The role of ubiquitination and deubiquitination in the regulation of BRCA1 function during genotoxic stress

BRCA1 est un suppresseur de tumeur majeur jouant un rôle dans la transcription, la réparation de l’ADN et le maintien de la stabilité génomique. En effet, des mutations dans le gène BRCA1 augmentent considerablement le risque de cancers du sein et de l’ovaire. BRCA1 a été en majorité caractérisé pour son rôle dans la réparation de l’ADN par la voie de recombinaison homologue (HR) en présence de bris double brins, par example, induits par l’irradiation gamma (IR). Cependant, la fonction de BRCA1 dans d’autres voies de réparation de l’ADN, comme la réparation par excision de nucléotides (NER) ou par excision de base (BER), demeurent toutefois obscures. Il est donc important de comprendre la régulation de BRCA1 en présence d’agents génotoxiques comme le méthyle méthanesulfonate (MMS) ou l’UV, qui promouvoient le BER et le NER respectivement. Nos observations suggèrent que BRCA1 est dégradée par le protéasome après traitement avec le MMS ou les UV, et non avec l’IR. Par ailleurs, cette dégradation semble compromettre le recrutement de Rad51, suggérant que la voie de HR est inhibée. Nos résultats suggèrent que la HR est inhibée afin d’éviter l’activation simultanée de multiples voies de réparation. Nous avons aussi observé que la dégradation BRCA1 est réversible et que la restauration des niveaux de BRCA1 coïncide avec le recrutement de Rad51 aux sites de dommages. Cela suggère que la HR est réactivée tardivement par les bris double brins générés suite à l’effondrement des fourches de réplication. Ayant observé que BRCA1 est hautement régulé par l’ubiquitination et est ciblé par le protéasome pour dégradation, nous avons émis une hypothèse que BRCA1 est régulé par des déubiquitinases. Cela amène à caractériser plus en profondeur par un criblage en déplétant les déubiquitinases individuellement par RNAi et en observant leur effet sur le recrutement de BRCA1 et des protéines reliées à cette voie. Un criblage préliminaire nous a permi d’identifié candidats potentiels tel que BAP1, CXORF53, DUB3, OTUB1 et USP36.

Staying under the radar - the multifunctional LANA Protein

Many viruses have developed numerous strategies to recruit and take advantage of cellular protein degradation pathways to evade the cellular viral immune system. One such virus is the Kaposi´s Sarcoma associated herpesvirus (KSHV), first discovered in Kaposi´s Sarcoma lesions found in AIDS patients. Latency-Associated Nuclear Antigen (LANA) is a KSHV multifunctional protein responsible for tethering viral DNA to the chromosome ensuring maintenance and segregation of the viral genome during cell division. Besides its main role of viral maintenance, LANA also physically interacts with several host proteins to modulate cell functions. One such function is to recruit the EC5S ubiquitin-ligase complex by interacting with Elongin BC complex and Cullin 5 protein, which in turn ubiquitinate substrates such as NF-κB and p53 to allow persistent viral infection. Like any other post-translation modifications, ubiquitination is reversible through deubiquitination enzymes (DUBs). LANA also interacts with ubiquitin specific protease 7 (USP7), a deubiquitination enzyme involved in regulation of several proteins including p53. Interaction with USP7 is made through a conserved peptide motif, which is also present in LANA. This work addresses the role of LANA in the recruitment and modulation of the ubiquitination and deubiquitination pathways. Despite the continued efforts in uncovering new LANA interacting partners to form a functional EC5S ubiquitin-ligase complex, only MHV-68 LANA interacted directly with Elongin BC, other interactions were not direct and may require a linker protein. On the other hand, LANA interaction with USP7 was able to be analysed by X-ray structure determination. In addition to a conserved P/AxxS motif, a novel Glutamine (Gln) residue from KSHV LANA was shown to make a specific interaction with USP7. This Gln residue is also present in other herpesvirus protein and hence it might be a conserved motif within herpesviruses.

Molecular analysis of non-melanoma skin cancer

SUMMARY:Cylindroma, trichoepithelioma and spiradenoma are benign tumors of hair follicle. They are caused by mutations and loss of heterozygosity in the CYLD gene. CYLD is a ubiquitously expressed, but the tumors are restricted to skin, suggesting that the tumorigenesis is influenced by skin-specific regulators and probably by mutations in other genes. The objectives of the thesis were to analyze the molecular mechanisms leading to the aforementioned tumors. In the first project, we have identified five new mutations in CYLD gene in tive families affected with different combinations of these skin appendage tumors. F our of these mutations caused the introduction of a premature stop codon in CYLD protein sequence, but one was a missense mutation changing aspartic acid 681 into glycine (D68lG), in patients exhibiting multiple trichoepitheliomas. CYLD is a deubiquitinase which can downregulate NF-κB and INK pathways through the deubiquitination of TRAF2, for example. We showed that the CYLD-D681G mutant was unable to remove polyubiquitin chains from TRAF2. We also proved that CYLD-D68lG could not inhibit TRAP 2- or TNFα- mediated NF-κB or INK activations in 293T cells. These results underlined the importance of the D68l residue for the enzymatic activity of CYLD. TRAP-interacting protein (TRIP), which is a E3-Ubiquitin ligase, is a partner of CYLD. In the second project of the thesis, we studied the function of TRIP in the epidermis. We found that TRIP was a nucleolar protein in cultured human primary keratinocytes (HEK) and HeLa cells, and was detected in the midbody of HeLa cells. Moreover, TRIP expression was shown to be downregulated through a PKC-dependent mechanism before induction of keratinocyte differentiation. We also proved that TRIP was upregulated in basal cell carcinomas. Furthermore, TRIP was found to be important for keratinocyte survival and proliferation through the regulation of the Gl/S transition. Our results suggest that TRIP may be involved in keratinocyte tumorigenesis.RÉSUMÉ :Les cylindromes, trichoépithéliomes et spiradénomes sont des tumeurs bénignes du follicule pileux causées par des mutations et une perte d'hétérozygotie du gène CYLD. CYLD est ubiquitaire mais les tumeurs sont limitées à la peau, suggérant que la tumorigénèse est influencée par des protéines spécifiques de la peau et par des mutations dans d'autres gènes. Les objectifs de la thèse étaient d'2malyser les mécanismes moléculaires aboutissant à la formation de ces tumeurs. Dans le premier projet, cinq nouvelles mutations du gène CYLD ont été identifiées chez cinq familles présentant différentes combinaisons des tumeurs citées ci- dessus. Quatre de ces mutations causaient I' introduction d'un codon stop prématuré dans la séquence protéique, mais une était une mutation «misser1se» changeant l'aspartate 681 en résidu glycine (D68lG) chez des patients présentant des trichoépithéliomes multiples. CYLD est une déubiquitinase qui inhibe les voies de signalisation de NF-κB et JNK, en déubiquitinant notamment TRAF2. Nous avons montré que la protéine mutante CYLD- D68lG ne pouvait pas cliver la chaîne de poly-ubiquitines liée à TRAF2. CYLD-D68lG était aussi incapable d'inhiber l'activation de NF-κB ou de JNK induite par TRAF2 ou TNF-o dans les cellules 293T. Ces résultats ont donc souligné l'impo1tance du résidu D68l pour l'activité de CYLD. «TRAF-interacting protein (TRIP)», qui est une «E3-ubiquitin-ligase», est un partenaire de CYLD. Dans le second proj et de la thèse, nous avons étudié la fonction de TRIP dans l'épidenne. Nous avons montrépque TRIP était nucléolaire dans les cellules HeLa et les kératinocytes primaires humains en culture et était détectée dans le «midbody» des cellules HeLa. Nous avons prouvé que l'ARNm de TRIP était diminué avant l'induction de la différentiation des kératinocytes, par un mécanisme dépendent de la protéine kinase C, tandis qu'il était augmenté dans les carcinomes baso-cellulaires. Nous avons aussi montré que TRIP influençait la prolifération et la survie des kératinocytes en régulant la transition G1/S, Nos résultats suggèrent que TRIP est peut-être impliquée dans la tumorigénèse des kératinocytes. 7

Conservation and developmental expression of ubiquitin isopeptidases in Schistosoma mansoni

Several genes related to the ubiquitin (Ub)-proteasome pathway, including those coding for proteasome subunits and conjugation enzymes, are differentially expressed during the Schistosoma mansoni life cycle. Although deubiquitinating enzymes have been reported to be negative regulators of protein ubiquitination and shown to play an important role in Ub-dependent processes, little is known about their role in S. mansoni . In this study, we analysed the Ub carboxyl-terminal hydrolase (UCHs) proteins found in the database of the parasite’s genome. An in silicoana- lysis (GeneDB and MEROPS) identified three different UCH family members in the genome, Sm UCH-L3, Sm UCH-L5 and SmBAP-1 and a phylogenetic analysis confirmed the evolutionary conservation of the proteins. We performed quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction and observed a differential expression profile for all of the investigated transcripts between the cercariae and adult worm stages. These results were corroborated by low rates of Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC hydrolysis in a crude extract obtained from cercariae in parallel with high Ub conjugate levels in the same extracts. We suggest that the accumulation of ubiquitinated proteins in the cercaria and early schistosomulum stages is related to a decrease in 26S proteasome activity. Taken together, our data suggest that UCH family members contribute to regulating the activity of the Ub-proteasome system during the life cycle of this parasite.

Small-molecule inhibitor of USP7/HAUSP ubiquitin protease stabilizes and activates p53 in cells.

Deregulation of the ubiquitin/proteasome system has been implicated in the pathogenesis of many human diseases, including cancer. Ubiquitin-specific proteases (USP) are cysteine proteases involved in the deubiquitination of protein substrates. Functional connections between USP7 and essential viral proteins and oncogenic pathways, such as the p53/Mdm2 and phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B networks, strongly suggest that the targeting of USP7 with small-molecule inhibitors may be useful for the treatment of cancers and viral diseases. Using high-throughput screening, we have discovered HBX 41,108, a small-molecule compound that inhibits USP7 deubiquitinating activity with an IC(50) in the submicromolar range. Kinetics data indicate an uncompetitive reversible inhibition mechanism. HBX 41,108 was shown to affect USP7-mediated p53 deubiquitination in vitro and in cells. As RNA interference-mediated USP7 silencing in cancer cells, HBX 41,108 treatment stabilized p53, activated the transcription of a p53 target gene without inducing genotoxic stress, and inhibited cancer cell growth. Finally, HBX 41,108 induced p53-dependent apoptosis as shown in p53 wild-type and null isogenic cancer cell lines. We thus report the identification of the first lead-like inhibitor against USP7, providing a structural basis for the development of new anticancer drugs.

The deubiquitinating enzyme AMSH3 is required for intracellular trafficking and vacuole biogenesis in Arabidopsis thaliana.

Ubiquitination, deubiquitination, and the formation of specific ubiquitin chain topologies have been implicated in various cellular processes. Little is known, however, about the role of ubiquitin in the development of cellular organelles. Here, we identify and characterize the deubiquitinating enzyme AMSH3 from Arabidopsis thaliana. AMSH3 hydrolyzes K48- and K63-linked ubiquitin chains in vitro and accumulates both ubiquitin chain types in vivo. amsh3 mutants fail to form a central lytic vacuole, accumulate autophagosomes, and mis-sort vacuolar protein cargo to the intercellular space. Furthermore, AMSH3 is required for efficient endocytosis of the styryl dye FM4-64 and the auxin efflux facilitator PIN2. We thus present evidence for a role of deubiquitination in intracellular trafficking and vacuole biogenesis.

Structural bioinformatics analysis of the family of human ubiquitin-specific proteases

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Rôle de la déubiquitinase BAP1 dans la réponse cellulaire aux dommages à l'ADN

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle central dans divers processus biologiques. Elle peut être contrecarrée par les déubiquitinases (DUBs). "BRCA1-Associated Protein 1" (BAP1) est une déubiquitinase, qui fait partie de complexes multiprotéiques, possèdant une fonction de suppression tumorale ainsi qu'un potentiel anti-métastatique. De plus, BAP1 est phosphorylée suite aux dommages à l’ADN par les kinases ATM/ATR. En nous basant sur ces données, nous avons purifié les protéines associées à BAP1 dans des conditions de stress génotoxique. Bien que la composition du complexe et l’activité DUB semblent inchangées, nous avons pu identifier des changements critiques dans les niveaux et les sites de phosphorylation, confirmant la régulation de BAP1 suite aux dommages à l’ADN. En déplétant BAP1 par ARNi et en utilisant des mutants dominants négatifs, nous avons obtenu des résultats suggèrant que suite au stress génotoxique, cette DUB est requise pour prolonger le point de contrôle en G2/M et ce, en retardant la reprise du cycle cellulaire. D'un autre côté, l'expression de BAP1 dans des cellules cancéreuses qui en sont déficientes restore une ploïdie normale et diminue la fréquence d'aberrations nucléaires, suggérant que cette protéine joue un rôle dans la stabilité génomique. Nos résultats suggèrent fortement que BAP1 joue un rôle dans la réponse des cellules au stress génotoxique et la stabilité génomique. Nos travaux permettront ainsi d’identifier et de caractériser les voies de signalisation cellulaire régulant l’activité et la fonction de BAP1 durant les périodes d’exposition à des agents qui endommagent l’ADN. Les connaissances acquises seront donc d’une valeur tangible pour nôtre compréhension de la mutagenèse induite par des agents carcinogènes, un déterminant clé de la formation des tumeurs.

Mécanismes de régulation du trafic et de l’activité du récepteur GABAB

L’acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du système nerveux central et est impliqué dans diverses pathologies incluant l’épilepsie, l’anxiété, la dépression et la dépendance aux drogues. Le GABA agit sur l’activité neuronale par l’activation de deux types de récepteurs; le canal chlorique pentamérique GABAA et l’hétérodimère obligatoire de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) GABAB. Chacun des récepteurs est responsable de phases distinctes de la réponse cellulaire au GABA. Lors d’une stimulation par le GABA, il est essentiel pour la cellule de pouvoir contrôler le niveau d’activité des récepteurs et au besoin, de limiter leur activation par des mécanismes de désensibilisation et de régulation négative. La désensibilisation nécessite le découplage du récepteur de ses effecteurs, ainsi que sa compartimentation hors de la membrane plasmique dans le but de diminuer la réponse cellulaire à l’agoniste. Les mécanismes de contrôle de l’activité de GABAB semblent anormaux pour un RCPG et sont encore mal moléculairement caractérisés. L’objet de cette thèse est d’étudier la régulation du récepteur GABAB et de sa signalisation par la caractérisation de nouvelles protéines d’interactions étant impliquées dans la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation du récepteur. Une première étude nous a permis d’identifier la protéine NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) comme interagissant avec le récepteur hétérodimérique. Nous avons caractérisé le site d’interaction au niveau du domaine coiled-coil de chacune des deux sous-unités de GABAB et constaté la dépendance de cette interaction au statut de l’activité ATPasique de NSF. Nous avons observé que cette interaction pouvait être dissociée par l’activation de GABAB, induisant la phosphorylation du récepteur par la protéine kinase C (PKC) parallèlement à la désensibilisation du récepteur. L’activation de PKC par le récepteur est dépendante de l’interaction NSF-GABAB, ce qui suggère une boucle de rétroaction entre NSF et PKC. Nous proposons donc un modèle où, à l’état basal, le récepteur interagit avec NSF, lui permettant d’activer PKC en réponse à la stimulation par un agoniste, et où cette activation permet à PKC de phosphoryler le récepteur, induisant sa dissociation de NSF et sa désensibilisation. Nous avons par la suite étudié la dégradation et l’ubiquitination constitutive de GABAB et la régulation de celles-ci par PKC et l’enzyme de déubiquitination USP14 (ubiquitin-specific protease 14). Au niveau basal, le récepteur est ubiquitiné, et présente une internalisation et une dégradation rapide. L’activation de PKC augmente l’ubiquitination à la surface cellulaire et l’internalisation, et accélère la dégradation du récepteur. USP14 est en mesure de déubiquitiner le récepteur suite à l’internalisation, mais accélère aussi la dégradation par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique. Nos résultats suggèrent un mécanisme où l’ubiquitination promeut l’internalisation et où USP14 cible le récepteur ubiquitiné vers un processus de dégradation lysosomale. La troisième étude porte sur la régulation de la densité de récepteurs à la membrane plasmique par la protéine Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Nous avons déterminé que Grb2 interagit avec GABAB1 au niveau de la séquence PEST (riche en proline, glutamate, sérine et thréonine) du domaine carboxyl-terminal, et que cette interaction module l’expression à la surface du récepteur hétérodimérique en diminuant l’internalisation constitutive par un mécanisme encore inconnu. Cette inhibition de l’internalisation pourrait provenir d’une compétition pour le site de liaison de Grb2 à GABAB1, ce site étant dans une région interagissant avec plusieurs protéines impliquées dans le trafic du récepteur, tels le complexe COPI et la sous-unité γ2S du récepteur GABAA (1, 2). En proposant de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant l’activité et l’expression à la membrane du récepteur GABAB par les protéines NSF, PKC, USP14 et Grb2, les études présentées dans cette thèse permettent de mieux comprendre les processus d’internalisation et de dégradation, ainsi que du contrôle de l’activité de GABAB par la désensibilisation, ouvrant la porte à une meilleure compréhension de la signalisation GABAergique.

Regulation of BAP1 tumor suppressor complex by post-translational modifications

Le régulateur transcriptionnel BAP1 est une déubiquitinase nucléaire (DUB) dont le substrat est l’histone H2A modifiée par monoubiquitination au niveau des residus lysines 118 et 119 (K118/K119). Depuis les dernières années, BAP1 emerge comme un gene suppresseur de tumeur majeur. En effet, BAP1 est inactivé dans un plethore de maladies humaines héréditaires et sporadiques. Cependant, malgré l’accumulation significative des connaissances concernant l’occurrence, la pénétrance et l’impact des défauts de BAP1 sur le développement de cancers, ses mécanismes d’action et de régulation restent très peu compris. Cette étude est dédiée à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle du complexe multi-protéique de BAP1 et se présente parmi les premiers travaux décrivant sa régulation par des modifications post-traductionnelles. D’abord, nous avons défini la composition du corps du complexe BAP1 ainsi que ses principaux partenaires d’interaction. Ensuite, nous nous sommes spécifiquement intéressés a investiguer d’avantage deux principaux aspects de la régulation de BAP1. Nous avons d’abord décrit l’inter-régulation entre deux composantes majeures du complexe BAP1, soit HCF-1 et OGT. D’une manière très intéressante, nous avons trouvé que le cofacteur HCF-1 est un important régulateur des niveaux protéiques d’OGT. En retour, OGT est requise pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant sa protéolyse par O-GlcNAcylation, un processus de régulation très important pour le bon fonctionnement de HCF-1. D’autre part, nous avons découvert un mécanisme unique de régulation de BAP1 médiée par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. en effet, UBE2O se caractérise par le fait qu’il s’agit aussi bien d’une ubiquitine conjuratrice et d’une ubiquitine ligase. UBE2O, multi-monoubiquitine BAP1 au niveau de son domaine NLS et promeut son exclusion du noyau, le séquestrant ainsi dans le cytoplasme. De façon importante, nos travaux ont permis de mettre de l’emphase sur le rôle de l’activité auto-catalytique de chacune de ces enzymes, soit l’activité d’auto-déubiquitination de BAP1 qui est requise pour la maintenance de sa localisation nucléaire ainsi que l’activité d’auto-ubiquitination d’UBE2O impliquée dans son transport nucléo-cytoplasmique. De manière significative, nous avons trouvé que des défauts au niveau de l’auto-déubiquitination de BAP1 due à des mutations associées à certains cancers indiquent l’importance d’une propre regulation de cette déubiquitinase pour les processus associés à la suppression de tumeurs.

Biochemical and functional characterization of the tumor suppressors BRCA1 and BAP1

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle majeur dans la régulation d’une multitude de processus cellulaires. Dans cette thèse, je discuterai de la caractérisation de deux protéines, BRCA1 et BAP1, soit deux suppresseurs de tumeurs fonctionnellement reliés. BRCA1, une ubiquitine ligase qui catalyse la liaison de l’ubiquitine à une protéine cible, est mutée dans les cancers du sein et de l'ovaire. Il est bien établi que cette protéine aide à maintenir la stabilité génomique suite à un bris double brin de l’ADN (BDB), et ce, à l’aide d’un mécanisme de réparation bien caractérisé appelé recombinaison homologue. Cependant, les mécanismes de régulation de BRCA1 suite à des stresses génotoxiques n’impliquant pas directement un BDB ne sont pas pleinement élucidés. Nous avons démontré que BRCA1 est régulée par dégradation protéasomale suite à une exposition des cellules à deux agents génotoxiques reconnus pour ne pas directement générer des BDBs, soit les rayons UV, qui provoquent la distorsion de l’hélice d’ADN, et le méthyle méthanesulfonate (MMS), qui entraîne l’alkylation de l’ADN. La dégradation de BRCA1 est réversible et indépendante des kinases associées à la voie des PI3 kinase, soit ATM, ATR et DNA-PK, protéines qui sont rapidement activées par les dommages à l’ADN. Nous proposons que la dégradation de BRCA1 prévienne son recrutement intempestif, ainsi que celui des facteurs qui lui sont associés, à des sites de dommages d’ADN qui ne sont pas des BDBs, et que cette régulation coordonne la réparation de l’ADN. L’enzyme de déubiquitination BAP1 a initialement été identifiée comme une protéine capable d’interagir avec BRCA1 et de réguler sa fonction. Elle est également connue pour sa capacité à se lier avec les protéines du groupe Polycomb, ASXL1 et ASXL2. Cependant, l’importance de ces interactions n’a toujours pas été établie. Nous avons démontré que BAP1 forme deux complexes protéiques mutuellement exclusifs avec ASXL1 et ASXL2. Ces interactions sont critiques pour la liaison de BAP1 à l’ubiquitine ainsi que pour la stimulation de son activité enzymatique envers l’histone H2A. Nous avons également identifié des mutations de BAP1 dérivées de cancers qui empêchent à la fois son interaction avec ASXL1 et AXSL2, et son activité de déubiquitinase, ce qui fournit un lien mécanistique direct entre la déubiquitination de H2A et la tumorigenèse. Élucider les mécanismes de régulation de BRCA1 et BAP1 menera à une meilleure compréhension de leurs rôles de suppresseurs de tumeurs, permettant ainsi d’établir de nouvelles stratégies de diagnostic et traitement du cancer.

Functional studies of the deubiquitinating enzymes USP19, USP4 and UCH-L1

El marcaje de proteínas con ubiquitina, conocido como ubiquitinación, cumple diferentes funciones que incluyen la regulación de varios procesos celulares, tales como: la degradación de proteínas por medio del proteosoma, la reparación del ADN, la señalización mediada por receptores de membrana, y la endocitosis, entre otras (1). Las moléculas de ubiquitina pueden ser removidas de sus sustratos gracias a la acción de un gran grupo de proteasas, llamadas enzimas deubiquitinizantes (DUBs) (2). Las DUBs son esenciales para la manutención de la homeostasis de la ubiquitina y para la regulación del estado de ubiquitinación de diferentes sustratos. El gran número y la diversidad de DUBs descritas refleja tanto su especificidad como su utilización para regular un amplio espectro de sustratos y vías celulares. Aunque muchas DUBs han sido estudiadas a profundidad, actualmente se desconocen los sustratos y las funciones biológicas de la mayoría de ellas. En este trabajo se investigaron las funciones de las DUBs: USP19, USP4 y UCH-L1. Utilizando varias técnicas de biología molecular y celular se encontró que: i) USP19 es regulada por las ubiquitin ligasas SIAH1 y SIAH2 ii) USP19 es importante para regular HIF-1α, un factor de transcripción clave en la respuesta celular a hipoxia, iii) USP4 interactúa con el proteosoma, iv) La quimera mCherry-UCH-L1 reproduce parcialmente los fenotipos que nuestro grupo ha descrito previamente al usar otros constructos de la misma enzima, y v) UCH-L1 promueve la internalización de la bacteria Yersinia pseudotuberculosis.

Endosomal deubiquitinating enzymes control ubiquitination and down-regulation of protease-activated receptor 2

The E3 ubiquitin ligase c-Cbl ubiquitinates the G protein-coupled receptor protease-activated receptor 2 (PAR(2)), which is required for postendocytic sorting of activated receptors to lysosomes, where degradation terminates signaling. The mechanisms of PAR(2) deubiquitination and its importance in trafficking and signaling of endocytosed PAR(2) are unknown. We report that receptor deubiquitination occurs between early endosomes and lysosomes and involves the endosomal deubiquitinating proteases AMSH and UBPY. Expression of the catalytically inactive mutants, AMSH(D348A) and UBPY(C786S), caused an increase in PAR(2) ubiquitination and trapped the receptor in early endosomes, thereby preventing lysosomal trafficking and degradation. Small interfering RNA knockdown of AMSH or UBPY also impaired deubiquitination, lysosomal trafficking, and degradation of PAR(2). Trapping PAR(2) in endosomes through expression of AMSH(D348A) or UBPY(C786S) did not prolong the association of PAR(2) with beta-arrestin2 or the duration of PAR(2)-induced ERK2 activation. Thus, AMSH and UBPY are essential for trafficking and down-regulation of PAR(2) but not for regulating PAR(2) dissociation from beta-arrestin2 or PAR(2)-mediated ERK2 activation.

The role of CYLD in dendritic cell function

Deubiquitination of NF-κB members by CYLD is crucial in controlling the magnitude and nature of cell activation. The naturally occurring CYLD splice variant, devoid of exons 7 and 8, lacks TRAF2 and NEMO binding sites. The role of this splice variant in dendritic cell (DC) function was analyzed using CYLDex7/8 mice, which lack the full-length CYLD (FL-CYLD) transcript and over-express the short splice variant (sCYLD). Bone marrow derived DCs (BMDC) from CYLDex7/8 mice display a hyper-reactive phenotype in vitro and in vivo and have a defect in establishing tolerance using DEC205-mediated antigen targeting to resting DCs. This phenotype was accompanied by an increased nuclear translocation of the IκB molecule Bcl-3, and increased degradation of cytoplasmic p105 in CYLDex7/8 BMDCs after stimulation. This suggests that in contrast to FL-CYLD, sCYLD is a positive regulator of NF-κB activity and its over-expression induces a hyper-reactive phenotype in DCs.

Inhibition of Deubiquitinase Activity and Ubiquitination of Jak2 Blocks Cytokine Signaling and Induces Tumor Cell Apoptosis

The Jak-stat pathway is critical for cellular proliferation and is commonly found to be deregulated in many solid tumors as well as hematological malignancies. Such findings have spurred the development of novel therapeutic agents that specifically inhibit Jak2 kinase, thereby suppressing tumor cell growth. Tyrphostin AG490, the first described Jak2 inhibitor, displays poor pharmacology and requires high concentrations for anti-tumor activities. Our research group screened a small library of AG490 structural analogues and identified WP1130 as a potent inhibitor of Jak2 signaling. However, unlike AG490, WP1130 did not directly inhibit Jak2 kinase activity. Our results show that WP1130 induces rapid ubiquitination and subsequent re-localization of Jak2 into signaling incompetent aggresomes. In addition to Jak2, WP1130 also induces accumulation of other ubiquitinated proteins without inhibiting 20S proteasome activity. Further analysis of the mechanism of action of WP1130 revealed that WP1130 acts as a partly selective DUB inhibitor. It specifically inhibits the deubiquitinase activity of USP9x, USP5, USP14 and UCH37. WP1130 mediated inhibition of tumor-associated DUBs resulted in down-regulation of anti-apoptotic and up-regulation of pro-apoptotic proteins, such as MCL-1 and p53 respectively. Our results demonstrate that chemical modification of a previously described Jak2 inhibitor results in the unexpected discovery of a novel compound which acts as a DUB inhibitor, suppressing Jak-Stat signaling by a novel mechanism.