Valutazione preclinica di oligonucleotidi antisenso come nuovo approccio terapeutico specifico per le leucemie acute con riarrangiamenti di MLL

Le Leucemie Acute Mieloidi di sottotipo FAB M4 e M5, le Leucemie Acute Linfoblastiche e le Leucemie Bifenotipiche sono frequentemente caratterizzate da traslocazioni del gene 11q23/MLL con formazione di oncogeni di fusione e produzione di oncoproteine che inducono la trasformazione neoplastica. Tali leucemie con riarrangiamenti di 11q23/MLL sono caratterizzate da prognosi infausta e scarsa responsività alle terapie convenzionali. Data la necessità di trovare terapie efficaci per le leucemie con traslocazione di MLL, in questo lavoro di ricerca sono stati progettati, caratterizzati e validati siRNA per il silenziamento genico degli oncogeni di fusione di MLL, con lo scopo di valutare il ripristino delle normali funzionalità di differenziamento cellulare e l’arresto della proliferazione neoplastica. Sono stati progettati siRNA specifici per gli oncogeni di fusione di MLL, sia per le regioni conservate nei diversi oncogeni di fusione, sia a livello del punto di fusione (breakpoint), sia per le regioni sui geni partner. I siRNA sono stati valutati su linee cellulari contenenti diverse traslocazioni del gene MLL. Il silenziamento è stato valutato sia a livello cellulare in termini di riduzione della capacità proliferativa e del numero delle cellule leucemiche, sia a livello molecolare tramite l’analisi della diminuzione dell’mRNA degli oncogeni di fusione di MLL. E’ stata valutata la diminuzione delle oncoproteine di fusione di MLL in seguito a trattamento con siRNA. E’ stata analizzata la variazione dell’espressione di geni dipendenti da MLL in seguito a trattamento con siRNA. Sono stati messi a punto modelli murini bioluminescenti di leucemie acute con traslocazioni di MLL innanzitutto per studiare il trafficking in vivo e la progressione leucemica delle leucemie acute con traslocazione di MLL. Successivamente sono stati utilizzati i modelli murini per lo studio in vivo dell’efficienza e della tossicità dei siRNA progettati e validati in vitro, valutando diversi sistemi di delivery per i siRNA in vivo.

L'associazione Tipifarnib-Bortezomib nel trattamento delle leucemie acute mieloidi: risultati di uno studio multicentrico di fase I/II e validazione di un profilo genico predittivo di risposta

Background. Outcome of elderly acute myeloid leukemia (AML) patients is dismal. Targeted-therapies might improve current results by overcoming drug-resistance and reducing toxicity. Aim. We conduced a phase II study aiming to assess efficacy and toxicity of Tipifarnib (Zarnestra®) and Bortezomib (Velcade®) association in AML patients >18 years, unfit for conventional therapy, or >60 years, in relapse. Furthermore, we aimed to evaluated the predictive value of the RASGRP1/APTX ratio, which was previously found to be associated to treatment sensitivity in patients receiving Zarnestra alone. Methods. Velcade (1.0 mg/m2) was administered as weekly infusion for 3 weeks (days 1, 8, 15). Zarnestra was administered at dose of 300-600 mg BID for 21 consecutive days. Real-time quantitative-PCR (q-PCR) was used for RASGRP1/APTX quantification. Results. 50 patients were enrolled. Median age was 71 years (56-89). 3 patients achieved complete remission (CR) and 1 partial response (PR). 2 patients obtained an hematological improvement (HI), and 3 died during marrow aplasia. 10 had progressive disease (PD) and the remaining showed stable disease (SD). RASGRP1/APTX was evaluated before treatment initiation on bone marrow (BM) and/or peripheral blood (PB). The median RASGRP/APTX value on BM was higher in responder (R) patients than in non responders (NR) ones, respectively (p=0.006). Interestingly, no marrow responses were recorded in patients with BM RASGRP1/APTX ratio <12, while the response rate was 50% in patients with ratio >12. Toxicity was overall mild, the most common being febrile neutropenia. Conclusion. We conclude that the clinical efficacy of the combination Zarnestra-Velcade was similar to what reported for Zarnestra alone. However we could confirm that the RASGPR1/APTX level is an effective predictor of response. Though higher RASGRP1/APTX is relatively rare (~10% of cases), Zarnestra (±Velcade) may represent an important option in a subset of high risk/frail AML patients.

Farmacogenomica della Clofarabina nel trattamento delle Leucemie Acute pediatriche: identificazione di nuovi bersagli molecolari e del profilo genomico associato all’efficacia terapeutica del farmaco antitumorale

In quest’ultimi decenni si è assistito ad un notevole miglioramento nella terapia delle Leucemie Acute (LA) pediatriche, nonostante tutto si assiste oggi ad una fase di plateau della curva di sopravvivenza e le leucemie continuano a costituire la principale causa di morte pediatrica per malattia. Ulteriori progressi nel trattamento delle LA potrebbero essere ottenuti mediante studi di farmacogenomica che, identificando le componenti genetiche associate alla risposta individuale ai trattamenti farmacologici, consentono il disegno di terapie personalizzate e tumore-specifiche, ad alta efficacia e bassa tossicità per ciascun paziente. Il lavoro svolto è stato, dunque, finalizzato allo studio della farmacogenomica del farmaco antitumorale Clofarabina (CLO) nel trattamento delle LA pediatriche al fine di identificare marcatori genetici predittivi di risposta delle cellule leucemiche al farmaco, delucidare i meccanismi di resistenza cellulare ed individuare nuovi bersagli verso cui indirizzare terapie più mirate ed efficaci. L’analisi in vitro della sensibilità alla CLO di blasti provenienti da pazienti pediatrici affetti da Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) e Mieloide (LAM) ha consentito l’identificazione di due sottopopolazioni di cellule LAL ad immunofenotipo T a diversa sensibilità alla CLO. Mediante DNA-microarrays, si è identificata la “signature” genetica specificamente associata alla diversa risposta delle cellule LAL-T al farmaco. Successivamente, la caratterizzazione funzionale dei geni differenziali e l’analisi dei pathways hanno consentito l’identificazione specifica di potenziali biomarcatori di risposta terapeutica aprendo nuove prospettive per la comprensione dei meccanismi di resistenza cellulare alla CLO e suggerendo un nuovo bersaglio terapeutico per le forme LAL-T a bassa sensibilità al farmaco. In conclusione, nel lavoro svolto si sono identificati set di geni e pathways di rilievo biologico per la risposta delle cellule LAL-T alla CLO suggerendo marcatori genetici in grado di identificare i soggetti eleggibili per il trattamento o verso cui disegnare terapie innovative. Il lavoro è paradigma per l’applicazione della farmacogenomica in altre neoplasie.

Innate immunity genes as determinants of resistance/susceptibility to human disease : studies in leukemia patients

La leucémie lymphoblastique aiguë des cellules Pré-B (B-ALL) reste le type de cancer le plus souvent diagnostiqué chez les enfants. Des études ont montré que des déterminants génétiques jouent un rôle important dans la susceptibilité/résistance au développement de ce cancer. À cet égard, les gènes Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor (KIR) sont d'une importance particulière. Ces gènes sont fortement polymorphiques et codent pour des récepteurs qui contrôlent l’activité fonctionnelle des cellules Natural Killer (NK). Notre hypothèse est que les gènes activateurs des KIR s’associent avec la résistance innée pour développer la B-ALL. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons entrepris une étude de cas-contrôles chez des enfants canadiens-français dans laquelle nous avons utilisé l'ADN génomique de 100 patients atteints de B-ALL ainsi que l’ADN de 245 individus sains. La présence ou l'absence de chaque gène KIR a été détectée par PCR en utilisant des amorces de séquences spécifiques. Nous avons trouvé que la présence des gènes KIR activateurs est significativement diminuée chez les enfants leucémiques par rapport aux témoins. En outre, le nombre de ces gènes a aussi montré une association significative linéaire avec la résistance au développement d’une B-ALL. Cela suggère des effets additifs de ces gènes permettant de conférer une protection contre ce cancer. Ces résultats pourraient être utiles afin de déceler de façon précoce les enfants ayant un risque de développer cette leucémie. Enfin, des stratégies thérapeutiques basées sur les récepteurs KIR pourraient être envisagées et s'avérer utiles concernant le traitement de ce cancer chez les enfants.

Ruolo della proteina arginin-metiltrasferasi-5 (PRMT5) nella linfomagenesi B: implicazioni terapeutiche

Numerosi studi hanno mostrato come i meccanismi epigenetici di regolazione della cromatina svolgano un ruolo centrale nel controllare la trascrizione genica. E’ stato infatti dimostrato che complessi inibitori come SWI/SNF e gli enzimi ad esso associati quali istone deacetilasi (HDAC) e protein arginin-metiltrasferasi (PRMT), siano coinvolti nel controllo della crescita, differenziazione e proliferazione cellulare. Diversi studi hanno mostrato come i meccanismi epigenetici di controllo della trascrizione genica svolgano un ruolo di primo piano nel promuovere la sopravvivenza cellulare in leucemie/linfomi di derivazione dai linfociti B come la leucemia linfatica cronica, il linfoma mantellare ed i linfomi associati al virus di Epstein-Barr (EBV). Tuttavia, molto poco e’ conosciuto circa i meccanismi epigenetici di controllo della trascrizione che divengono operativi e che contribuiscono al processo di trasformazione dei linfociti B. PRMT5 e’ un enzima che di-metila specificamente residui argininici sugli istoni (H) 3 (H3R8) ed 4 (H4R3). PRMT5 ed HDAC lavorano in concerto per reprimere la trascrizione di specifici geni oncosoppressori. In questo progetto sono stati studiati i meccanismi e le conseguenze dell’iperespressione di PRMT5 durante il processo di trasformazione dei linfociti B indotto da EBV, e’ stata dimostrata l’importanza di questo enzima nel processo di trasformazione, e sono stati studiati nuovi metodi per inibirne l’espressione/attivita’. In particolare si e’ dimostrato che l’espressione di PRMT5 e’ ridotta o assente in linfociti B normali (o attivati da stimoli fisiologici) ed elevata in linee cellulari linfoblastoidi immortalizzate o completamente trasformate. Elevati livelli citosolici di PRMT5 sono detectabili dopo 4 giorni dall’infezione di linfociti B normali con EBV, PRMT5 e’ detectabile a livello nucleare, dove esercita la sua funzione repressoria la trascrizione, a partire dal giorno 8. L’utilizzo di specifici small interference RNAs (siRNA) in linee cellulari linfoblastoidi ha permesso di dimostrare la riduzione dell’espressione di PRMT5, la riduzione della metilazione degli istoni target di PRMT5, inibizione della proliferazione cellulare e abbassamento della soglia di sensibilita’ cellulare a stimoli pro-apoptotici. Esperimenti di co-immunoprecipitazione cromatinica hanno permesso di evidenziare che in queste cellule PRMT5 e’ parte di un complesso proteico a funzione inibitoria e che questo complesso si lega alla regione promotrice di specifici geni oncosoppressori quali ST7, GAS e NM23, inibendone la trascrizione. Si e’ inoltre provveduto a sviluppare una categoria di inibitori allosterici di PRMT5: l’attivita’ terapeutica/la specificita’ in vitro e la modalita’ di somministrazione ottimale in modelli murini di linfoma non-Hodgkin, sono in corso di valutazione.

Pre-clinical and clinical development of leukemia stem cell inhibitors in acute leukemias

In Leukemias, recent developments have demonstrated that the Hedgehog pathway plays a key-role in the peculiar ability of self renewal of leukemia stem cells. The aim of this research activity was to investigate, through a first in man, Phase I, open label, clinical trial, the role and the impact, mainly in terms of safety profile, adverse events and pharmacokinetics, of a Sonic Hedgehog inhibitor compound on a population of heavely pretreated patients affected by AML, CML, MF, or MDS, resistant or refractory to standard chemotherapy. Thirty-five patients have been enrolled. The drug was administered orally, in 28 days cycles, without rest periods. The compound showed a good safety profile. The half life was of 17-35 hours, justifying the daily administration. Significant signs of activity, in terms of reduction of bone marrow blast cell amount were seen in most of the patients enrolled. Interestingly, correlative biological studies demonstrated that, comparing the gene expression profyiling signature of separated CD34+ cells before and after one cycle of treatment, the most variably expressed genes were involved in the Hh pathway. Moreover, we observed that many genes involved in MDR (multidrug resistance)were significantly down regulated after treatment. These data might lead to future clinical trials based on combinatory approaches, including, for instance, Hh inhibitors and conventional chemotherapy.