BAFF production by antigen-presenting cells provides T cell co-stimulation.

The B cell-activating factor from the tumor necrosis factor family (BAFF) is an important regulator of B cell immunity. Recently, we demonstrated that recombinant BAFF also provides a co-stimulatory signal to T cells. Here, we studied expression of BAFF in peripheral blood leukocytes and correlated this expression with BAFF T cell co-stimulatory function. BAFF is produced by antigen-presenting cells (APC). Blood dendritic cells (DC) as well as DC differentiated in vitro from monocytes or CD34+ stem cells express BAFF mRNA. Exposure to bacterial products further up-regulates BAFF production in these cells. A low level of BAFF transcription, up-regulated upon TCR stimulation, was also detected in T cells. Functionally, blockade of endogenous BAFF produced by APC and, to a lesser extent, by T cells inhibits T cell activation. Altogether, this indicates that BAFF may regulate T cell immunity during APC-T cell interactions and as an autocrine factor once T cells have detached from the APC.

Co-Stimulation of PAFR and CD36 Is Required for oxLDL-Induced Human Macrophages Activation

The oxidative process of LDL particles generates molecules which are structurally similar to platelet-activating factor (PAF), and some effects of oxidized LDL (oxLDL) have been shown to be dependent on PAF receptor (PAFR) activation. In a previous study, we showed that PAFR is required for upregulation of CD36 and oxLDL uptake. In the present study we analyzed the molecular mechanisms activated by oxLDL in human macrophages and the contribution of PAFR to this response. Human adherent monocytes/macrophages were stimulated with oxLDL. Uptake of oxLDL and CD36 expression were determined by flow cytometry; MAP kinases and Akt phosphorylation by Western blot; IL-8 and MCP-1 concentration by ELISA and mRNA expression by real-time PCR. To investigate the participation of the PI3K/Akt pathway, G alpha i-coupled protein or PAFR, macrophages were treated with LY294002, pertussis toxin or with the PAFR antagonists WEB2170 and CV3988, respectively before addition of oxLDL. It was found that the addition of oxLDL to human monocytes/macrophages activates the PI3K/Akt pathway which in turn activates the MAPK (p38 and JNK). Phosphorylation of Akt requires the engagement of PAFR and a G alpha i-coupled protein. The upregulation of CD36 protein and the uptake of oxLDL as well as the IL-8 production are dependent on PI3K/Akt pathway activation. The increased CD36 protein expression is dependent on PAFR and G alpha i-coupled protein. Transfection studies using HEK 293t cells showed that oxLDL uptake occurs with either PAFR or CD36, but IL-8 production requires the co-transfection of both PAFR and CD36. These findings show that PAFR has a pivotal role in macrophages response to oxLDL and suggest that pharmacological intervention at the level of PAFR activation might be beneficial in atherosclerosis.

No evidence for association of the CD40, CD40L and BLYS polymorphisms, B-cell co-stimulatory molecules, with Brazilian endemic Plasmodium vivax malaria

Background: Plasmodium vivax is the most prevalent malaria species in Brazil. The parasite-host coevolutionary process can be viewed as an 'arms race', in which adaptive genetic changes in one are eventually matched by alterations in the other. Methods: Following the candidate gene approach we analyzed the CD40, CD40L and BLYS genes that participate in B-cell co-stimulation, for associations with P. vivax malaria. The study sample included 97 patients and 103 controls. We extracted DNA using the extraction and purification commercial kit and identified the following SNPs: 21C.T in the CD40 gene, 2726T.C in the CD40L gene and the 2871C.T in the BLyS gene using PCR-RFLP. We analyzed the genotype and allele frequencies by direct counting. We also compared the observed with the expected genotype frequencies using the Hardy-Weinberg equilibrium. Results: The allele and genotype frequencies for these SNPs did not differ statistically between patient and control groups. Gene-gene interactions were not observed between the CD40 and BLYS and between the CD40L and BLYS genes. Overall, the genes were in Hardy-Weinberg equilibrium. Significant differences were not observed among the frequencies of antibody responses against P. vivax sporozoite and erythrocytic antigens and the CD40 and BLYS genotypes. Conclusions: The results of this study show that, although the investigated CD40, CD40L and BLYS alleles differ functionally, this variation does not alter the functionality of the molecules in a way that would interfere in susceptibility to the disease. The variants of these genes may influence the clinical course rather than simply increase or decrease susceptibility. © Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 2013. All rights reserved.

Polimorfismos dos Genes CD40, CD40L e BLYS, associados na co-estimulação dos Linfócitos B, em indivíduos naturalmente infectados pelo Plasmodium vivax na Amazônia Brasileira

Pós-graduação em Genética - IBILCE

Tityus serrulatus venom and toxins Ts1, Ts2 and Ts6 induce macrophage activation and production of immune mediators

Scorpion envenomation induces a systemic immune response, and neurotoxins of venom act on specific ion channels, modulating neurotransmitter release or activity. However, little is known about the immunomodulatory effects of crude venom from scorpion Tityus serrulatus (TsV) or its toxins (Ts1, Ts2 and Ts6) in combination with lipopolysaccharide (LPS). To investigate the immunomodulatory effects of TsV and its toxins (Ts1, Ts2 and Ts6), J774.1 cells were stimulated with different concentrations (25, 50 and 100 mu g/mL) of venom or toxins pre-stimulated or not with LPS (0.5 mu g/mL). Macrophage cytotoxicity was assessed, and nitric oxide (NO) and cytokine production were analyzed utilizing the culture supernatants. TsV and its toxins did not produce cytotoxic effects. Depending on the concentrations used, TsV, Ts1 and Ts6 stimulated the production of NO, interleukin (IL)-6 and tumor necrosis factor (TNF)-alpha in J774.1 cells, which were enhanced under LPS co-stimulation. However, LPS + Ts2 inhibited NO, IL-6 and TNF-alpha production, and Ts2 alone stimulated the production of IL-10, suggesting an anti-inflammatory activity for this toxin. Our findings are important for the basic understanding of the mechanisms involved in macrophage activation following envenomation: additionally, these findings may contribute to the discovery of new therapeutic compounds to treat immune-mediated diseases. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

In vitro cell activating properties of the composite ribosomal vaccine D53

D53 (RibomuntyR) is a composite vaccine made of immunogenic ribosomes from 4 bacterial species (Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae) associated with a membrane proteoglycan from a non encapsulated strain of Klebsiella pneumoniae. D53 is a potent inducer of interleukin-1 production by mouse BALB/c spleen cells as shown by the C3H/HeJ thymocyte co-stimulation assay. Furthermore D53 triggers DNA synthesis by mouse spleen cells and induces the maturation of B lymphocytes into immunoglobulin secreting cells. Polyclonal B cell activation by D53 was readily achieved in the C3H/HeJ strain which is deficient in its response to E. coli lipopolysaccharide. The proliferative response to D53 was abrogated by removal of B cells from the spleen cell suspension, but it was not altered after depletion of T cells or adherent cells. D53 induced polyclonal B cell activation of spleen cells from athymic nude mice and from CBA/N mice. Each component of D53 induced polyclona B cell activation except ribosomes from Streptococcus pneumoniae. Each triggered Interleukin-1 synthesis except ribosomes from Klebsiella penumoniae. These in vitro properties may account for some of the in vivo immunostimulating properties of this composite vaccine.

Protease-activated receptor 2 signalling promotes dendritic cell antigen transport and T cell activation in vivo

Rapport de synthèse : Le récepteur activé par protéase de type 2 (PAR2) intervient dans l'inflammation dans divers modèles expérimentaux de maladies inflammatoires et auto-immunes, mais le mécanisme par lequel il exerce cette fonction reste mal compris. PAR2 est exprimé sur des cellules endothéliales et immunitaires et a été impliqué dans la différentiation des cellules dendritiques (DC). Avec leur rôle central dans la réponse immune, les DC pourraient jouer un rôle clef, l'activation de PAR2 à leur surface modulant la réponse immune. Des recherches précédentes ont montré que PAR2 a un effet dans le développement et la maturation des DC de moelle osseuse in vitro, ainsi que dans la promotion de la réponse immune en allergie. Dans cette étude, nous avons évalué l'impact in vivo de l'activation de PAR2 sur les DC et les cellules T dans des souris déficientes en PAR2 (KO) en utilisant un peptide agoniste spécifique du PAR2 (AP2). L'activation de PAR2 a augmenté la fréquence de DC matures dans les ganglions lymphatiques 24 heures après l'administration d'AP2 d'une manière significative. En outre, ces DC avaient une expression augmentée des molécules de co-stimulation CD86 et du complexe majeur d'histocompatibilité type 2 (MHC-II). 48 heures après l'injection d'AP2, nous avons également observé une élévation significative des lymphocytes T CD4+ et CD8+ activés, (CD44+CD62-) dans ces ganglions. Des changements dans le profil d'activation des DC et des cellules T n'ont pas été observés au niveau de a rate. L'influence de la signalisation de PAR2 sur le transport d'antigène aux ganglions lymphatiques inguinaux a été évaluée dans le contexte d'hypersensibilité retardée de type IV. Les souris KO sensibilisées par peinture de la peau avec fluorescéine isothyocyanate (FITC) afin d'induire une hypersensibilité retardée avaient un pourcentage diminué de DC FITC+ dans les ganglions lymphatiques 24 heures après l'application du FITC en comparaison avec les souris sauvages avec le même fond génétique (0.47% vs 0.95% des cellules ganglionnaires totales). En conclusion, ces résultats démontrent que la signalisation de PAR2 favorise et renforce la maturation et le transport d'antigène par des DC .vers les ganglions lymphatiques ainsi que l'activation ultérieure des lymphocytes T, et de ce fait fournissent une explication pour l'effet pro inflammatoire de PAR2 dans les modèles animaux d'inflammation. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de modulation du système immun via PAR2 peut s'avérer particulièrement utile pour le développement des vaccins, ainsi que pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques dans le contexte de l'allergie, l'auto-immunité, et les maladies inflammatoires.

The role of APRIL and BAFF in lymphocyte activation.

The TNF family ligands BAFF (also called BLyS) and APRIL regulate lymphocyte survival and activation. BAFF binds to three receptors, BAFF-R, TACI and BCMA, whereas APRIL interacts with TACI, BCMA and proteoglycans. The contribution of BAFF and APRIL to B-cell and plasma-cell survival, CD154 (CD40L)-independent antibody isotype switching, germinal center maintenance, T-dependent and T-independent antibody responses, and T cell co-stimulation are relatively well understood. Constitutive BAFF produced by stromal cells determines the size of the peripheral B cell pool, whereas inducible BAFF produced by myeloid and other cells supports local survival of B lymphocytes and can be associated with development of autoimmunity when deregulated.

The role of dentritic cells in leishmania infection : use of novel DC lines for the development of monoclonal antibodies

Les cellules dendritiques (DCs) sont des cellules multifonctionnelles qui font le lien entre le sytème immunitaire inné et adaptatif chez les mammifères. Il existe plusieurs sous-types de DCs basés sur leurs fonctions et l'endroit où elles se situent dans le corps. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié le rôle de ces cellules face à une infection parasitaire. La Leishmania est un parasite causant une maladie appelée Leishmaniose, maladie endémique de l'Afrique, de l'Asie et de certaines régions de l'Amérique du Sud. Certaines espèces causent des lésions cutanées, alors que d'autres causent des lésions dans les muqueuses ou dans les organes internes. Le système immunitaire répond en générant une réponse inflammatoire qui élimine l'infection. Lors d'une réponse non-inflammatoire (de type cytokines, chemokines), cela va amener à une persistance du parasite sur le long terme. Les DC s'activant en présence du parasite dans la peau, vont le transporter vers un ganglion. A cet endroit, se trouvent différents sous-types de DC qui ont la particularité de présenter l'antigène (spécifique à la Leishmaniose) aux lymphocytes T, ce qui va alors amener à une réponse immunitaire puissante contre le parasite. Nous avons comparé différentes espèces de Leishmaniose dans leur façon d'activer les DC et différents modèles de souris ont été utilisé dans ce but-là. Les souris du type C57BL/6 sont connues pour être résistantes à L. major et sensibles à L. mexicana, alors qu'au contraire, les souris Balb/c sont connues pour être sensibles à ces deux espèces. En utilisant des parasites fluorescents transgéniques, nous avons comparé ces deux espèces de parasites (L. major et L. mexicana) en recherchant quelles cellules elles sont capables d'infecter in-vivo dans un modèle murin. Le rôle général des DC dans une infection à L. major a déjà été décrit. Dans notre étude, nous avons étudié le besoin en DC CD8a+ dans les ganglions afin d'engendrer une réponse face à une infection à L. major. Les souris qui n'ont pas ce sous-type de DC sont beaucoup plus sensibles à l'infection : elles ont des marqueurs inflammatoires plus bas et des lésions plus grandes. Nous avons également remarqué que les DC CD8a+ jouent un rôle crucial dans une phase plus avancée de l'infection. Dans notre laboratoire, nous avons la chance d'avoir une source illimitée de DCs de sous-type CD8a+ provenant d'une souris génétiquement modifiée par nos soin. Grâce à cela, nous avons utilisé ces cellules CD8a+ pour immuniser des rats afin de produire des anticorps monoclonaux ayant des propriétés spécifiques comme l'identification de protéines uniques présentes à la surface des DC et qui ensuite, modulent une réponse immunitaire in-vivo. Nous sommes actuellement en phase de caractérisation de plus de 750 hybridomes générés dans notre laboratoire. - Les cellules dendritiques (DCs) constituent le lien entre le système inné et adaptatif de la réponse immunitaire, car elles sont capables de présenter l'antigène, de donner la co- stimulation et de relâcher des cytokines et chimokines. Au cours de cette thèse, nous avons exploré différentes familles de DC lors d'infections parasitaires, telles que la Leishmaniose, parasite intracellulaire qui infecte les mammifères. La plupart des lésions cutanées résistantes sont caractérisées par une réponse pro-inflammatoire générée par l'IL-12. A l'inverse, pour la forme non résistante, la réponse est générée par l'IL-4 et l'IL-10, dans les modèles murins vulnérables. L'infection avec Lmajor a été caractérisée chez la souris C57BL/6 (Thl) et chez la souris Balb/c (Th2). Chez la souris C57BL/6 la lésion guérit, alors que chez la souris Balb/c, la lésion est au contraire non-cicatrisante. Nous avons comparé l'activation causée dans l'ensemble des DC par différentes espéces de Leishmania, et plus spécifiquement dans les DC CD8a+ présentes dans les ganglions lymphatiques et leur rôle dans la vulnérabilité à L. major. Ces cellules sont spécialisées dans la présentation croisée d'antigènes exogènes par le CMH-I et le haut taux de production d'IL-12 après activation. En utilisant des DC dérivées de moelle osseuse, nous avons constaté que L. guyanensis V+ (transportant un retrovirus) était le plus efficace pour l'activation des DC in-vitro comparé à L. major, L. mexicana et L. guyanensis (V-). Toutefois, in-vivo, les souris infectées avec L. major ont vu la taille de leur ganglions lymphatiques drainants augmentée, 3-6 semaines après l'infection dans les deux espèces de souris (les C57BL/6 résistantes et les Balb/c sensibles). En utilisant un parasite fluorescent transgénique, nous avons trouvé que les souris C57BL/6 sensibles à Lmexicana ont un nombre plus important de cellules Β infectées et un plus petit nombre de DC dérivées des monocytes inflammatoires, comparé au souris infectées avec L. major. Les conséquences de ces observations sont encore à l'étude. Des souris déficientes en CD8ct+DC et CD103+ sont plus sensibles à L. major que les souris WT: leurs lésions sont plus grandes et la charge parasitaire est plus importante. Nous avons généré une chimère de moelles osseuse CD11-DTR et Batf3-/- en mélangeant les moelles de ces deux souris, afin de déterminer le temps après infection où le manque de DC's CD8a+ contribue le plus à l'augmentation de la vulnérabilité chez la souris KO. Ces souris produisent plus d'IgG1 et IgE, font une réponse Th2 plus forte et Thl moins forte. Nous avons constaté que les souris déficientes en DC CD8a+ au début de la réponse immunitaire adaptive (trois semaines après injection) maintiennent un haut taux de lésions de grande taille, semblable à celui des souris chez qui les cellules ont été déplétées avant l'injection. Cela indique que les DC CD8a+ sont nécessaires pour l'efficacité de l'immunité dans la phase chronique de l'infection à L. major. Parallèlement à cela, nous avons aussi commencé une génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre les DC CD8a+ activés en utilisant des souches établies dans notre laboratoire. En partant d'une librairie de 763 hybridomes, nous avons identifié plusieurs clones dignes d'intérêt avec une capacité fonctionnelle à moduler la prolifération et la sécrétion de cytokines des cellules T, ainsi que les molécules de co-stimulation présentes à la surface des DC activées elle-même. - Dendritic cells (DCs) are the bridge between the innate and the adaptive arms of the immune systems. They are professional antigen presentation cells and have important cytokine/chemokine release functions. In this dissertation we have focussed on the study of the different subsets of DCs in parasitic infection immunity. Leishmania are intra-cellular parasites of many different species that infect mammals. Most cutaneous lesions that are self- healing are characterized with a pro-inflammatory response with IL-12 while high levels of cytokines such as IL-4 and IL-10 characterized in susceptible mouse models. In mice L. major infection has been well characterized in C57BL/6 mice (Thl) that form healing lesions while Balb/c mice (Th2) form non-healing lesions. This thesis is focussed on comparing DC activation at large by different strains of Leishmania and more specifically, dLN resident CD8a+ DCs and their role in L. major susceptibility. This subset is specialized in cross- presentation of exogenous antigens in the MHC-I pathway and produce high levels of EL-12. Using bone marrow derived DCs we found that L. guyanensis V+ (carrying a retro-virus) was the most efficient at activating DCs in-vitro. In-vivo however L. major infected mice had the largest dLNs 3-6 weeks after infection in both genetically resistant C57BL/6 and susceptible Balb/c mice. Using transgenic fluorescent parasites, we found that C57BL/6 mice which are susceptible to L. mexicana had more number of infected Β cells and fewer number of infected inflammatory monocyte derived DCs in contrast to L. major infection. Using mice deficient in CD8a+ DCs, we found that these mice were more susceptible to L. major than their WT counterparts. They made larger lesions, had higher parasite burdens, higher levels of Th2 indicating immunolgloblins as measured by higher serie IgE levels and lower CD4+ IFNy+ cells. A mixed bone marrow chimera system of CDllc-DTR and Batf3~'~ was generated to determine the time point at which the lack of CD8a+ DCs most contributes to the increased susceptibility in KO mice. We found that mice depleted of CD8a+ DCs at the advent of the adaptive response (3 weeks after infection) maintained the significantly higher lesion size similar to mice whose cells were depleted from the onset of infection. This indicates that CD8a+ DCs are required for effective immunity in the chronic phase of L. major infection. We also began the generation of a valuable tool of monoclonal antibodies against activated CD8a+ DCs using our in-house DC line. From a library of 763 hybridomas we have identified several interesting clones with a functional ability to modulate Τ cell proliferation and cytokine secretion as well as down-modulating co-stimulatory molecules on activated DC cells themselves.

Molecular insights into T cell activation : study of the TRAF, Bcl10 and Carma 1 proteins

Abstract : Activation of naïve T lymphocytes is essential for the onset of an adaptive immune response against a pathogenic threat. T lymphocytes are activated through the engagement of their highly specific cell surface antigen-receptor (TCR), together with co-stimulatory receptors, by activated antigen-presenting cells that display antigenic peptide fragments from the pathogen that they have detected. Dissection of the mechanisms that modulate TCR- and co-stimulation- induced signals is therefore crucial for the understanding of the molelcular basis of adaptive immune responses. Following antigen-receptor triggering, the Carma1, Bcl10 and Malt1 (CBM) proteins assemble into an oligomeric complex, which is essential for activation of the NF-κB and JNK signaling pathways in lymphocytes. In this work, by using human epithelial and lymphocytic cell lines, we identified the TNF-receptor-associated factor (TRAF) proteins TRAF3 and TRAF7 as new binding partners of Bcl10 and Carma1, respectively. We could show that TRAF3 is required for the proper transcriptional upregulation of IL-2 in activated T cells, and that endogenous TRAF3 is recruited to Bcl10 following TCR engagement. Although the mechanisms used by TRAF3 to modulate the transcriptional activation of the IL-2 promoter are not elucidated, the stimulus-dependent association ofTRAF3 with its direct binding partner Bcl10 suggests that TRAF3 is regulating Bcl10 function in TCR-activated lymphocytes. We also demonstrated that TRAF7 acts as a negative regulator of Carma1-induced NFκB-and AP1-dependent transcription by overexpression in 293T cells. These data suggest that TRAF7 could contribute to the negative regulation of TCR-dependent Carma1 functions. Finally, we showed that Carma1 is processed upon antigen-receptor triggering in B and T cell lines, as well as in primary human CTLs, and that this processing is dependent on the proteolytic activity of Malt1. Collectively, this work contributes to describe new proteins and regulatory mechanisms that modulate CBM-dependent functions in activated lymphocytes. Furthermore, it uncovers new tracks that could lead to a better molecular understanding of the complex interplay between the activatory and inhibitory regulators associated with the CBM complex. Résumé : L'activation des lymphocytes T naifs est une étape essentielle à la mise en place d'une réponse immunitaire adaptative pour combattre une infection. Après la détection d'un pathogène, les cellules présentatrices d'antigènes exposent à leur surface des fragments peptidiques provenant du pathogène, qui activent le récepteur à antigène (TCR) spécifique des lymphocytes T, ainsi que des molécules co-stimulatrices qui contribuent à l'activation complète des lymphocytes T. La caractérisation des mécanismes qui modulent les cascades de signaux émanant du TCR et des récepteurs de co-stimulation est essentielle à la compréhension du fonctionnement moléculaire de la réponse immunitaire adaptative. La ligation du TCR induit la formation d'un complexe oligomérique comprenant les protéines Carma1, Bcl10 et Malt1, qui est essentiel à l'activation des voies de signalisation cellulaires NF-κB et JNK induisant l'activation complète des lymphorctes T. Dans cette étude, à l'aide de lignées de cellules humaines épithéliales et lymphocytaires, nous avons identifié que deux protéines de la famille des TRAF (Tumor Necrosis Factor Receptor-Associated Factor), TRAF3 et TRAF7, s'associent à Bc110 et à Carma1, respectivement. Les TRAFs sont d'importants régulateurs des voies de signalisation dans les cellules du système immunitaire inné et adaptatif. Nous avons démontré que TRAF3 était important pour permettre la transcription de l'interleukine-2 (IL-2) dans les lymphocytes T activés, et que TRAF3 s'associait à Bc110 à la suite de la stimulation du TCR Les mécanismes que TRAF3 utilise pour moduler l'activation du promoteur de l'IL-2 ne sont pas connus, mais l'association de TRAF3 à Bc110 suite à la stimulation du TCR suggère que TRAF3 régule la fonction de Bc110. Nous avons également identifié TRAF7 comme un nouveau régulateur négatif des voies NF-κB et JNK induites par surexpression de la protéine Carma1. Nos données suggèrent que TRAF7 pourrait également contribuer à la régulation négative de la fonction de Carma1 dans les lymphocytes activés. Enfin, nous avons découvert que Carma1 était clivé suite à la stimulation du TCR, et que ce clivage dépendait de l'activité protéolytique de Malt1. Cette étude contribue ainsi à la description de nouvelles protéines et de nouveaux mécanismes qui modulent l'activité du complexe CBM dans les lymphocytes activés, et ouvre la voie à la caractérisation moléculaire de ces nouveaux mécanismes importants pour la régulation de la réponse immunitaire adaptative.

TWEAK can induce cell death via endogenous TNF and TNF receptor 1.

TWEAK is a recently cloned novel member of the TNF ligand family. Here we show that soluble TWEAK is sufficient to induce apoptosis in Kym-1 cells within 18 h. TWEAK-induced apoptosis is indirect and is mediated by the interaction of endogenous TNF and TNF receptor (TNFR)1, as each TNFR1-Fc, neutralizing TNF-specific antibodies and TNFR1-specific Fab fragments efficiently antagonize cell death induction. In addition to this indirect mode of action, co-stimulation of Kym-1 cells with TWEAK enhances TNFR1-mediated cell death induction. In contrast to TNF, TWEAK does only modestly activate NF-kappaB or c-jun N-terminal kinase (JNK) in Kym-1 cells. Although TWEAK binding to Kym-1 cells is easily detectable by flow cytometric analysis, we found neither evidence for expression of the recently identified TWEAK receptor Apo3/TRAMP/wsl/DR3/LARD, nor indications for direct interactions of TWEAK with TNFR. Together, these characteristics of TWEAK-induced signaling in Kym-1 cells argue for the existence of an additional, still undefined non-death domain-containing TWEAK receptor in Kym-1 cells.

Tolerogenic dendritic cells and their role in induction of immune tolerance

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui permettent d'instruire les lymphocytes T, autres cellules de ce système, pour mettre en place une réponse immunitaire adaptée afin de combattre et vaincre une infection. Ces cellules dendritiques vont reconnaître des motifs spécifiquement exprimés par des pathogènes par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à leur surface. En détectant ces molécules, elles vont s'activer et subir diverses modifications pour pouvoir activer les lymphocytes T. Elles vont alors interagir avec les lymphocytes Τ et transférer les informations nécessaires pour que ces cellules s'activent à leur tour et produisent différentes protéines de façon à éliminer le pathogène. En fonction du type de pathogène, les informations transférées entre les cellules dendritiques et les lymphocytes seront différentes de manière à produire la réponse immunitaire la mieux adaptée pour supprimer l'élément infectieux. Dans le corps, les cellules dendritiques circulent continuellement afin de détecter les éléments étrangers. Quand elles reconnaissent une protéine étrangère, elles la phagocytent, c'est-à-dire qu'elles la mangent afin de pouvoir la présenter aux lymphocytes T. Mais quand elles phagocytent un élément étranger, elles peuvent également prendre des éléments du soi, comme par exemple quand elles phagocytent une cellule infectée par un virus. Les cellules dendritiques doivent alors être capables de différentier les molécules du soi et du non-soi de façon à ne pas induire une réponse en présentant un antigène du soi aux lymphocytes T. D'autant plus que lors de leur développement, les lymphocytes Τ qui sont capables de reconnaître le soi sont éliminés mais ce système n'est pas parfait et donc certains lymphocytes Τ auto-reactifs peuvent se trouver dans le corps. Il existe ainsi d'autres mécanismes en périphérie du site de développement pour inhiber ces lymphocytes Τ auto-reactifs. Ce sont les mécanismes de tolérance. Quand les lymphocytes Τ induisent une réponse aux antigènes du soi, cela résulte à des maladies auto-immunes. Dans mon projet de recherche, nous avons travaillé avec des lignées de cellules dendritiques, c'est-à-dire des cellules dendritiques semblables à celles que l'on peut trouver in vivo mais qui sont immortalisées, elles peuvent donc être cultiver et manipuler in vitro. Nous avons génétiquement modifiées ces lignées cellulaires pour qu'elles expriment des molécules immunosuppressives afin d'étudier comment induire une tolérance immunitaire, c'est-à-dire si l'expression de ces molécules permet d'éviter de générer une réponse immunitaire. Pour cela, nous avons utilisé des modèles murins de tumeurs et de maladies auto-immunes. Nous avons démontré que ces lignées de cellules dendritiques peuvent être un grand outil de recherche pour étudier les bénéfices de différentes molécules immuno-modulatrices afin d'induire une tolérance immunitaire à différents antigènes. - Les cellules dendritiques sont responsables de l'induction des réponses immunitaires adaptatives. Suite à une infection microbienne, les cellules dendritiques s'activent, elles induisent l'expression de molécules de costimulation à leur surface, sécrètent des cytokines et induisent la différentiation des cellules Τ effectrices et mémoires. De plus, les cellules dendritiques ont un rôle important dans l'induction et la maintenance de la tolérance immunitaire au niveau du thymus et en périphérie, en induisant l'anergie, la délétion ou la conversion des cellules Τ naïves en cellules régulatrices. Dans notre groupe, une nouvelle lignée de cellules dendritiques appelée MuTu a été crée par la culture de cellules dendritiques tumorales isolées à partir d'une rate d'une souris transgénique, dans laquelle l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP sont sous le contrôle du promoteur CD1 le, et sont ainsi spécifiquement exprimés dans les cellules dendritiques. Ces nouvelles lignées appartiennent au sous-type des cellules dendritiques conventionnelles exprimant CD8a. Elles ont conservé leur capacité d'augmenter l'expression des marqueurs de costimulation à leur surface ainsi que le production de cytokines en réponse à des ligands des récepteurs Toll, ainsi que leur capacité à présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II pour activer la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. En utilisant un système de transduction de lentivirus de seconde génération, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques ont été génétiquement modifiées pour sur-exprimer des molécules immunosuppressives (IL-10, TGFP latent, TGFp actif, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC et CTLA4). Ces lignées permettent d'étudier de manière reproductible le rôle de ces molécules potentiellement tolérogènes sur les réponses immunitaires in vitro et in vivo. Ces lignées potentiellement tolérogènes ont été testées, tout d'abord, in vitro, pour leur capacité à inhiber l'activation des cellules dendritiques, à bloquer la prolifération des cellules Τ ou à modifier leur polarisation. Nos résultats démontrent qu'en réponse à une stimulation, la sur-expression des molécules costimulatrices et la sécrétion de molécules pro- inflammatoires est réduite quand les cellules dendritiques sur-expriment l'IL-10. La sur¬expression de TGFp sous sa forme active induit le développement de cellules régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ et bloque la réponse CD8 cytotoxique tandis que la sur-expression de CTLA4 à la surface des cellules dendritiques inhibe une réponse Thl et induit des lymphocytes Τ anergiques. Ces lignées ont également été utilisées pour étudier l'induction de tolérance in vivo. Tout d'abord, nous avons étudié l'induction de tolérance dans un modèle de développement de tumeurs. En effet, quand les lignées tumorales sont transférées dans les lignées de souris C57BL/6, elles sont reconnues comme du non-soi du à l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP et sont éliminées. Ce mécanisme d'élimination a été étudié en utilisant une lignée de cellules dendritiques modifiée pour exprimer la luciférase et qui a permis de suivre le développement des tumeurs par de l'imagerie in vivo dans des animaux vivants. Ces lignées de cellules dendritiques MuTu sont éliminées dans la souris C57BL/6 par les lymphocytes CD8 et l'action cytotoxique de la perforine. Après plusieurs injections, les cellules dendritiques sur-exprimant CTLA4 ou l'actif TGFp peuvent casser cette réponse immunitaire inhérente aux antigènes de la lignée et induire le développement de la tumeur dans la souris C57BL/6. Le développement tumoral a pu être suivi en mesurant la bioluminescence émise par des cellules dendritiques modifiées pour exprimer à la fois l'actif TGFp et la luciférase. Ces tumeurs ont pu se développer grâce à la mise en place d'un microenvironnement suppressif pour échapper à l'immunité en recrutant des cellules myéloïde suppressives, des lymphocytes CD4 régulateurs et en induisant l'expression d'une molécule inhibitrice PD-1 à la surface des lymphocytes CD8 infiltrant la tumeur. Dans un deuxième temps, ces lignées tolérogènes ont également été testées dans un modèle murin de maladies auto-immunes, appelé l'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE), qui est un modèle pour la sclérose en plaques. L'EAE a été induite dans la souris par le transfert de cellules de ganglions prélevées d'une souris donneuse préalablement immunisée avec une protéine du système nerveux central, la glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG) émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund. La vaccination des souris donneuses et receveuses avec les cellules sur-exprimant l'actif TGFP préalablement chargées avec la protéine MOG bloque l'induction de l'EAE. Nous sommes actuellement en train de définir les mécanismes qui permettent de protéger la souris du développement de la maladie auto-immune. Dans cette étude, nous avons ainsi démontré la possibilité d'induire la tolérance in vivo et in vitro à différents antigènes en utilisant nos nouvelles lignées de cellules dendritiques et en les modifiant pour exprimer des molécules immunosuppressives. En conséquence, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques représentent un outil pour explorer les bénéfices de différentes molécules ayant des propriétés immuno-modulatrices pour manipuler le système immunitaire vers un phénotype tolérogène. - Dendritic cells (DC) are widely recognized as potent inducers of the adaptive immune responses. Importantly, after microbial infections, DC become activated, induce co- stimulation, secrete cytokines and induce effector and memory Τ cells. DC furthermore play an important role in inducing and maintaining central and peripheral tolerance by inducing anergy, deletion or commitment of antigen-specific naïve Τ cells into regulatory Τ cells. In our group, stable MuTu DC lines were generated by culture of splenic DC tumors from transgenic mice expressing the SV40 large Τ oncogene and the GFP under DC-specific CDllc promoter. These transformed DC belong to the CD8a+ conventional DC subtype and have fully conserved their capacity to upregulate co-stimulatory markers and produce cytokines after activation with Toll Like Receptors-ligands, and to present Major Histocompatibility class-I or MHCII-restricted antigens to activate Τ cell expansion and differentiation. Using a second- generation lentiviral transduction system, these newly developed MuTu DC lines were genetically modified to overexpress immunosuppressive molecules (IL-10, latent TGFp, active TGFp, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC and CTLA4). This allows to reproducibly investigate the role of these potentially tolerogenic molecules on in vitro and in vivo immune responses. These potentially tolerogenic DC were tested in vitro for their ability to inhibit DC activation, to prevent Τ cell proliferation and to modify Τ cell polarization. Our results show that the upregulation of costimulatory molecules and the secretion of pro-inflammatory cytokines were reduced upon stimulation of DC overexpressing IL-10. The overexpression of active TGFP induced the development of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and inhibited the cytotoxic CD8 Τ cell response as shown by using the OT-II Τ cell system whereas the surface expression of CTLA-4 on DC prevented the Thl response and prompted an anergic antigen-specific Τ cell response. These MuTu DC lines were also used in vivo in order to study the induction of tolerance. First we addressed the induction of tolerance in a model of tumorogenesis. The adoptively transferred tumor cell lines were cleared in C57BL/6 mice due to the foreign expression of SV40 LargeT and GFP. The mechanism of clearance of MuTu DC line into C57BL/6 mice was investigated by using luciferase-expressing DC line. These DC line allowed to follow, by in vivo imaging, the tumor development in living animals and determined that MuTu DC lines were eliminated in a perforin-mediated CD8 Τ cell dependent and CD4 Τ cell independent response. After multiple injections, DC overexpressing CTLA4 or active TGFp could break the immune response to these inherent antigens and induced DC tumorogenesis in wild type mice. The tumor outgrowth in C57BL/6 mice was nicely observed by double-transduced DC lines to express both luciferase and active TGFp. actTGFp-DC tumor was shown to recruit myeloid-derived suppressor cells, induce CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and induce the expression of the inhibitory receptor PD-1 on tumor- infiltrating CD8+ Τ cells in order to escape tumor immunity. Tolerogenic DC lines were also tested for the induction of tolerance in a murine model of autoimmune disease, the experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for human multiple sclerosis. EAE was induced in C57BL/6 mice by the adoptive transfer of lymph node cells isolated from donor mice previously immunized by a protein specific to the central nervous system, the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in the complete freund adjuvant. The vaccination of donor and recipient mice with MOG-pulsed actTGFP-DC line prevented EAE induction. We are still investigating how the active TGFP protect mice from EAE development. We generated tolerogenic DC lines inducing tolerance in vitro and in vivo. Thereby these MuTu DC lines represent a great tool to explore the benefits of various immuno-modulatory molecules to manipulate the immune system toward a tolerogenic phenotype.

Between Immunology And Tolerance: Controlling Immune Responses Employing Tolerogenic Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most efficient antigen presenting cells, they provide co-stimulation, are able to secrete various proinflammatory cytokines and therefore play a pivotal role in shaping adaptive immune responses. Moreover, they are important for the promotion and maintenance of central and peripheral tolerance through several mechanisms like the induction of anergy or apoptosis in effector T cells or by promoting regulatory T cells. The murine CD8α+ (MuTu) dendritic cell line was previously derived and described in our laboratory. The MuTu cell line has been shown to maintain phenotypical and functional characteristics of endogenous CD8α+ DCs. They are able to cross-present exogenous antigens to CD8+ T cells and produce interleukin (IL-) 12 upon engagement of Toll like receptors. The cell line constitutes an infinite source of homogenous, phenotypically well-defined dendritic cells. This allows us to investigate the role and potential of specific molecules in the induction as well as regulation of immune responses by DCs in a rational and standardized way. In a first project the MuTu dendritic cell line was transduced in order to stably express the immunosuppressive molecules IL-10, IL-35 or the active form of TGF-β (termed IL-10+DC, IL-35+DC or actTGFβ+DC). We investigated the capability of these potentially suppressive or tolerogenic dendritic cell lines to induce immune tolerance and explore the mechanisms behind tolerance induction. The expression of TGF-β by the DC line did not affect the phenotype of the DCs itself. In contrast, IL-10+ and IL-35+DCs were found to exhibit lower expression of co-stimulatory molecules and MHC class I and II, as well as reduced secretion of pro-inflammatory cytokines upon activation. In vitro co-culture with IL-35+, IL10+ or active TGFβ+ DCs interfered with function and proliferation of CD4+ and CD8+ T cells. Furthermore, IL-35 and active TGF-β expressing DC lines induced regulatory phenotype on CD4+ T cells in vitro without or with expression of Foxp3, respectively. In different murine cancer models, vaccination with IL-35 or active TGF-β expressing DCs resulted in faster tumor growth. Interestingly, accelerated tumor growth could be observed when IL-35-expressing DCs were injected into T cell-deficient RAG-/- mice. IL-10expressing DCs however, were found to rather delay tumor growth. Besides the mentioned autocrine effects of IL-35 expression on the DC line itself, we surprisingly observed that the expression of IL-35 or the addition of IL-35 containing medium enhances neutrophil survival and induces proliferation of endothelial cells. Our findings indicate that the cytokine IL-35 might not only be a potent regulator of adaptive immune responses, but it also implies IL-35 to mediate diverse effects on an array of cellular targets. This abilities make IL-35 a promising target molecule not only for the treatment of auto-inflammatory disease but also to improve anti-cancer immunotherapies. Indeed, by applying active TGFβ+ in murine autoimmune encephalitis we were able to completely inhibit the development of the disease, whereas IL-35+DCs reduced disease incidence and severity. Furthermore, the preventive transfer of IL-35+DCs delayed rejection of transplanted skin to the same extend as the combination of IL-10/actTGF-β expressing DCs. Thus, the expression of a single tolerogenic molecule can be sufficient to interfere with the adequate activation and function of dendritic cells and of co-cultured T lymphocytes. The respective mechanisms of tolerance induction seem to be different for each of the investigated molecule. The application of a combination of multiple tolerogenic molecules might therefore evoke synergistic effects in order to overcome (auto-) immunity. In a second project we tried to improve the immunogenicity of dendritic cell-based cancer vaccines using two different approaches. First, the C57BL/6 derived MuTu dendritic cell line was genetically modified in order to express the MHC class I molecule H-2Kd. We hypothesized that the expression of BALB/c specific MHC class I haplotype (H-2Kd) should allow the priming of tumor-specific CD8+ T cells by the otherwise allogeneic dendritic cells. At the same time, the transfer of these H-2Kd+ DCs into BALB/c mice was thought to evoke a strong inflammatory environment that might act as an "adjuvant", helping to overcome tumor induced immune suppression. Using this so called "semi-allogeneic" vaccination approach, we could demonstrate that the delivery of tumor lysate pulsed H-2Kd+ DCs significantly delayed tumor growth when compared to autologous or allogeneic vaccination. However, we were not able to coherently elucidate the cellular mechanisms underlying the observed effect. Second, we generated MuTu DC lines which stably express the pro-inflammatory cytokines IL-2, IL-12 or IL-15. We investigated whether the combination of DC vaccination and local delivery of pro-inflammatory cytokines might enhance tumor specific T cell responses. Indeed, we observed an enhanced T cell proliferation and activation when they were cocultured in vitro with IL-12 or IL-2-expressing DCs. But unfortunately we could not observe a beneficial or even synergistic impact on tumor development when cytokine delivery was combined with semi-allogeneic DC vaccination.

Large T Antigen-Specific Cytotoxic T Cells Protect Against Dendritic Cell Tumors through Perforin-Mediated Mechanisms Independent of CD4 T Cell Help.

Our newly generated murine tumor dendritic cell (MuTuDC) lines, generated from tumors developing in transgenic mice expressing the simian virus 40 large T antigen (SV40LgT) and GFP under the DC specific promoter CD11c, reproduce the phenotypic and functional properties of splenic wild type CD8α(+) conventional DCs. They have an immature phenotype with low co-stimulation molecule expression (CD40, CD70, CD80, and CD86) that is upregulated after activation with toll-like receptor ligands. We observed that after transfer into syngeneic C57BL/6 mice, MuTuDC lines were quickly rejected. Tumors grew efficiently in large T transgene-tolerant mice. To investigate the immune response toward the large T antigen that leads to rejection of the MuTuDC lines, they were genetically engineered by lentiviral transduction to express luciferase and tested for the induction of DC tumors after adoptive transfer in various gene deficient recipient mice. Here, we document that the MuTuDC line was rejected in C57BL/6 mice by a CD4 T cell help-independent, perforin-mediated CD8 T cell response to the SV40LgT without pre-activation or co-injection of adjuvants. Using depleting anti-CD8β antibodies, we were able to induce efficient tumor growth in C57BL/6 mice. These results are important for researchers who want to use the MuTuDC lines for in vivo studies.

Novel therapeutic strategies targeting regulatory T cells and downstream TCR signaling in transplantation

Avec plus de 100000 transplantations d'organes solides (TOS) par année dans le monde, la transplantation d'organes reste actuellement l'un des meilleurs traitements disponibles pour de nombreuses maladies en phase terminale. Bien que les médicaments immunosuppresseurs couramment utilisés soient efficaces dans le contrôle de la réponse immune engendrant le rejet aigu d'une greffe, la survie du greffon à long terme ainsi que la présence d'effets secondaires indésirables restent un enjeu considérable en clinique. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver de nouvelles approches thérapeutiques innovantes permettant de contrôler la réponse immunitaire et ainsi d'améliorer les résultats à long terme. L'utilisation des lymphocytes T régulateurs (Treg), suppresseurs naturels de la réponse inflammatoire, a fait l'objet de nombreuses études ces dix dernières années, et pourrait être considérée comme un moyen intéressant d'améliorer la tolérance immunologique de la greffe. Cependant, l'un des obstacles de l'utilisation des Treg comme agent thérapeutique est leur nombre insuffisant non seulement en conditions normales, mais en particulier lors d'une forte réponse immune avec expansion de cellules immunitaires alloréactives. En raison des limitations techniques connues pour l'induction des Treg ex-vivo ou in vitro, nous avons dédié la première partie du travail de thèse à la détermination de l'efficacité de l'induction des Treg in vivo grâce à l'utilisation d'un complexe protéique IL-2/JES6-1 (IL2c). Nous avons montré que l'expansion des Treg par IL2c permettait d'augmenter la survie du greffon sur un modèle murin de transplantation de peau avec mismatch entre le donneur et le receveur pour le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). De plus, nous avons vu qu'en combinant IL2c à une inhibition à court terme de la voie de co-stimulation CD40L-CD40 (anti-CD154/MRl, administré au moment de la transplantation) pour empêcher l'activation des lymphocytes T, il est possible d'induire une tolérance robuste à long terme. Finalement, nos résultats soulignent l'importance de cibler une voie de co-stimulation bien particulière. En effet, l'utilisation d'IL2c combinée au blocage de la co-stimulation CD28-B7.1/2 (CTLA-4 Ig) n'induit qu'une faible prolongation de la survie de la greffe et n'induit pas de tolérance. L'application chez l'humain des traitements induisant la tolérance dans des modèles expérimentaux murins ou de primates n'a malheureusement pas montré de résultats probants en recherche clinique ; une des principales raisons étant la présence de lymphocytes B et T mémoires provenant du systeme d immunité acquise. C est pourquoi nous avons testé si la combinaison d'IL2c et MR1 améliorait la survie de la greffe dans des souris pré¬sensibilisées. Nous avons trouvé qu'en présence de lymphocytes B et T mémoires alloréactifs, l'utilisation d'IL2c et MR1 permettait une amélioration de la survie de la greffe de peau des souris immunocompétentes mais comparé aux souris receveuses naïves, aucune tolérance n'a pu être induite. Toutefois, l'ajout d'un traitement anti-LFA-1 (permettant de bloquer la circulation des lymphocytes T activées) a permis d'améliorer de manière significative la survie de la greffe. Cependant, le rejet chronique, dû à la présence de lymphocytes B activés/mémoires et la production d'anticorps donneur-spécifiques, n'a pas pu être évité. Cibler l'activation des lymphocytes T est la stratégie immunothérapeutique prépondérente après une TOS. C'est pourquoi dans la deuxième partie de cette thèse nous nous sommes intéressés au système de signalisation d'un récepteur des lymphocytes T qui dépend de la paracaspase Malti en tant que nouvelle stratégie immunosuppressive pour le contrôle des lymphocytes T alloréactifs. Nous avons montré que bien que l'inhibition de la signalisation du lymphocyte T en aval de Malti induise une tolérance envers un greffon de peau avec incompatibilités antigéniques mineures, cela ne permet cependant qu'une régulation partielle de l'alloréponse contre des antigènes du CMH. Nous nous sommes aussi intéressés spécifiquement à l'activité protéolytique de Malti. L'inhibition constitutive de l'activité protéolytique de Malti chez les souris Malti-ki s'est révélée délétère pour l'induction de la tolérance car elle diminue la fonction des Treg et augmente l'alloréactivité des cellules Thl. Cependant, lors de l'utilisation d'un inhibiteur peptidique de l'activité protéase de Malti in vitro, il a été possible d'observer une atténuation de l'alloéactivité des lymphocytes T ainsi qu'un maintien de la population des Treg existants. Ces résultats nous laissent penser que des études plus poussées sur le rôle de la signalisation médiée par Malti seraient à envisager dans le domaine de la transplantation. En résumé, les résultats obtenus durant cette thèse nous ont permis d'élucider certains mécanismes immunologiques propres à de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dont le but est d'induire une tolérance lors de TOS. De plus, ces résultats nous ont permis de souligner l'importance d'utiliser des modèles davantage physiologiques contenant, notamment en tenant compte des lymphocytes B et T mémoires alloréactifs. -- Organ transplantation remains the best available treatment for many forms of end-stage organ diseases, with over 100,000 solid organ transplantations (SOT) occurring worldwide eveiy year. Although the available immunosuppressive (IS) drugs are efficient in controlling acute immune activation and graft rejection, the off-target side effects as well as long-term graft and patient survival remain a challenge in the clinic. Hence, innovative therapeutic approaches are needed to improve long-term outcome across immunological barriers. Based on extensive experimental data obtained over the last decade, it is tempting to consider immunotherapy using Treg; the natural suppressors of overt inflammatory responses, in promoting transplantation tolerance. The first hurdle for the therapeutic use of Treg is their insufficient numbers in non- manipulated individuals, in particular when facing strong immune activation and expanding alloreactive effector cells. Because of the limitations associated with current protocols aiming at ex-vivo expansion or in vitro induction of Treg, the aim of the first part of this thesis was to determine the efficacy of direct in vivo expansion of Treg using the IL-2/JES6- 1 immune complex (IL2c). We found that whilst IL2c mediated Treg expansion alone allowed the prolonged graft survival of fìlli MHC-mismatched skin grafts, its combination with short-term CD40L-CD40 co-stimulation blockade (anti-CD 154/MR1) to inhibit T cell activation administered at the time of transplantation was able to achieve long-term robust tolerance. This study also highlighted the importance of combining Treg based therapies with the appropriate co-stimulation blockade as a combination of IL2c and CD28-B7.1/2 co- stimulation blockade (CTLA-4 Ig) only resulted in slight prolongation of graft survival but not tolerance. The translation of tolerance induction therapies modelled in rodents into non-human primates or into clinical trials has seldom been successful. One main reason being the presence of pre-existing memory T- and B-cells due to acquired immunity in humans versus laboratory animals. Hence, we tested whether IL2c+MRl could promote graft survival in pre-sensitized mice. We found that in the presence of alloreactive memory T- and B-cells, IL2c+MRl combination therapy could prolong MHC-mismatched skin graft survival in immunocompetent mice but tolerance was lost compared to the naïve recipients. The addition of anti-LF A-1 treatment, which prevents the trafficking of memory T cells worked synergistically to significantly further enhance graft survival. However, late rejection mediated by activated/memory B cells and persistent donor-specific alloantibodies still occurred. Immunotherapeutic strategies targeting the activation of T cells are the cornerstone in the current immunosuppressive management after SOT. Therefore, in the next part of this thesis we investigated the paracaspase Malti-dependent T-cell receptor signalling as a novel immunosuppressive strategy to control alloreactive T cells in transplantation. We observed that although the inhibition of Malti downstream T signalling lead to tolerance of a minor H- mismatch skin grafts, it was however not sufficient to regulate alloresponses against MHC mismatches and only prolonged graft survival. Furthermore, we investigated the potential of more selectively targeting the protease activity of Malti. Constitutive inhibition of Malti protease activity in Malti-ki mice was detrimental to tolerance induction as it diminished Treg function and increased Thl alloreactivity. However, when using a small peptide inhibitor of Malti proteolytic activity in vitro, we observed an attenuation of alloreactive T cells and sparing of the pre-existing Treg pool. This indicates that further investigation of the role of Malti signalling in the field of transplantation is required. Collectively, the findings of this thesis provide immunological mechanisms underlying novel therapeutic strategies for the promotion of tolerance in SOT. Moreover, we highlight the importance of testing tolerance induction therapies in more physiological models with pre-existing alloreactive memory T and B cells.