，其它类群为细网纹、网眼小． 5．通过18个居群的核型分析并结合前人工作，发现本复合体染色体数目稳定2n =10．核型差别不大，野生类群和栽培品种间有一定分化，但总体上核型多样性比较贫乏．通过8个居群C带研究，发现带纹很少，但多样性很丰富．8个居群表现出7种带型． 6．种子蛋白和DNA水平多样性的初步研究，发现复合体具有较丰富的多样性．但多样性的分布对类群的划分帮助不大，有待进一步研究． 7．通过形态性状分析发现产自各地区矮牡丹、河南粉花类型、神农架红花类型具根出条现象，并以此为主要繁殖方式，紫斑牡丹无此现象．神农架红花类型植株矮小，复合体其它类群较高．产自各地区的矮牡丹和神农架红花类型为二回三出复叶．小叶数目多为9．矮牡丹顶生小叶具浅裂、中裂或深裂，裂片具齿，神农架红花类型顶生小叶仅具浅裂或齿（全缘）．河南粉花类型为二回羽状复叶．小叶数目12-15．紫斑类型叶为二回或三回羽状复叶、小叶数目15-40．小叶分裂方式分两种类型，秦岭西部居群以浅裂、全缘为主，东部居群以中裂或深裂为主，裂片具齿．神农架红花类型花为平展型、较小，其它地区花杯状、较大．花盘有二种类型．紫斑类群花盘黄色或白色．1／2-4／5包被心皮，心皮被稀疏长柔毛，其它类群花盘紫红色，全包心皮，心皮密被短硬毛．根据形态性状分析．并结合细胞学、孢粉学和地理分布研究，对复合体做如下处理：(l)把神农架红花类型做为新种处理P．quii Y.L．Pei et Hong．(2)保留P.rockii(S.G.Haw et L.A. Lanener)T.Hong ct J.J.Li和P.ostii T.Hong et J．X. Zhang．前者进一步分成二亚种：subsp. rockii和subsp. lanceolata Y.L．Pei et Hong（新亚种）．后者包括河南粉花类型，中药丹皮原植物．(3)保留P．suffruticosa Andr.种内分二亚种：subsp. suffruticosa和subsp. spontanea (Rehd．)S．G. Haw et L．A, Lauener. (4)废弃P.papaveracea Andr.和P.jishanensis T.Hong et W.Z.Zhao (5)P．yanancnsis T．Hong et M.R．Li作为存疑种处理． 8．通过上述研究对野生牡丹濒危原因加以分析，认为致濒原因主要是人为干扰和种子萌发和传粉特点等生物学特性造成，但以前者为主，建议应广泛开展各个层次多样性研究，为生物多样性保护利用奠定基础。

芍药属芍药组的变异与进化：形态、染色体和分子证据

芍药属Paeonia是芍药科Paeoniacea内唯一的一个属。包括大约35个种，间断性的分布于北温带地区。其内三个组分别是牡丹组(sect. Moutan)、北美芍药组(sect. Onaepia)和芍药组(sect. Paeonia)。芍药组是芍药属中最大，也是唯一具有染色体倍性变化的一个组，现有大约25个种。其中，大约半数的种是四倍体（2n＝20），主要分布于地中海地区。虽然有证据表明四倍体类群大多为异源起源，但芍药属内一致的核型、相似的形态和重叠的地理分布使得它们的起源和分类一直存在很大的争议。本研究利用了4个细胞核DNA片段（乙醇脱氢酶基因－Adh1和 Adh2;nrDNA的内转录间隔区－ITS;甘油－3磷酸乙酰转移酶基因－GPAT）和4个叶绿体DNA片段（matK基因;基因间隔区trnL-trnF、psbA-trnH和rps16－trnQ）对芍药组的网状进化进行部分重建。并在此基础上，对推测为杂交起源的P. anomala进行了形态学和细胞发生的研究。主要研究结果如下： 1． 芍药组的系统学 利用多个DNA分子标记(cpDNA: matK, rps16-trnQ; nrDNA: ITS, Adh1, Adh2)，芍药组的二倍体和四倍体类群的系统发育被部分重建。基于最大简约法、贝叶斯法和最大似然法的系统发育分析表明： (a) 除P. tenuifolia之外，所有地中海地区分布的二倍体类群构成一个单系分支。该支与亚洲分布的二倍体类群以及P. tenuifolia成并系关系。 (b) 核和叶绿体DNA系统发育树的不一致，以及ITS、Adh基因的多态性的分析，表明部分二倍体类群间和四倍体类群间都存在杂交事件。这些类群包括：中国新疆阿勒泰地区分布的二倍体种P. anomala和P. intermedia（杂种个体XJ053）;高加索地区分布的二倍体种P. tenuifolia和P. daurica（杂种个体H9933）;土耳其分布的四倍体种P. mascula和P. kesrouanensis（杂交个体在两个居群中检测到）。 (c) 不一致的核和叶绿体DNA系统发育树，以及Adh基因表现出的相同多态性模式进一步支持早先的推测，即四倍体类群P. arietina是异源四倍体。同时扩大的数据分析显示P. obovata近缘类群为其母系亲本，P. tenuifolia近缘类群为其父系亲本。此外，形态上具有一定分化的两个亚种P. arietina ssp. arietina和P. arietina ssp. parnassica是多次起源。 (d) 现今地中海分布类群的近缘种参与了四倍体种P. kesrouanensis 和P. coriacea，以及P. wittmanniana和P. mascula的物种形成。依据Adh序列种内的多态性，初步推测P. kesrouanensis 和P. coriacea可能是异源四倍体，其另一个亲本与P. arietina母系亲本近源。而P. wittmanniana和P. mascula可能是同源四倍体。 (e) P. saueri和P. peregrina的两个亲本类群分别与P. tenuifolia和现今地中海分布二倍体种的近缘类群。 (f) Adh1基因序列中近缘的重组类型暗示：四倍体种P. macrophylla和P. banatica很可能是同倍性杂种。 2． P. anomala的杂交起源和细胞发生 P. anomala新疆阿勒泰地区分布的居群核型第一次被报道。该地区分布的类群核型为2A型(核型公式：2n = 2x = 10 = 6m+2sm+2st)。减数分裂的观察统计显示：阿勒泰地区所有检测个体都是臂内倒位杂合子。基于断片大小以及不同个体染色体桥和/或断片出现率的差异，我们发现该类群臂内倒位存在多态性。荧光原位杂交（FISH）证实P. anomala共有8个18S rDNA位点，并且定位了一个倒位片段在3号染色体的短臂上。此外，高频率的棒状二价体和单价体，以及低的同源染色体的配对系数说明该类群同源染色体间存在分化。染色体结构杂合能够导致部分花粉败育，所有被检测个体的花粉败育率约为8.8 – 29.4%。 扩大的居群取样以及多基因(cpDNA: matK, psbA-trnH, rps16-trnQ, trnL-trnF; nrDNA: ITS, Adh1, Adh2, Gpat)的系统发育分析，进一步支持P. anomala杂交起源于P. veitchii 和P. lactiflora的近缘类群。cpDNA片段和核DNA片段（ITS、GPAT）基因树间的不一致，以及P. anomala Adh1和Adh2序列表现出的多态性都支持该类群杂交起源的推测。不过，表型分析显示P. anomala在形态上偏向于P. veitchii。 3． P. obovata Maxim.四倍体类群的起源 与原先基于形态性状的认识不同，P. obovata 四倍体类群并不是一个严格意义上的同源四倍体。它起源于二倍体P. obovata中国和日本分布的两个地理亚种之间的杂交。Adh2基因仅在中国分布二倍体居群的扩增失败支持这一推测。此外，Adh基因系统发育分析显示：间断性分布于中国中部和中国东北部的四倍体类群是独立起源。

芍药属两物种染色体结构变异杂合性研究

芍药属由大约35个灌木和多年生草本种组成，分为三个组：牡丹组(Sect. Moutan)、北美芍药组(Sect. Onaepia)和芍药组(Sect. Paeonia)。四川牡丹(Paeonia decomposita Handel-Mazzetti)和块根芍药(P. intermedia Meyer)分别隶属于牡丹组和芍药组。在该属的所有种中，染色体基数均为 x = 5，最短的五号染色体是端部着丝粒染色体，很容易辨认。 本论文研究了块根芍药三个居群22个个体和四川牡丹两个居群13个个体的减数分裂。减数分裂异常广泛发生，以至于发现所有被研究的个体都有数量不等的桥、断片和单价体。结果表明在中期I，块根芍药第一个居群平均每个小孢子母细胞有2.17个棒状二价体和2.7个环形二价体，第二个居群平均每个细胞有2.04个棒状二价体和2.86个环形二价体，第三个居群平均每个细胞有2.21个棒状二价体和2.71个环形二价体。而在四川牡丹中，第一个居群平均每个小孢子母细胞有2.09个棒状二价体和2.81个环形二价体，第二个居群平均每个细胞有1.85个棒状二价体和3.08个环形二价体。 块根芍药第一个居群的平均减数分裂染色体构型是2n = 10 = 0.25 I + 4.87 II，第二个居群是2n = 10 = 0.20 I + 4.90 II，第三个居群是2n = 10 = 0.17 I + 4.92 II，在该种的平均构型是2n = 10 = 0.21 I + 4.89 II。四川牡丹第一个居群的平均减数分裂染色体构型是2n = 10 = 0.21 I + 4.90 II，第二个居群是2n = 10 = 0.14 I + 4.93 II，在该种的平均构型是2n = 10 = 0.20 I + 4.90 II。在块根芍药中，不同个体的配对系数变化范围在69.5%和81.07%之间，在四川牡丹中在72.97%和81.37%之间。 在后期I和末期I，出现了染色体桥、断片、落后染色体、不等分离等异常现象。最明显的减数分裂异常是后期I桥/断片。尽管在不同的居群中桥/断片异常出现的频率有所变化(块根芍药居群一是26.03%，居群二是11.67%，居群三是13.39%;四川牡丹居群一是7.59%，居群二是9%)，但是这种异常出现在所有个体中(块根芍药平均为18.67%，四川牡丹平均为7.69%)。结果表明，所有的个体都是染色体臂内倒位结构杂合体，广泛存在于野生自然居群中，可能存在某些选择优势。而且，桥的出现频率和断片的大小在个体之间是变化的，这因此表明在这两个种中存在不同的倒位。然而，这两个种在野生居群中是如何维持染色体结构杂合的，其维持机制还有待于进一步阐明，还需要更进一步的证据。 该研究还揭示了块根芍药和四川牡丹这两个种具有共同的第五号染色体减数分裂异常：与长臂相比，短臂在遗传距离和物理距离之间存在巨大的背离。短臂的遗传距离，通过交叉频率计算出来，约是长臂的三十分之一（块根芍药）。然而，物理距离用臂的比率表示，大约是长臂的三分之一，物理距离是遗传距离的十倍。 在四川牡丹红心桥居群和其它居群之间，臂比存在微小的差异，而且在芍药属不同的种内也发现了存在差异。在四川牡丹中，环形二价体(两个臂形成交叉)和棒状二价体(仅一个臂形成交叉)的比率是1.94 : 98.06，而在块根芍药中是3.42 : 96.58。在这两个种中，棒状二价体大大多于环形二价体。在第五号染色体的短臂上可能存在某些“搭车效应”，这表明第五号染色体的短臂上存在高度永久杂合，导致短臂高度保守、极为稳定。这与芍药属古老的分布格局、进化历史长可能存在某些联系。四川牡丹第五号染色体的后期I倒位桥出现频率非常低，仅为0.51 - 3.47%，平均为1.43%。而且断片长度是变化的，其变化范围在1.7 - 10.8 µm之间。

药用牡丹资源与重金属污染问题的研究

我国牡丹资源丰富、药用历史悠久、药材出口量大。近年来国际上对进口植物药的重金属限量标准不断提高，已成为影响丹皮出口的最大贸易壁垒之一，严重阻碍了丹皮产业化进程。为了提高我国丹皮药材整体质量水平和国际竞争力，本试验探讨了不同产地、不同种质资源的丹皮与Cu、Cd、Pb、As四种重金属的关系，重点研究了两个代表性品种对重金属Cu的富集规律，分析了重金属Cu对牡丹生长、生理和药材品质的影响。实验中采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS ）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）为基本检测手段来分析样品中重金属元素的含量，从植物与重金属相互关系的角度对牡丹药用、花药兼用以及生态修复可行性等方面进行了系统研究。结果如下： 1. 丹皮重金属含量与牡丹种质资源和栽培环境关系密切。野生种中滇牡丹丹皮中Cu、Cd含量相对较高，多数野生种丹皮中Pb、As含量较栽培种偏高；铜陵产区的丹皮重金属含量明显高于其它产区，铜尾矿上栽培出产的丹皮重金属Cu含量明显超标，建议其改变种植模式，可以考虑丰富牡丹品种，开发生态旅游、观赏栽培。 2. 综合比较同一地块的7个常用药用品种发现，‘JPH’和‘CKL’品种对重金属富集能力相对较弱。‘JPH’是传统的优良观赏品种，适宜花药兼用；结合前期研究的结果‘CKL’药效成分含量相对较高，药用价值较高，适宜药用栽培。 3. 对药用牡丹品种‘凤丹’和‘建始粉’外施不同浓度CuSO4溶液处理后发现，丹皮中重金属富集量与外施重金属浓度成显著正相关。当外施Cu 浓度超过150mg/kg 时，两个品种的丹皮中Cu含量均已超标。 4. 重金属Cu对牡丹生长的影响效应与重金属浓度和植物体自身部位有关。当外施Cu浓度小于600mg/kg 时，对牡丹生长有一定的促进作用，主要表现在地上部分；超过600mg/kg 时，对牡丹生长有抑制作用，随着浓度增大，毒害症状愈加明显。地下部主要表现出受抑制作用，抑制效应随外施浓度增大而加重。 5. 牡丹通过自身的生理生化调节机制抵抗Cu胁迫对细胞造成的氧化伤害：低浓度Cu可以刺激抗氧化酶系统SOD和POD 活性升高，高浓度下SOD和 POD活性则显著降低。相同处理条件下‘凤丹’品种的抗铜性要高于‘建始粉’。 6. 本试验未发现外施Cu处理对丹皮中药效成分丹皮酚、芍药苷产生影响。 7. ‘凤丹’及‘建始粉’根系铜富集质量分数均达到超富集植物的要求，因此牡丹可能在重金属Cu污染的环境修复方面存在巨大潜力。