海洋小球藻Chlorella sp.甘油脂及脂肪酸、光合色素特征的研究

海洋微藻是海洋生态系统中最主要的初级生产者，也是海洋生物资源的重要来源。许多海洋微藻富含对人体具有重要的生理作用与保健功能的长链多不饱和脂肪酸，因此，筛选富含EPA、DHA等长链多不饱和脂肪酸的微藻和利用人工培养方法提高这些脂肪酸的产量是当前海洋生物学研究领域的热点之一。在本研究中，我们对被中科院海洋所定名为“Chlorella sp”（编号为1061）的一种海洋微藻的化学分类、甘油脂及其脂肪酸组成和外源葡萄糖和抗氧化剂（硫代硫酸钠）对这种微藻的脂肪酸含量的影响进行了研究，取得了以下主要结果。 海洋微藻是我固海水养殖中广泛使用的优良饵料藻。脂类物质是微藻最重要的营养指标之一，在本研究中，我们首先分析了被中科院海洋所定名为“Chlorellasp”的海洋微藻中的甘油脂及其脂肪酸种类和组成特点。结果表明，Chlorella sp.中的非极性脂主要为三脂酰甘油，极性甘油脂有10种。其中，一般培养条件下（温度23℃：光照，周期L/D14:10，强度60umolm-2-S-l）三脂酰甘油约占总脂的31 mol%，极性甘油脂约占总脂的69 rriol%。10种极性甘油脂是单半乳糖甘油二脂( monogalactosyldiacylglycerol． MGDG)、 双半乳糖甘油二脂( diagalactosyldiacylglycerol ， DGDG)、 硫代异鼠李糖甘油二脂( sulfoquinovosyldiacylglycerol，SQDG)、磷脂酰甘油(phosphatatidylglycerol，PG)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰胆碱( phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、磷脂酰丝氨醴(phosphatidylserine，Ps)、l，2-二酰基甘油-0-4，．（ⅣMⅣ-三甲基）高丝氨酸（diacylglyceryltrimethylhomoserine，DGTS）以及一种未能完全肯定，但可能是一中氯硫脂( chlorosulfolipid，CSL)。其中MGDG、DGDG、SQDG和PG是构成光合膜的主要成分，也是Chlorella sp中的主要极性脂。甜菜碱脂DGTS和磷脂PC是构成非光合膜的主要组分。Chlorella sp.中的主要脂肪酸为C16:0、C16:1耜C20：5（EPA)，后者主要存在于MGDG、DGDG和DGTS中，而三脂酰甘油也含有接近7%的EPA。 海洋微藻Chlorella sp.1061虽然被归属到绿藻纲绿藻目小球藻属，但是我们的研究表明，其色素、极性脂皮其脂肪酸组成与其它小球藻属藻类存在这很大差异Chl b是绿藻纲藻类中最主要的光合色素之一，1 6：4(n-3)和l 8：3(n-3)是绿藻微藻的主要脂肪酸，然而所有这些绿藻的特征化合物均未在Chlorella sp. 1061中检测到。DGTS和20:5(n-3)存在于很多的海洋微藻中，我们从Chlorella sp. 1061 中分离到占总极性甘油脂8 mo1%的DGTS，并从MGDG、DGDG和DGTS等极性甘油脂中检测到大量的20:5(n-3)。但是一般认为，小球藻属藻类中不舍这两种化合物。根据Chlorella sp. 1061的以上特点，这种藻不应该被归到小球藻属中。另外，由于Chlorella sp. 1061在色素、膜脂和脂肪酸组成特征方面大眼藻纲( Eustigmatophyceae)中的微绿球藻（Nannochloropsis）非常相似，因此，我们认为ChloreHa sp. 1061可能是Nannochloropsis中的一个种。但是未得到更进一步的证明和权威的认可之前，本文中我们仍然沿用ChloreHa sp,这一名称。 许多藻类中DGTS和PC -般不会同时存在，或者说一个存在时另外的一个的含量非常低。由此有人认为DGTS和PC之间存在着相互替代的关系。然而本研究中发现正常培养条件下Chlorella sp.中的DGTS和PC含量均较高（约10%）。磷处理实验结果表明，磷缺乏时Chlore Ha sp,中DGTS舍量大幅升高，而同时PC含量相应下降许多：但高浓度的磷并不能提高PC含量和降低DGTS含量，说明Chlorella sp,中DGTS仍可起替代PC的作用，然而PC可能并不能替代DGTS。Chlorella sp.中MGDG和DGTS脂肪酸组成及其位置分布结果显示，它们的组成和分布相似;在老化培养过程中MGDG和DGTS表现出周期性的相反的含量升高、降低的趋势，这进一步说明MGDG和DGTS之间存在着特殊的关系，MGDG可能合成自DGTS。 海洋微藻富含有利于人体健康的长链不饱和脂肪酸，如何提高微藻脂肪酸特别是多不饱和脂肪酸产量是目前研究的热点之一。本文首次报道了同时加入葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorelta sp,的生长、脂类组成和脂肪酸总产量的影响，结果显示葡萄糖和硫代硫酸钠存在明显而且强烈的互作，二者在培养液中的同时存在显著刺激了脂肪酸总产量的积累，在培养液中分别加入2.5 mM的葡萄糖和5mM的硫代硫酸钠，脂肪酸的产量可以比对照提高78%。而低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠对Chlorella sp.脂肪酸组成影响变化不明显，甚至在硫代硫酸钠存在下令人感兴趣的EPA含量还略有升高。显然，在Chlorella sp.培养中同时加入低浓度的葡萄糖和硫代硫酸钠是极具潜力的提高脂产量的方法，也可作为提高培养微藻其它活性物质产量借鉴的方法。在不久的将来，这种培养方法很可能发展成为生产实践中提高Chlore sp．乃至其它微藻脂肪酸、EPA和其它活性物质产量的经济有效的新途径。

烟草单半乳糖甘油二酯缺失对茉莉酸生物合成的影响

茉莉酸（JA）是由脂肪酸衍生而来的环戊酮化合物，广泛存在于自然界中，在植物逆境胁迫响应和生长发育调节过程中起重要作用。因此，JA被认为是一种新型植物激素。植物JA生物合成的最初底物是三烯脂肪酸（含有三个双键的十八碳和十六碳脂肪酸，18:3和16:3），这些脂肪酸经过脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合酶（AOS）和丙二烯氧化物环化酶（AOC）等一系列酶促反应，最终生成JA。JA生物合成所需要的三烯脂肪酸来自叶绿体膜脂。高等植物叶绿体类囊体膜含有四种极性甘油脂，它们是：单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)、硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)。但是人们尚不清楚JA生物合成所需要的三烯脂肪酸主要来自哪一种膜脂。 最近，我们利用RNA干扰技术获得了烟草MGDG部分缺失的突变体。MGDG是质体中最重要的甘油脂，其含量高达50%，其中含有的三烯脂肪酸约占总脂中三烯脂肪酸含量的65%。本研究的目的是以烟草MGDG缺失的突变体（mgd1）为材料，通过研究MGDG缺失对茉莉酸生物合成的影响，阐明半乳糖脂与JA生物合成的关系。 首先我们对野生型烟草（WT）和mgd1的相关生物学特性进行了研究，包括甘油脂和脂肪酸组成。结果表明，mgd1烟草叶片中MGDG含量降低了57％，同时，其三烯脂肪酸相对含量也大幅度降低。其中十六碳三烯酸（16:3）降低了78%，亚麻酸（18:3）含量减少了28%。因此，由于MGDG缺失，类囊体中的三烯脂肪酸降低了27%。这一结果说明了JA生物合成的底物大幅度减少。 为了说明MGDG缺失导致的三烯脂肪酸含量的减少是否影响到JA的含量，我们利用GC-MS方法比较了WT和mgd1烟草中JA的含量。结果表明，mgd1叶片中的JA含量较WT降低了50%，说明了MGDG的缺失影响了JA的生物合成。 伤害可以诱导JA在短时间内大量合成。我们比较了机械损伤后JA在WT和mgd1叶片中积累的动态过程。伤害同时可以使WT和mgd1叶片中的JA含量增加，并且在1小时达到最大值。但是，JA在两种烟草叶片中增加的幅度不同，WT叶片受伤1小时后JA含量是未受伤时的5倍，而mgd1叶片受伤1小时后，其JA含量只增加了1倍。这些结果说明了MGDG缺失可以严重影响伤害诱导的 JA 的积累，MGDG是JA的生物合成底物的重要来源。 我们进一步研究了MGDG缺失对JA生物合成相关酶基因表达的影响。 LOX1和AOC编码JA生物合成途径中的关键酶LOX和AOC。RT-PCR分析表明mgd1叶片中这两个基因受伤害激活的程度比WT弱。进一步说明突变体中JA合成受到影响。 植物受到伤害时内源JA含量增加，并激活防御基因的表达。我们的结果显示，当植物受伤害后，mgd1叶片中与JA信号转导相关的防御基因HPL，PI-I和PI-II的表达量增加幅度明显低于WT。这说明突变体中JA信号转导途径受到了抑制。 JA在植物对昆虫侵害的防御反应中起重要作用，上述结果表明突变体对伤害响应受到削弱。昆虫饲喂实验显示，棉铃虫更趋向食用mgd1植株叶片，取食mgd1植株的棉铃虫的体重增加较多。这些结果与WT和mgd1在JA含量、防御相关基因表达方面的差异相一致。外源施加茉莉酸甲酯（MeJA）能够恢复mgd1的抗虫性和防御基因的表达，说明JA是恢复mgd1抗虫性所必须的。 上述结果表明MGDG缺失使JA生物合成受到影响，尤其是JA在植物受到伤害后的生物合成。对于这一现象的可能的解释是：MGDG是JA生物合成底物的主要来源，由于mgd1中缺少大量的MGDG，当植物受到伤害时，MGDG不能释放出足够三烯脂肪酸来合成JA，导致其含量降低，破坏了JA信号途径，最终使得植株表现出抗性降低等特性。我们的研究证明了MGDG可以作为JA生物合成的底物来源在JA信号途径中起重要作用。

COMPARATIVE-ANALYSIS OF GLYCOPROTEIN AND GLYCOLIPID COMPOSITION OF VIRULENT AND AVIRULENT STRAIN MEMBRANES OF MYCOPLASMA-HYOPNEUMONIAE

The glycoproteins and glycolipids from membranes of virulent strain Z and avirulent strain M of Mycoplasma hyopneumoniae have been compared. The proteins and the glycoproteins were identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and concanavalin A-biotin labeling, respectively. The membrane preparation contained approximately 34 protein bands with molecular weights between 20 KD and 100 KD. The concanavalin A-biotin system reacted with a glycoprotein of a molecular weight of approximately 28,000 from avirulent strain M and did not react with the correspondent band from virulent strain Z. The membrane glycolipids of both strains consisted of monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG), and the percentages of 16:0, 18:0, and 18:1 fatty acids comprised more than 80% of the total fatty acids of membrane glycolipids. The 18:0 fatty acid of MGDG in avirulent strain M was twofold higher than that of virulent strain Z.

Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro

In many biological membranes, the major lipids are “non-bilayer lipids,” which in purified form cannot be arranged in a lamellar structure. The structural and functional roles of these lipids are poorly understood. This work demonstrates that the in vitro association of the two main components of a membrane, the non-bilayer lipid monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and the chlorophyll-a/b light-harvesting antenna protein of photosystem II (LHCII) of pea thylakoids, leads to the formation of large, ordered lamellar structures: (i) thin-section electron microscopy and circular dichroism spectroscopy reveal that the addition of MGDG induces the transformation of isolated, disordered macroaggregates of LHCII into stacked lamellar aggregates with a long-range chiral order of the complexes; (ii) small-angle x-ray scattering discloses that LHCII perturbs the structure of the pure lipid and destroys the inverted hexagonal phase; and (iii) an analysis of electron micrographs of negatively stained 2D crystals indicates that in MGDG-LHCII the complexes are found in an ordered macroarray. It is proposed that, by limiting the space available for MGDG in the macroaggregate, LHCII inhibits formation of the inverted hexagonal phase of lipids; in thylakoids, a spatial limitation is likely to be imposed by the high concentration of membrane-associated proteins.

膜脂在类囊体不同功能膜区的分布及其与植物抗寒性的研究

一． 通过对黄瓜类囊体及其基粒片层、间质片层、PS II放氧颗粒和LHC II 复合体脂类成分的分析，得 到以下结果：各膜区均含有类囊体膜的五种脂类成分，在类囊体及其基粒片层、间质片层和PS II放氧颗粒中，MGDG含量最高，分别为42.5%、40.5%、46.3%、和35.7%，其次是DGDG，含量在31-35%之间。值得注意的是黄瓜类囊体间质片层MGDG含量高于基粒片层，而且DGDG/DGDG分子比也较高。这在其它植物材料中还未见报道。在黄瓜LHC II中，PG含量最高，为35.5%，约是类囊体膜PG含量的3倍。从基粒片层、PS II放氧颗粒到LHC II， PG含量呈逐渐增加的趋势，而在间质片层中，PG含量最低。SQDG除在LHC II中含量稍低外，在其它膜区中的分布没有明显的差异。脂类脂肪酸组成分析结果表明：MGDG主要含亚麻酸，含量在90%以上。DGDG也主要含亚麻酸，含量在90%左右，DGDG所含棕榈酸多于MGDG中的含量。SQDG中主要脂肪酸组分为棕榈酸和亚麻酸。不同膜区MGDG、DGDG和SQDG脂肪酸组成没有明显差异在PG中含量最高的脂肪酸是叶绿体特有的反式十六碳一烯酸（trans-16:1)。此外，PG还含有较多的棕榈酸、硬脂酸和油酸。在不同膜区PG的脂肪酸组成有较明显的差异。 根据以上结果，我们推测脂类除了形成膜的流动性基质外，还可能选择性地结合在膜蛋白周转形成特 异的脂质微区，通过膜脂膜蛋白的相互作用，以行使其特殊的生理功能。 二、通过比较两种不同抗寒性小麦品种在低温锻炼前后类囊体脂类及其脂肪酸成分、LHC II复合体及类囊体吸收光谱、低温荧光发射光谱，发现经低温锻炼后：（1）抗寒与不抗寒小麦品种类囊体PG的trans-16:1含量均明显降低，抗寒品种类囊体MGDG/DGDG比值也明显降低，而不抗寒品种这一比值变化不明显。（2）抗寒品种脂/色素比值明显增高，而不抗寒品种滑明显增加。（3）抗寒与不抗寒品种LHC II宏聚体含量均降低而单体含量增加。（4）抗寒与不抗寒品种类囊体吸收光谱四阶导数光谱A_(683)/A_(652)比值均升高。（5）不抗寒品种低温荧光发射光谱F_(685)/F_(738)比值上升，而抗寒品种这一比值没有变化。通过对上述结果的分析，我们认为低温锻炼过程中类囊体膜流动性增强是使抗寒品种抗寒力增强的主要原因之一，此外，MGDG含量降低对膜的稳定性可能起重要作用。trans-16:1含量的降低和LHC II寡聚体解聚可能是植物对于低温的一种适应性反应。

发菜类囊体膜的组成及其光合特性的研究

发菜（Nostoc flagelliforme Born. et Flah.）的细胞壁由纤维素、半纤维素、糖脂和蛋白质组成。未经破碎的细胞难以进行各种光合特性的研究。由于纯度较高的发菜类囊体膜制备比较困难，对它的光合机理的研究一直是停留在整体水平上进行。我们采用French Press低温下高压破碎细胞，建立了一种快速简便的制备方法。在提取液中加入一定浓度的Ca2+ （Ca2+既有助于维持类囊体膜的放氧活性又可以使类囊体膜在较低的离心速度下使类囊体膜得到凝集沉淀），从而在较短时间内、在高速离心的情况下得到了纯度较高并具有较高放氧活性的发菜类囊体膜。在此基础上，我们采用改进的Allen（1991）的温和绿胶系统，首次对陆生蓝藻发菜类囊体膜色素蛋白复合体进行了分离，共分离出了11条绿色的色素蛋白复合物条带和两条浅黄色的条带。7条绿色的色素蛋白复合物条带属于PSI组分，4条绿色的蛋白复合物条带属于PSII组分，其中一条浅黄色条带系未被报道过的新的色素蛋白复合物条带，经其光谱性质的分析初步鉴定为类胡萝卜素蛋白复合物，此复合物的分离有助于解释发菜独特的适应荒漠、半荒漠地带高光辐射的特性。 本文还对干燥状态、复水30分钟后和复水生长24小时后的野生发菜及人工培养的发菜藻丝体膜脂及其脂肪酸组成进行了分析。发菜的膜脂由MGDG、MGDG、SQDG和PG组成，其酯酰基部位连接有16:0、16:1、18:0、18:1、18:2和18:3六种脂肪酸。野生发菜中具有高含量的不饱和脂肪酸，其含量可达总脂的73%，其中16:1和18:3分别达到28.9mol%和34.3mol%，远远高于已报道的其它蓝藻，所以我们推测发菜具有极强的抗逆性和其膜脂不饱和程度密切相关。分析不同处理的发菜的膜脂和脂肪酸组成表明，复水对野生发菜的膜脂及其脂肪酸组成没有显著影响，说明发菜的膜脂和脂肪酸组成在干燥状态下能保持很高的稳定性。从野生发菜分离出的藻丝体在25 ℃条件下培养，其膜脂脂肪酸组成发生了显著变化，主要表现为脂肪酸的不饱和程度的大幅度降低，18:3从34.9mol%降低到8.6mol%，16:1从28.9mol%降低到13.9mol%。上述结果表明了发菜具有极强的通过改变其膜脂的脂肪酸组成而适应生存环境的能力。

细胞色素b6f蛋白复合体的结构与功能色素的结构与功能及膜脂的作用

采用改进的的分离纯化方法从菠菜叶绿体中获得了纯度和活性、Chl a 和β-carotene含量较高的Cyt b6f制剂。利用吸收光谱、CD光谱和共振喇曼光谱对Cyt b6f蛋白复合体中的β-carotene分子的构型及构象进行了研究。结果表明，无论是结合在蛋白复合体上还是处于自由状态，该β-carotene都是一种特殊的9-顺式构型的分子;在蛋白复合体中，该9-顺式β-carotene存在于一种不对称的蛋白环境中，但从喇曼光谱中没有观察到构象扭曲现象。SDS处理前、后的荧光激发光谱和光破坏的研究表明Cyt b6f中的β-carotene不能有效地向Chl a传递光能，但对Chl a具有明显的光保护功能，因而说明β-carotene分子是Cyt b6f的天然结构和功能成分。根据这些实验结果和文献的有关报道，提出了β-carotene在Cyt b6f中可能的光保护机理模型，，即在Cyt b6f中，Chl a不是单线态氧的主要发生源，单线态氧主要由Rieske[Fe-s]中心产生，β-carotene不具有直接淬灭Chl a三线态的功能，其主要功能是作为抗氧化剂抵御Rieske[Fe-s]中心产生的单线态氧对Chl a的攻击，从而保护Cyt b6f中Chl a免受强光照射的破坏。 利用非变性凝胶电泳和硫酸铵沉淀对Chl a在Cyt b6f中的结合和解离现象进行了研究，观察到Chl a的解离与Rieske蛋白的解离及Cyt b6f复合体单体化的关系比较密切，膜脂能够有效地抵制这三个过程的发生，推测膜脂的作用位置位点可能位于Cyt b6f二聚体中两个单体之间的交界处。色素重组实验表明缺失Rieske[Fe-S]蛋白的Cyt b6f单体不能有效的和Chl a重组。 利用从菠菜叶绿体中分离纯化出的缺脂Cyt b6f与从菠菜类囊体分离纯化的膜脂进行体外重组，检测了不同膜脂对Cyt b6f催化电子传递活性的影响。结果表明：被检测的五种膜脂单半乳糖基甘油二酯（MGDG）、双半乳糖基甘油二酯 （DGDG），磷脂酰胆碱（PC），磷脂酰甘油（PG）和硫代异鼠李糖基甘油二酯（SQDG）对Cyt b6f催化电子传递的活性均有明显的促进作用，但促进的程度各不相同。不带电荷的MGDG和DGDG及分子整体呈电中性的PC对促进Cyt b6f催化电子传递的活性非常用效，最适条件下可分别使其活性提高89%、75%和77%;而带负电荷的PG和SQDG的活性促进作用则相对较弱，最适条件下仅可使其活性分别提高43%和26%。由此可见，膜脂对Cyt b6f活性的促进作用可能与这些膜脂分子的带电性质密切相关。

小麦光系统I的分离纯化及其光合特性的研究

从不同基因型的小麦京411和小偃54中分离纯化了PSI颗粒并研究了PSI颗粒的一些光合特性： 1. 测定了两种基因型小麦PSI颗粒的室温吸收光谱、低温荧光光谱，并进行了SDS-PAGE多肽分析。吸收光谱显示了红区680nm和蓝区439nm的两个最大吸收峰，低温荧光光谱显示了PSI特征的位于735nm左右的发射峰，同时SDS-PAGE也显示我们的制备物包括PsaA、PsaB、LHCI以及一些其它小分子量蛋白亚基。这些都表明我们从不同基因型小麦中获得了比较理想的PSI颗粒制备物。 2. 测定了京411类囊体膜和PSI颗粒的脂类组成和脂肪酸成分，发现PSI颗粒中也存在着类囊体膜中的五种膜脂，即：MGDG、DGDG、PG、SQDG、PC，但PSI颗粒的MGDG含量比类囊体膜高，而DGDG含量较类囊体低。PSI颗粒和类囊体膜的脂肪酸组成也有差异。 3. 运用光谱学手段，研究两种基因型小麦PSI颗粒光破坏过程的异同。发现在经过强光破坏后，两种小麦PSI颗粒都发生叶绿素漂白现象，在各种状态叶绿素中，683nm状态的Chl a对强光最为敏感，受到光破坏的程度最大，而649nm Chl b和667nm Chl a分子变化较小。结合吸收光谱和低温荧光光谱我们提出了PSI中可能存在的能量传递途径。比较两种小麦PSI颗粒光破坏在低温荧光光谱上的不同，我们初步认为，小偃54可能通过将能量较多地分配给予长波长Chl而一定程度的避免过多能量向P700反应中心传递，从而起到对P700的保护作用。 4. 研究了不同表面活性剂SDS和Triton X-100对PSI颗粒色素结合状态和能量传递的影响。发现表面活性剂对色素状态和PSI中的能量传递都有很大的影响。并且Triton X-100的作用较SDS强烈。紫外荧光显示PSI蛋白结构也发生了显著变化。

高等植物光系统II捕光天线结构与功能的研究

高等植物光系统II的捕光天线蛋白（LHC II）在光能的吸收、传递和调节激发能在两个光系统之间的分配以及维持类囊体膜的垛叠等方面都起着重要的作用，因而得到了广泛的研究。目前普遍认为LHC II在植物体内是以三聚体的形式存在并行使功能的，但也有研究者发现了单体和寡聚体等多种形式的LHC II。本论文以菠菜为研究对象，采用改进的方法从类囊体膜中提取纯化了LHC II三聚体，对膜脂和色素在三聚体形成和蛋白空间结构中的影响，以及不同聚集态LHC II组成、结构和功能的差异进行了较系统的研究。此外，还将Lhcb2基因反向插入到烟草中，利用转基因植物来研究其生理功能。获得了如下结果： 1，采用改进的方法从菠菜类囊体膜中分离纯化了LHC II。与改进前比，其流程可以缩短2小时且产率也有明显的提高。SDS变性电泳和Triton X-100非变性电泳的检测结果表明，此样品纯度较高，是由三条分子量分别为29KD、28KD和26KD的多肽组成的异质三聚体。同时样品的吸收光谱和荧光光谱分析结果也与前人的报道一致。 2，分析了LHC II三聚体中的膜脂和脂肪酸组成及含量。与PSII相比，LHC II含有相同的四种膜脂：MGDG、DGDG、PG和SQDG。但LHC II中PG的含量是PSII的两倍，说明PSII中的PG主要富集在外周天线区域。同时PG中含有特异的反式十六碳一烯酸，且含量很高。用专一消化PG上Sn-2位脂肪酸链的磷脂酶A2（PLA2）处理LHC II三聚体，然后再加入PG重组的方法证明了含十六碳一烯酸的PG在三聚体结构的维持中起着至关重要的作用。去掉PG后， LHC II三聚体的结构受到了影响，部分解聚成了单体，同时其光谱特性也发生了变化，表现为叶绿素b分子的吸收峰及其激发的荧光发射峰都明显下降。回加PG则可使解聚的单体又重新聚集成三聚体。 3，分别用电洗脱和蔗糖密度梯度离心两种方法分离了LHC II三聚体、二聚体和单体。两者比较，电洗脱对样品的破坏较大，而蔗糖密度梯度离心更加温和，对蛋白上结合的色素影响不大。系统研究了不同聚集态LHC II的组成和光谱特性后发现，三种聚集态的LHC II有相同的多肽组成，并且都结合着5种色素，但是色素的含量差异较大。二聚体和单体中，叶绿素b和类胡萝卜素分子的含量比三聚体的低很多，此外，单体叶绿素a分子的含量也明显减少。对三种聚集态LHC II的各种光谱特性进行分析的结果表明，由于叶绿素b和类胡萝卜素分子含量较少，二聚体和单体中叶绿素b和类胡萝卜素的吸收均有所下降，而且从类胡萝卜素到叶绿素b以及从叶绿素b到叶绿素a的能量传递效率都低于LHC II三聚体，总体表现为三聚体 > 二聚体 > 单体。此外，不同单体之间叶绿素a到叶绿素a的能量传递也被破坏。推测三种聚集态LHC II在吸能、传能和结构上的差异，可能是植物适应不同外界环境的一种调控机制。 4，模拟体内过程，在体外将大肠杆菌中表达的Lhcb2蛋白和色素进行重组，以此来研究色素与蛋白组装过程中蛋白二级结构和色素结合状态的变化。结果表明色素在脱辅基蛋白的体外重折叠中至关重要。在与色素重组的过程中，蛋白二级结构中-螺旋含量逐渐上升并最终接近天然水平，而无规卷曲逐渐减少。从光谱的变化可以看出，色素分子与蛋白的结合经历了一个由无序到有序的过程，色素蛋白复合物的光谱信号由弱变强，重组得到的样品与天然LHC II十分相似。 5，为了更好地研究LHC II异质三聚体中单体可能具有的独特生理功能，建立了Lhcb2基因的反义抑制植物表达载体pBI-antiLhcb2，用根癌农杆菌介导法转化烟草，获得了转基因植株。酶切和PCR鉴定证明，Lhcb2基因已经成功地插入到烟草里。进一步的分子鉴定和生理生化功能分析还在进行中。

硫代硫酸钠及葡萄糖对蓝细菌Synechocystis sP.PCC6803脂及光合器组成的影响

本文通过对蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加葡萄糖、Na2S203的BG-11培养基中的生长特性、脂类及脂肪酸组成、细胞低温荧光、色素组成进行分析测定，总结出如下规律： 当蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加有葡萄糖的BG-11培养基中培养时细胞出现了一种新的糖脂（记为糖脂-x），在添加果糖、麦芽糖、乳糖等其它碳源的培养基中生长的细胞中也检测到糖脂-x糖脂-x的出现经推测是与活性氧相作用的产物，当在含糖的培养基中加入活性氧猝灭剂Na2S203时能有效地抑制糖脂-x的出现。糖脂一x的出现伴随着其它脂、尤其是双半乳糖甘油二酯(DGDG)的含量下降，这可能与细胞营养代谢类型的转变相适应。糖脂-x的出现使细胞适应异养生长条件，这时藻胆体(PBS)，光系统II(PSII)，光系统I(PSD降解，叶绿素消失。 糖脂-x经1H-NMR波谱术检测证实为甘油糖脂，经气质联谱分析其脂肪酸组成中含大量的枝链脂肪酸，12-甲基十四碳酸、12-甲基十五碳酸、12-甲基十六碳酸以及两种稀有的含氮脂肪酸。这些脂肪酸在添加高浓度葡萄糖的培养基中生长的．Synechocystis sp. PCC 6803中的单半乳糖甘油二酯(MGDG)也能检测到。ESI-MS以及P-SI-MS测定结果表明糖脂．x含一分子的脂酰基侧链以及两分子的己糖，半乳糖与葡萄糖。 对．Synechocystis sp. PCC 6803生长在不同浓度的葡萄糖与Na2S203培养基中脂类组成与脂肪酸组成进行比较，发现Na2S203能有效地增加膜脂中硫代异鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的百分含量，培养基中同时添加葡萄糖时能抵消Na2S203的这一效应。此外，Na2S203能显著增加单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)中十六碳酸(C16:0)的百分含量，这一效应也能为葡萄糖恢复。Na2S203不能显著地改变SQDG中C16:0的百分含量，加入葡萄糖时能降低C16:0的百分含量。这些结果说明Na2S203可能充当一种还原剂使膜脂处于一种低的不饱和状态，同时加入葡萄糖时能降低Na2S203的还原力。此外，Na2S203还可作为SQDG合成中的硫供体。 用HPLC测定．Synechocystis sp. PCC 6803在添加不同浓度的Na2S203，葡萄糖的BG-11培养基中生长时的叶绿素与类胡萝卜素浓度，结果表明葡萄糖表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的抑制效应，Na2S203在低浓度时表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的促进效应，但在高浓度时表现出抑制效应。因此适当浓度的Na2S203的加入有利于维持蓝细菌在培养基中添加葡萄糖的生长条件下的低水平自由基，能使葡萄糖表现出促进细胞生长的特性。 通过测定Synechocystis sp. PCC 6803生长曲线中葡萄糖、Na2S203的浓度效应，结果表明葡萄糖在低浓度（例如5 mmoI.L-l）时表现出促进细胞的生长，在相对高的浓度表现出抑制细胞生长的效应。在培养基中同时加入Na2S203时可恢复葡萄糖对细胞的生长的促进效应。单独加入Na2S203表现出对细胞生长的抑制效应。这说明葡萄糖、Na2S203对细胞的生长存在着正的协同效应。

低磷胁迫对高等植物中膜脂含量及分布影响的研究

　磷脂酰甘油(PG)是类囊体膜中唯一的磷脂, 并具有独特的结构。其甘油的sn-2位上总是连接着一个棕榈酸 (16:0) 或反式十六碳烯酸 (16:1tans)。很多研究表明, PG在维持类囊体膜的结构与功能方面具有重要的作用。然而，一些研究表明，在缺磷培养条件下，蓝藻、衣藻和拟南芥中PG含量下降，同时双半乳糖甘油二酯(DGDG)和硫代异鼠李糖甘油二酯(SQDG)含量上升，这一现象似乎表明在缺磷条件下，DGDG和SQDG可以取代PG。在本工作中，我们在叶片、类囊体膜和光系统II水平上研究了缺磷对小麦和黄瓜膜脂组成和含量的影响，特别是缺磷对PG含量影响的机理，以阐明PG与其它甘油脂的关系和其在类囊体膜中的功能。 　　通过对生长在不同磷营养水平条件下9天龄和16天龄小麦叶片中光合膜脂含量的分析，发现在磷缺失培养条件下，小麦光合膜脂的相对含量发生了很大变化，这种变化与小麦叶龄密切相关。在16天龄小麦植株中，第一片叶为老叶，第二片叶为较老叶，而第三片叶为新叶，PG和单半乳糖甘油二酯(MGDG)在叶片中的相对含量从新叶到老叶逐渐下降，而DGDG和SQDG含量逐渐上升;在磷缺失条件下，16天龄小麦第一叶片中PG的含量(2.5%)远远低于其在9天龄小麦第一叶片中的含量(5.5%)。这些结果说明，磷缺失引起小麦叶片中脂含量的变化不仅与脂合成有关，而且与PG的降解有关：新生叶片中PG含量减少的主要原因是由于磷供应不足, 从而影响了PG的合成;而PG的降解则是老叶中PG含量下降的主要原因。 　　由于植物叶片中有部分PG并不分布于类囊体膜中，并且PG是类囊体膜中唯一的磷脂，为了阐明缺磷对类囊体膜脂含量的影响，利用黄瓜作为实验材料， 提取了缺磷和对照条件下黄瓜叶片中的类囊体膜和PSII颗粒，并对其中的脂进行了分析，以期在叶片、类囊体膜和PSII颗粒三个不同层次上来分析缺磷对黄瓜膜脂的影响。结果表明： 1. 黄瓜幼苗的缺磷培养可显著改变叶片中膜脂的组成, 表现为所有磷脂含量的下降和DGDG、SQDG含量上升。 2. 对不同叶位中脂含量的分析表明，在缺磷条件下，随着叶片年龄的增加，叶片中磷脂的含量是逐渐下降的并且低磷处理使新生叶中PC和PE的下降幅度明显高于PG，而PG含量的下降只有在老叶中才明显表现出来。由于PC和PE是质膜、内质网膜和线粒体膜等膜系统的主要组成成分，而叶片中PG主要存在于类囊体膜中。这说明，在新生叶中，缺磷对于其类囊体膜外其他膜系统中磷脂的影响要大于类囊体膜;并且在磷缺失条件下，老叶磷脂中的磷可以运送到新叶中被重新利用。 3. 缺磷引起叶片类囊体膜脂含量的变化与叶片类似, 即PG含量的降低伴随着DGDG和SQDG含量的升高。然而，与叶片中不同的是，缺磷使类囊体膜中MGDG含量轻微下降。在植株生长过程中，缺磷导致老叶类囊体膜中PG含量的下降幅度远远大于新生叶中的下降幅度，而伴随着PG含量的下降，老叶类囊体膜中SQDG和DGDG的含量要远远高于新叶中两种脂的含量。这说明，在叶片生长过程中，缺磷条件下类囊体膜脂中DGDG和SQDG含量的上升可以弥补PG含量的下降。 4. 尽管缺磷使类囊体膜中的PG含量有较大幅度的下降, 但是叶绿素荧光动力学和PSII光合放氧活性都没有受到显著的影响。这些结果说明缺磷胁迫并没有对PSII的功能产生显著的影响。进一步研究发现, 在缺磷黄瓜植株中, PSII中PG的含量仍然维持在一个较高的水平。这些结果表明, 缺磷可以导致类囊体膜中某些区域中的PG大幅度降低, 但是对分布在PSII中的PG含量则影响较小。缺磷对类囊体膜脂组成及分布在不同区域PG的影响说明了类囊体膜中的PG可能存在着两种类型: 一些PG分子在类囊体膜中仅仅起结构作用, 当这些PG分子缺少时, 其它脂特别是SQDG可以替代PG; 而另一些PG分子在PSII的结构和功能中起重要的作用, 具有其它脂类分子不可取代的功能。

高温和光照对光系统I结构与功能的影响

光合膜上包含有捕光并将光能转化为化学能所必需的四类跨膜蛋白复合体，即PSII、PSI、Cytb6f和ATP合成酶，其中PSI利用吸收的光能诱导电子从膜内侧的PC传递至相对一侧的铁氧还蛋白，被还原的铁氧还蛋白在FNR（Fd-NADP+氧化还原酶）的作用下生成NADPH，因此关于PSI的研究是光合作用研究领域中的重大问题。为了进一步阐明PSI的结构和功能，本论文分别研究了热对PSI的影响和光诱导的PSI核心复合物（CPI）的积累过程： 1.以菠菜PSI颗粒为材料研究了热处理对PSI复合物的降解和失活作用; 2.以衣藻叶绿素暗合成突变体y-1为材料研究了类囊体膜形成过程（即光诱导的转绿过程）中PSI中CPI的变化。另外，由于膜脂在光合作用中具有重要的功能，本论文还研究了y-1突变体转绿过程中光合膜脂、脂肪酸的变化。 一．应用光谱学、氧电极和变性电泳等技术研究了高温(25oC~80oC)对PSI结构和功能的影响，主要结果如下： 1． 在热处理过程中，683nm组分（主要归属于LHCI）的吸收峰强度有显著的下降并发生峰位蓝移现象，显示该组分对热处理最敏感，首先遭到破坏。 2． 77K荧光显示随着处理温度的升高，728 nm处的峰强和峰位均发生了明显的变化，F728-F720和F680的比率下降，说明热处理抑制了LHCI 680向LHCI 730以及反应中心的能量传递。 3． SDS-PAGE显示PSI核心蛋白PsaA/B亚基以及LHCI亚基在热处理情况下发生了不同程度的降解和聚合。为了能够显著地观察到热处理对PSI多肽降解的影响，实验采用了更高的温度处理方法，结果显示，90oC、100oC时PsaA/B亚基完全降解，而LHCI亚基仍有少量存在，说明PSI核心蛋白PsaA/B比LHCI亚基具有更高的热敏感性。 4． 推测热处理情况下可能发生的机制是，捕光天线首先从PSI反应中心分离，随后发生了反应中心光化学反应的抑制，直至最后多肽的严重降解。 5． 利用红外光谱技术（FT-IR）对PSI蛋白二级结构的研究显示，PSI颗粒在60oC以上时发生了明显的蛋白构象变化,且随着温度的升高蛋白构象的变化越来越大，表明PSI蛋白具有较高的热稳定性和热变性温度，PSI蛋白酰胺I带(1700~1600 cm-1)二级结构的解析表明热处理过程中二级结构的主要变化是α-helical的下降和β-sheet的增加。 6． 利用CD光谱技术研究了热处理对PSI色素微环境的影响，结果表明热处理破坏了PSI色素蛋白复合物中色素的蛋白微环境，归属于LHCI的Chlb（645 nm处组分）在较低的温度处理条件下(25~60oC)蛋白微环境即发生破坏;随着处理温度的升高（70和80 oC），478 nm处（主要归属于LHCI的Chlb）和498 nm（归属于类胡萝卜素）处的CD信号强度快速下降，说明在高温条件下LHCI比核心复合物更敏感。 7． 研究发现，PSI的摄氧活性随着处理温度的升高而显著下降，70oC时几乎完全失去摄氧能力，表明70oC时PSI复合物受到了严重的破坏，这可能是由于热处理过程中色素的蛋白微环境以及蛋白结构尤其是PSI核心蛋白PsaA/B中跨膜α-helix的构象发生了严重的变化。 二．主要运用温和电泳和蛋白印迹技术检测了暗培养4天(脱绿)的y-1突变体在光照诱发的转绿过程中PSI的核心色素蛋白复合物（CPI）及其叶绿素脱辅基蛋白PsaA/B的变化。 1． 暗培养4天的衣藻脱绿细胞中，PSI的主要色素蛋白复合物-CPI完全缺失，然而核心多肽PsaA/B仍有一定量的积累，同时检测不到P700的含量。 2． 当脱绿的y-1细胞转移至光照下时，伴随着叶绿素的合成，色素蛋白复合物CPI和PsaA/B脱辅基蛋白的合成也逐渐达到正常水平，说明叶绿素和PsaA/B蛋白进行组装并形成了具有功能的PSI反应中心,P700含量也得到了恢复。 3． 实验证明了光照是形成光合系统色素蛋白复合物的重要前提。同时发现，叶绿体基因编码的PSI核心多肽PsaA/B能够在暗条件下合成。而根据资料(Berends et al.,1987)报道，在豌豆、大麦的黄化体中不能合成PsaA/B蛋白，这可能是由于在脱绿的y-1细胞中叶绿体仍然具有相对完整的大小和形状，而在叶绿体的被膜上定位着多种与光合作用相关的酶系统。 三. 利用薄层层析及气相色谱分析技术对转绿期间y-1突变体光合膜脂和脂肪酸组成的含量变化进行了分析。结果表明： 1． 光照能够促进各种脂的积累并影响脂的组成，同时有利于脂肪酸脱饱和酶的激活。MGDG中脂肪酸不饱和程度明显升高，表现为16:0及18:1的下降，以及16:4，18：2和18:3（9，12，15）等的升高，说明光照促进了MGDG sn-2位的16:0脱饱和为16:4以及sn-1位的18：1脱饱和为18:3，也说明MGDG是脂肪酸脱饱和的重要底物。 2． 已有的资料（Ohnishi和Yamada，1980;1983）指出PG及其sn-2位的16:1（3t）的合成是光依赖的，而本实验中，在衣藻的黄化细胞中含有相当量的PG及其特有的16:1（3t）（22.80%），且转绿过程中变化并不十分显著。这可能是由于黄化的y-1细胞中叶绿体的形状并没有发生很大变化，说明叶绿体被膜上的相应酶系统才是PG合成的必需因素。 3． 相比于脱绿的y-1细胞，光照12小时后，各种脂中18：2的百分含量有显著的增加，这来源于18：2是脂肪酸脱饱和的重要中间产物。

盐适应植物光合作用耐热性研究

　　"盐渍土是一种分布广泛的土壤类型，盐渍土中生长的植物如何响应夏季较常出现的高温生长环境一直很少受到人们关注，我们以5种不同耐盐类型的植物为材料，研究其盐适应后光合作用的耐热性，并对耐热性原因做了进一步探讨，主要研究结果如下： 　　1． 用0、100、200、400 mM NaCl处理盐生植物碱蓬、滨藜、大莳萝蒿;用0、50、100、150 mM NaCl处理耐盐的甜土植物小麦和棉花。盐处理后碱蓬的整株干重变化不显著，而其他四种植物随着盐浓度的升高，整株干重逐渐减小，说明5种植物耐盐能力不同。盐处理对所有实验植物的光系统II最大光化学效率（Fv/Fm）、反应中心能量捕获效率（Fv′/Fm′）、实际量子产率（ΦPSII）、光化学猝灭系数（qP）等影响不显著;但对碳同化有明显影响。碱蓬盐处理后虽然气孔导度和胞间CO2浓度稍有下降，但CO2同化速率却高于对照;其他4种植物盐处理后CO2同化速率都明显降低，同时伴随着气孔导度和胞间CO2浓度的显著下降。以上结果表明盐适应植物的PSII并没有受到盐胁迫伤害，盐胁迫抑制这4种植物光合作用的一个重要原因可能是气孔限制。 　　2． 高温处理（36～48℃）结果显示，在42℃或45℃以上极端高温下，非盐处理植物的CO2同化速率下降至很低甚至为零，而盐适应植物仍保持一定强度的CO2同化能力。高温处理后盐适应植物的Fv/Fm、Fv′/Fm′、qP、ΦPSII下降幅度也都小于非盐处理植物。不同程度的盐胁迫都能诱导5种植物的光合作用对热胁迫产生抗性，说明植物在适应盐胁迫过程中都能启动一些耐逆机制，使得这5种植物的光合作用在获得耐盐性的同时也获得了对热胁迫的抗性。 　　3． 室温下（30℃）碱蓬盐处理后，过氧化氢酶、单脱氢抗坏血酸还原酶、抗坏血酸过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶活性等显著下降，超氧化物岐化酶活性变化不大，只有脱氢抗坏血酸还原酶活性显著增加;抗坏血酸和谷胱甘肽含量也显著下降。42℃高温处理后，碱蓬叶片的抗氧化系统的酶活性和抗氧化小分子物质含量变化与室温时变化类似。而且盐处理碱蓬叶片的膜脂过氧化产物MDA含量无论在室温下还是42℃处理后都显著高于非盐处理。盐处理后，碱蓬的抗氧化能力没有提高，推测盐处理叶片抗氧化能力大小不是决定其光合作用耐热性主要因素。 　　4． 在菠菜PSII颗粒的保存液中加入不同浓度的甜菜碱、脯氨酸和蔗糖（0~800 mM），测定PSII最大光化学效率（Fv/Fm）结果表明，有机相容性溶质的积累能显著缓解盐（400 mM和800mM NaCl）、热(30℃和40℃)及盐热胁迫共同作用对菠菜PSII颗粒的伤害。而盐处理后碱蓬、滨藜和莳萝蒿叶片中脯氨酸和可溶性糖含量都显著升高，说明盐胁迫诱导的有机相容性溶质的积累可能在盐适应植物光合作用的耐热性中起重要作用。 　　5． 提取室温下（30℃）或42℃高温处理碱蓬叶片的叶绿体和类囊体膜，用30℃、35℃、40℃、45℃、50℃水浴进行热处理，结果显示：用室温下或42℃高温处理的碱蓬盐适应叶片提取的叶绿体和类囊体经45℃以上水浴温度处理后，其PSII最大光化学效率（Fv/Fm）和放氧活性都显著高于非盐处理碱蓬叶片的叶绿体和类囊体;用42℃高温处理碱蓬叶片提取的叶绿体和类囊体热稳定性显著高于室温下碱蓬的叶绿体和类囊体。表明盐胁迫和热胁迫类似，都能在类囊体水平上诱导某些保护物质，增加植物PSII的耐热性。 　　6． 分析类囊体膜膜脂组成，结果显示，盐处理后碱蓬的类囊体膜脂中的饱和脂肪酸含量减少，不饱和脂肪酸含量增加;MGDG和DGDG含量变化不明显，而PG含量显著下降;42℃高温处理后碱蓬的类囊体膜脂组成也有类似的变化规律。盐诱导的碱蓬类囊体膜脂成分的变化可能不影响盐适应植物光系统的耐热性。"

RNAi沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究

磷脂是动物和植物非光合组织细胞膜系统的主要组成成分，在细胞生命过程中扮演着重要角色。尽管绿色植物光合膜的的甘油脂主要是糖脂，但是它仍然含有大约10％的磷脂，说明磷脂在光合膜的结构和功能中起重要作用。构成生物膜的磷脂有多种，但是，光合膜只含有磷脂酰甘油（PG）一种磷脂。光合膜中的PG有其特殊性，即：在PG的sn-2位上总连着一个棕榈酸（16:0）或者反式十六碳烯酸（16:1trans），说明了这种具有特殊结构的甘油脂在维持类囊体膜的结构和功能方面具有重要的作用。 叶绿体中有两个重要酶参与了PG的生物合成，它们分别是胞嘧啶二脂酰甘油合成酶（CDS）和磷脂酰甘油合成酶（PGS）。本实验以烟草和马铃薯为材料，利用RNAi技术，对CDS和PGS基因的表达进行抑制，通过PG缺失突变体，研究其功能。 对转含有PGS片段的沉默结构的转基因烟草叶片膜脂进行了分析，结果表明，与野生型烟草相比较，其PG含量下降了约20%，同时，SQDG和PC的含量增加。PG含量的降低没有引起MGDG和DGDG含量的变化。另外，我们还对转基因植株目的基因片段的RNA表达水平进行了RT-PCR分析，发现其表达量大幅度降低。这些结果表明，在转基因株系中，PGS基因的表达受到了抑制，说明我们获得了PG部分缺失的烟草PGS突变体。 对烟草PG缺失体的PG脂肪酸组成进行分析，表明其特征性脂肪酸反式十六碳烯酸含量明显下降，比野生型降低了44%，C18:0、C18:1和C18:2的相对含量增加，整个变化与总脂脂肪酸变化基本一致。 为了研究PG缺失对光合作用的影响，我们分析了多种光合指标。对叶绿素含量的分析表明，PG含量的降低影响了光合色素的组成。PG部分缺失的转基因烟草中的叶绿素总的含量下降，其中叶绿素b含量下降更为明显，结果，叶绿素a与叶绿素b的比值较野生型高。转基因植株净光合速率下降，二氧化碳利用率降低;PSII的最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（фPSII）降低，光化学猝灭下降，非光化学猝灭增加，尤其老叶的变化更为明显。这些结果说明了PG的部分缺失影响了植株的光合能力，捕光色素蛋白复合体的结构受到了影响，PSII功能遭受损伤。 同时，我们根据已经报道的马铃薯CDS基因，克隆了一个片段，构建沉默结构，并对沉默结构进行了转化。通过抗性基因的筛选以及RT-PCR检测，证明了沉默结构转化成功，目的基因的表达受到抑制，获得了马铃薯CDS转基因植株。 对马铃薯野生型和CDS转基因植株进行膜脂和脂肪酸分析表明，转基因植株叶片的PE、PG和PC等磷脂含量降低，SQDG和DGDG含量增加;C16:1（3t）、C16:2、C16:3、C18:1和C18:2含量下降，C16:0和C18:3含量增加，而C16:1和C18:0变化不明显。马铃薯CDS转基因植株的叶绿素荧光分析表明，PSII最大光化学效率降低，从野生型的0.82下降到0.77。