Fluorescence in situ hybridization of potato somatohaploids and their somatic hybrid donors using two Solanum brevidens specific sequences

Selostus: Perunan somaattisten hybridien ja niiden somatohaploidien fluoresenssi in situ -hybridisaatio Solanum brevidens -lajin spesifisten sekvenssien avulla

Characterization of board impurities with a Raman device

Erilaisia epäpuhtauksia kulkeutuu paperinvalmistusprosessiin ja monenlaisia saostumia muodostuu paperinvalmistuksen prosesseissa. Epäpuhtaudet voivat aiheuttaa prosessiongelmia sekä alentaa tuotteen laatua. Epäpuhtauksien alkuperän ja koostumuksen selvittäminen edellyttää usein erilaisten analyysimenetelmien käyttöä. Epäpuhtauksien luokittelu on useasti välttämätöntä ennen tarkempaa kemiallista analyysia. Paperinvalmistuksen epäpuhtauksien kvalitatiiviseen luokitteluun on yleisimmin käytetty mikroskopian, IR-spektroskopian ja analyyttisen pyrolyysin menetelmiä. Raman spektroskopia on harvinaisempi menetelmä paperiteollisuuden tutkimuksessa. Raman instrumenttien kehittyminen on ollut voimakasta viimeisen vuosikymmenen aikana. Raman spektroskopia onkin osoittanut mandollisuutensa polymeerien, lääketeollisuuden ja polttoaineteollisuuden tutkimuksissa. Tässä työssä tutkittiin erään elintarvikepakkauskartongin epäpuhtauksia Raman spektroskoopilla. Työn tavoitteena oli selvittää Raman analyysin käyttökelpoisuutta kartongin epäpuhtauksien online-luokittelussa. Tutkimukset suoritettiin Spectracoden RP-1 Raman instrumentilla. Tutkimukset osoittivat, että näytteen fluoresenssi ja näytteen hajoaminen asettavat rajoituksia epäpuhtauksien Raman analyysille. Epäpuhtauksien online-tunnistaminen toimii käytettäessä suuria lasertehoja ja säteilytysaikoja. Näytteiden laserherkkyys ja fluoresenssi rajoittavat kuitenkin suurien laiteparametrien käyttöä. Laiteparametrien pienentäminen johti mittauksien signaali-kohina suhteen alenemiseen, mikä puolestaan aiheutti online-tunnistuksen toimimattomuuden.

Fluoresoivien paperinäytteiden spektrogoniometriset mittaukset

Fluoresoivat värit ovat viime aikoina yleistyneet näkyvästi vaatetuksessa ja huomaamattomammin esimerkiksi erilaisissa turvamerkinnöissä. Työssä tutkittiin fluoresoivan ja fluoresoimattoman paperinäytteen pinnastamitattuja heijastusjakaumia ja verrattiin niitä keskenään. Työn teoriaosuudessaesitellään eri värijärjestelmiä sekä selvitetään fluoresenssiä ilmiönä ja sen aiheuttamia värin mittaamiseen liittyviä ongelmia. Kokeellisessa osuudessa mitattiin heijastus puoliavaruuteen sekä fluoresoivan että tavallisen paperinäytteen pinnasta. Mittauksessa käytettiin suodattimia, jotta nähtiin, miten eri aallonpituudet heijastuivat näytteen pinnasta. Heijastusjakaumien muotoja vertailtiin eri näytteiden kesken. Lisäksi vertailtiin yksittäisen näytteen heijastusjakaumia aallonpituuksittain. Fluoresoivien ja fluoresoimattomien näytteiden heijastusjakaumien muodoissa havaittiin selviä eroavaisuuksia.

Combining Near-Field and Far-Field Microscopy: A new method for nanoscale super-resolution imaging

Lähikenttä- ja kaukokenttämikroskopian yhdistäminen: Uusi korkearesoluutioinen menetelmä nanokuvantamiseen. Osteoporoosi on sairaus, jossa luun uudistumisprosessi ei ole enää tasapainossa. Uuden luun muodostuminen on hitaampaa johtuen osteoblastien laskeneesta aktiivisuudesta. Yksi keino estää osteoporoosin syntyä on estää osteoklastien sitoutuminen luun pinnalle, jolloin ne eivät aloita luun syömisprosessia. Tämän Pro gradu -tutkielman tarkoituksena on luoda uusi työkalu osteoklastien sitoutumisen tutkimiseen samanaikaisesti fluoresenssi- ja atomivoimamikroskoopilla. Tätä tarkoitusta varten yhdistettiin atomivoimamikroskooppi sekä STED mikroskooppi. Kirjallisuuskatsauksessa käydään läpi yksityiskohtaisesti molempien mikroskooppitekniikoiden teoriat. Kokeellisessa osiossa esitetään käytetyt metodit ja alustavat tulokset uudella systeemillä. Lisäksi keskustellaan lyhyesti kuvan analysoinnista ImageJohjelmalla. Konfokaalisen fluoresenssimikroskoopin ja atomivoimamikroskoopin yhdistelmä on keksitty jo aikaisemmin, mutta tavallisen konfokaalimikroskoopin erottelukyvyn raja on noin 200 nanometriä johtuen valon diffraktioluonteesta. Yksityiskohdat eivät erotu, jos ne ovat pienempiä kuin puolet käytettävästä aallonpituudesta. STED mikroskooppi mahdollistaa fluoresenssikuvien taltioimisen solunsisäisistä prosesseista 50 nanometrin lateraalisella erotuskyvyllä ja atomivoimamikroskooppi antaa topografista tietoa näytteestä nanometrien erotuskyvyllä. Biologisia näytteitä kuvannettaessa atomivoimamikroskoopin erotuskyky kuitenkin huononee ja yleensä saavutetaan 30-50 nanometrin erotuskyky. Kuvien kerrostaminen vaatii vertauspisteitä ja tätä varten käytettiin atomivoimamikroskoopin kärjen tunnistamista ja referenssipartikkeleita. Kuva-analysointi suoritettiin ImageJ-kuvankäsittelyohjelmalla. Tuloksista nähdään, että referenssipartikkelit ovat hyviä, mutta niiden sijoittaminen tarkasti tietylle kohdealueelle on hankalaa nanoskaalassa. Tästä johtuen kärjen havaitseminen fluoresenssikuvassa on parempi metodi. Atomivoimamikroskoopin kärki voidaan päällystää fluoresoivalla aineella, mutta tämä lisää kärjen aiheuttamaa konvoluutiota mittausdataan. Myös valon takaisinsirontaa kärjestä voidaan tutkia, jolloin konvoluutio ei lisäänny. Ensimmäisten kuvien kerrostamisessa käytettiin hyväksi fluoresoivalla aineella päällystettyä kärkeä ja lopputuloksessa oli vain 50 nanometrin yhteensopimattomuus fluoresenssi- ja topografiakuvan kanssa. STED mikroskoopin avulla nähdään leimattujen proteiinien tarkat sijainnit tiettynä ajankohtana elävän solun sisällä. Samaan aikaan pystytään kuvantamaan solun fyysisiä muotoja tai mitata adheesiovoimia atomivoimamikroskoopilla. Lisäksi voidaan käyttää funktinalisoitua kärkeä, jolla voidaan laukaista signalointitapahtumia solun ja soluväliaineen välillä. Sitoutuminen soluväliaineeseen voidaan rekisteröidä samoin kuin adheesiomediaattorien sijainnit sitoutumisalueella. Nämä dynaamiset havainnot tuottavat uutta informaatiota solun signaloinnista, kun osteoklasti kiinnittyy luun pintaan. Tämä teknologia tarjoaa uuden näkökulman monimutkaisiin signalointiprosesseihin nanoskaalassa ja tulee ratkaisemaan lukemattoman määrän biologisia ongelmia.

Luminescence-based assay methods in drug discovery

The drug discovery process is facing new challenges in the evaluation process of the lead compounds as the number of new compounds synthesized is increasing. The potentiality of test compounds is most frequently assayed through the binding of the test compound to the target molecule or receptor, or measuring functional secondary effects caused by the test compound in the target model cells, tissues or organism. Modern homogeneous high-throughput-screening (HTS) assays for purified estrogen receptors (ER) utilize various luminescence based detection methods. Fluorescence polarization (FP) is a standard method for ER ligand binding assay. It was used to demonstrate the performance of two-photon excitation of fluorescence (TPFE) vs. the conventional one-photon excitation method. As result, the TPFE method showed improved dynamics and was found to be comparable with the conventional method. It also held potential for efficient miniaturization. Other luminescence based ER assays utilize energy transfer from a long-lifetime luminescent label e.g. lanthanide chelates (Eu, Tb) to a prompt luminescent label, the signal being read in a time-resolved mode. As an alternative to this method, a new single-label (Eu) time-resolved detection method was developed, based on the quenching of the label by a soluble quencher molecule when displaced from the receptor to the solution phase by an unlabeled competing ligand. The new method was paralleled with the standard FP method. It was shown to yield comparable results with the FP method and found to hold a significantly higher signal-tobackground ratio than FP. Cell-based functional assays for determining the extent of cell surface adhesion molecule (CAM) expression combined with microscopy analysis of the target molecules would provide improved information content, compared to an expression level assay alone. In this work, immune response was simulated by exposing endothelial cells to cytokine stimulation and the resulting increase in the level of adhesion molecule expression was analyzed on fixed cells by means of immunocytochemistry utilizing specific long-lifetime luminophore labeled antibodies against chosen adhesion molecules. Results showed that the method was capable of use in amulti-parametric assay for protein expression levels of several CAMs simultaneously, combined with analysis of the cellular localization of the chosen adhesion molecules through time-resolved luminescence microscopy inspection.

Analytical methods for analyzing organic peroxides

Työn tarkoituksena oli kehittää analyyttinen erotusmenetelmä eräässä valmistusprosessissa käytettävän hapettavan aineen ja liuottimen välillä syntyvien reaktiotuotteiden tutkimiseen ja analysoimiseen. Lisäksi tarkoituksena oli tutkia prosessiolosuhteiden turvallisuutta. Kirjallisuusosassa käsitellään erilaisia orgaanisia peroksideja, niiden käyttötarkoituksia ja niiden käyttöön liittyviä huomioitavia asioita. Lisäksi tarkastellaan yleisimpiä analyysimenetelmiä, joita on käytetty erilaisten peroksidien analysoinnissa. Näitä analyysimenetelmiä on useimmiten käytetty nestemäisten näytteiden tutkimuksissa. Harvemmin on analysoitu kaasu- ja kiintoainenäytteitä. Kokeellisessa osassa kehitettiin kirjallisuuden perusteella peroksidiyhdisteille identifiointimenetelmä ja tutkittiin prosessin näytteet. Analyysimenetelmiksi valittiin iodometrinen titraus ja HPLC-UV-MS-menetelmä. Lisäksi käytettiin peroksidimittaukseen soveltuvia testiliuskoja. Tutkimus osoitti, että iodometrisen titrauksen ja testiliuskojen perusteella näytteissä oli vähäisiä määriä peroksideja viikon jälkeen peroksidilisäyksestä. HPLC-UV-MS-analyysien perusteella näytteiden analysointia häiritsi selluloosa, jota löytyi jokaisesta näytteestä.

Capillary electrophoresis for monitoring of carboxylic, phenolic and amino acids in bioprocesses

Bioprocess technology is a multidisciplinary industry that combines knowledge of biology and chemistry with process engineering. It is a growing industry because its applications have an important role in the food, pharmaceutical, diagnostics and chemical industries. In addition, the current pressure to decrease our dependence on fossil fuels motivates new, innovative research in the replacement of petrochemical products. Bioprocesses are processes that utilize cells and/or their components in the production of desired products. Bioprocesses are already used to produce fuels and chemicals, especially ethanol and building-block chemicals such as carboxylic acids. In order to enable more efficient, sustainable and economically feasible bioprocesses, the raw materials must be cheap and the bioprocesses must be operated at optimal conditions. It is essential to measure different parameters that provide information about the process conditions and the main critical process parameters including cell density, substrate concentrations and products. In addition to offline analysis methods, online monitoring tools are becoming increasingly important in the optimization of bioprocesses. Capillary electrophoresis (CE) is a versatile analysis technique with no limitations concerning polar solvents, analytes or samples. Its resolution and efficiency are high in optimized methods creating a great potential for rapid detection and quantification. This work demonstrates the potential and possibilities of CE as a versatile bioprocess monitoring tool. As a part of this study a commercial CE device was modified for use as an online analysis tool for automated monitoring. The work describes three offline CE analysis methods for the determination of carboxylic, phenolic and amino acids that are present in bioprocesses, and an online CE analysis method for the monitoring of carboxylic acid production during bioprocesses. The detection methods were indirect and direct UV, and laser-induced frescence. The results of this work can be used for the optimization of bioprocess conditions, for the development of more robust and tolerant microorganisms, and to study the dynamics of bioprocesses.

Spectrally Tuned Lanthanide Photoluminescence for Point-of-Care Testing

Point-of-care (POC) –diagnostics is a field with rapidly growing market share. As these applications become more widely used, there is an increasing pressure to improve their performance to match the one of a central laboratory tests. Lanthanide luminescence has been widely utilized in diagnostics because of the numerous advantages gained by the utilization of time-resolved or anti-Stokes detection. So far the use of lanthanide labels in POC has been scarce due to limitations set by the instrumentation required for their detection and the shortcomings, e.g. low brightness, of these labels. Along with the advances in the research of lanthanide luminescence, and in the field of semiconductors, these materials are becoming a feasible alternative for the signal generation also in the future POC assays. The aim of this thesis was to explore ways of utilizing time-resolved detection or anti-Stokes detection in POC applications. The long-lived fluorescence for the time-resolved measurement can be produced with lanthanide chelates. The ultraviolet (UV) excitation required by these chelates is cumbersome to produce with POC compatible fluorescence readers. In this thesis the use of a novel light-harvesting ligand was studied. This molecule can be used to excite Eu(III)-ions at wavelengths extending up to visible part of the spectrum. An enhancement solution based on this ligand showed a good performance in a proof-of-concept -bioaffinity assay and produced a bright signal upon 365 nm excitation thanks to the high molar absorptivity of the chelate. These features are crucial when developing miniaturized readers for the time-resolved detection of fluorescence. Upconverting phosphors (UCPs) were studied as an internal light source in glucose-sensing dry chemistry test strips and ways of utilizing their various emission wavelengths and near-infrared excitation were explored. The use of nanosized NaYF :Yb3+,Tm3+-particles enabled the replacement of an external UV-light source with a NIR-laser and gave an additional degree of freedom in the optical setup of the detector instrument. The new method enabled a blood glucose measurement with results comparable to a current standard method of measuring reflectance. Microsized visible emitting UCPs were used in a similar manner, but with a broad absorbing indicator compound filtering the excitation and emission wavelengths of the UCP. This approach resulted in a novel way of benefitting from the non-linear relationship between the excitation power and emission intensity of the UCPs, and enabled the amplification of the signal response from the indicator dye.

Kerros-kerrokselta kokoonpannut ohutkalvot ja luminoivat kalvosensorit

Kerros-kerrokselta eli layer-by-layer eli LbL –kalvoja voidaan valmistaa kastamis-, sumutus-, pyöritys- tai pyöritys-sumutusmenetelmillä. Kalvon muodostumisen ensimmäinen vaihe on nopea, se kestää muutaman sekunnin. Toisessa vaiheessa tapahtuu diffundoitumista ja se kestää useita minuutteja. Rakentumista voidaan tarkkailla lukuisilla visuaaliseen tai uv-valoon tai muuhun säteilyyn perustuvilla menetelmillä. Kalvojen pintarakennetta ja karheutta sekä eri suolojen vaikutusta voidaan selvittää atomivoimamikroskopia- ja ellipsometrisillä kuvilla. Luminesenssi on säteilyn itsestään tapahtuvaa emissiota. Fluoresenssi ja fosforesenssi ovat luminesenssin erikoistapauksia. Fotonin absorption jälkeen molekyyli voi palata perustilalle fluoresenssin tai fosforesenssin avulla, mutta molekyyli voi myöskin kokea sisäisen varauksensiirron tai konformaation vaihdoksen. Luminesenssi-ilmiötä voidaan käyttää tunnistamaan yhdiste tai määrittämään sen pitoisuus. Voidaan rakentaa sensoreita, joissa yhdisteen toinen osa on osana sensoria. Yhdisteen toisen osan, analyytin, liittyessä siihen tapahtuu värimuutos. Sensori koostuu optisesta päästä, vaihtelevan pituisesta johdosta ja aistimisyksiköstä. Kokonaislaitteisto koostuu valon lähteestä, valokuidusta ja optisesta voimamittarista. Analyytin indusoimaa aggregaatiota ja sitä seuraavaa optista vastetta voidaan käyttää herkkänä muuntomekanismina analyytin havaitsemiseen. On kehitetty lukuisille analyyteille herkkiä spesifisiä polymeerejä, joita voidaan käyttää eri ionien havaitsemiseen. Myös bioaistiminen on mahdollista, esimerkiksi kolibakteeri voidaan havaita. Kvanttipisteet ovat pieniä puolijohtavan materiaalin hiukkasia. Niillä on ainutlaatuisia optisia, sähköisiä ja kemiallisia ominaisuuksia. On kehitetty erityisiä lastulaboratorioita. Niillä on mahdollisuus toteuttaa erilaisia funktioita, kuten näytteen valmistus, pitoisuuden säätö ja detektio yksittäisen miniaturisoidun alustan päällä. Luminesenssissa valon emissio vahvistuu, ja monissa tapauksissa tapahtuu ns. Stokesin siirtymä. Stokesin siirtymässä valon emissiomaksimin aallonpituus siirtyy infrapuna-alueen suuntaan. Emission vahvistumisen kemiallisina aiheuttajina ovat kromoforit eli värin kantajat. Valon määrää ja aallonpituutta voidaan käyttää tunnistamaan analyytti tai analyytin määrä. Luminesenssin lisäksi voidaan käyttää taittoindeksiin perustuvia optisia aistimismenetelmiä.

Mikrofluidiikkaan perustuvien potilasläheisten määritysjärjestelmien hyödyt ja ongelmakohdat sekä Tyreotropiinimäärityksen optimointi ja mikrofluidiikan hallinta vieritestaukseen soveltuvalla määritysalustalla

Keskitettyihin laboratoriotutkimuksiin verrattuna potilaan tai näytteenottopaikan läheisyydessä tehtävä vieritestaus on useimmiten kustannustehokkaampaa, helpompaa ja huomattavasti nopeampaa, eikä testin suorittamiseen välttämättä vaadita erityiskoulutettua henkilökuntaa. Potilasläheinen diagnostiikka on muokannut terveydenhoitoalaa siirtämällä päivittäisiä ja rutiininomaisia määrityksiä lähelle potilasta, tulosten ollessa selvillä lähes välittömästi. Nopea diagnostiikkaa saattaa myös vaikuttaa jatkohoitopäätöksen tekemiseen sairaalaolosuhteissa. Riittävän herkkyyden omaavien määritysjärjestelmien suunnittelu ja valmistus on kuitenkin hankalaa, lisäksi valmistusmateriaalien ja käytettyjen reagenssien tasalaatuisuus ei aina ole itsestään selvää. Laatuvirheet ovat yleisesti vaikeasti havaittavia sekä vaikuttavat olennaisesti määrityksen suorittamiseen ja tulokseen. Mikroskaalalla materiaalien fysikaalinen käytös muuttuu, ominaisuus otettava huomioon järjestelmiä suunnitellessa. Tutkielman kokeellisessa osassa optimoitiin 107 nm:n ja 92 nm:n Eu3+-ioneja sisältäviä polystyreeni-nanopartikkeleita sekä kahta eri anti-TSH vasta-ainetta hyödyntävä heterogeeninen sandwich-tyyppinen immunomääritys uudelle määritysalustalle. Työssä tarkasteltiin immunomäärityksen optimaaliselle toiminnalle olennaisia asioita kuten lämpötilaa määrityksen eri pisteissä, reaktiotilavuuksia ja -aikoja, puskureiden koostumuksia ja pitoisuuksia, leima-ainemääriä, säilytysolosuhteita sekä mikrofluidiikan vaikutuksia ja toimintaa tietokoneohjatulla mekaanisella ruiskujärjestelmällä. Diagnostiikkakasetin reaktiokammion pesutekniikat sekä pesuaineen vahvuus sekä koostumus olivat myös tarkasteltavina. Nanopartikkeleiden tuottama pitkäikäinen fluoresenssi mitattiin reaktiokammion pinnalta Victor-levylukijalla. Haastetta työhön toi mikrofluidiikan hallinta ja sen ominaisuudet, pääasiassa nesteliike, kuplanmuodostus sekä reaktiokammion onnistunut pesu. Määritys toimii teknisesti hyvin ja oikealla tavalla. Määritysaika oli 15 minuuttia. Aivan pienimpiä pitoisuuksia ei kuitenkaan kyetty erottamaan taustasta. TSH-määrityksen optimointi tuotti runsaasti teknistä perustietoa heterogeenisen immunomäärityksen toimivuudesta kasetti-ympäristössä, mikä helpottaa muiden samalla periaatteella toimivien määritysten käyttöönottoa. Määritysjärjestelmää voidaan tulevaisuudessa käyttää esimerkiksi kilpirauhasen vajaa- tai liikatoiminnan havaitsemisen lisäksi muun muassa sydäninfarktin varhaiseen ja nopeaan toteamiseen.