Une nouvelle approche computationnelle pour la découverte des sites de fixation de facteurs de transcription à l’ADN, adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP.

Syndrome du QT long: étude clinique à l’Institut Cardiologique de Montréal et recherche de nouvelles variantes causales par séquençage à haut débit

Le syndrome du QT long congénital (LQTS) est une canalopathie génétique, à l’origine de syncopes et mort subite. Le dépistage génétique identifie des variantes génétiques dans 50-70% des cas, suggérant l’implication d’autres gènes. Nous avons recueilli les caractéristiques des patients avec un LQTS à l’ICM, et recruté 12 patients avec un génotype négatif pour le LQTS pour un séquençage à haut débit des exons afin d’identifier de nouvelles variantes causales. Nous avons développé une approche analytique par étapes : (1) les gènes connus du, (2) les gènes dans des loci identifiés par des études d’association sur le QT, et (3) les gènes montrant la même variante chez plusieurs patients. L’analyse génétique a identifié de nouvelles variantes dans: (1) KCNJ2, ANK2 et AKAP9, et (2) dans NOS1AP. (3) Deux patientes avec des phénotypes semblables présentent la même variante homozygote dans TECRL, un nouveau gène candidat dont le rôle est inconnu.

Typage de la classe génotypique du gène PRDM9 à partir de données de séquençage de Nouvelle Génération

Les positions des évènements de recombinaison s’agrègent ensemble, formant des hotspots déterminés en partie par la protéine à évolution rapide PRDM9. En particulier, ces positions de hotspots sont déterminées par le domaine de doigts de zinc (ZnF) de PRDM9 qui reconnait certains motifs d’ADN. Les allèles de PRDM9 contenant le ZnF de type k ont été préalablement associés avec une cohorte de patients affectés par la leucémie aigüe lymphoblastique. Les allèles de PRDM9 sont difficiles à identifier à partir de données de séquençage de nouvelle génération (NGS), en raison de leur nature répétitive. Dans ce projet, nous proposons une méthode permettant la caractérisation d’allèles de PRDM9 à partir de données de NGS, qui identifie le nombre d’allèles contenant un type spécifique de ZnF. Cette méthode est basée sur la corrélation entre les profils représentant le nombre de séquences nucléotidiques uniques à chaque ZnF retrouvés chez les lectures de NGS simulées sans erreur d’une paire d’allèles et chez les lectures d’un échantillon. La validité des prédictions obtenues par notre méthode est confirmée grâce à analyse basée sur les simulations. Nous confirmons également que la méthode peut correctement identifier le génotype d’allèles de PRDM9 qui n’ont pas encore été identifiés. Nous conduisons une analyse préliminaire identifiant le génotype des allèles de PRDM9 contenant un certain type de ZnF dans une cohorte de patients atteints de glioblastomes multiforme pédiatrique, un cancer du cerveau caractérisé par les mutations récurrentes dans le gène codant pour l’histone H3, la cible de l’activité épigénétique de PRDM9. Cette méthode ouvre la possibilité d’identifier des associations entre certains allèles de PRDM9 et d’autres types de cancers pédiatriques, via l’utilisation de bases de données de NGS de cellules tumorales.

Development of new approaches for the synthesis and decoding of one-bead one-compound cyclic peptide libraries

La plupart des processus cellulaires et biologiques reposent, à un certain niveau, sur des interactions protéine-protéine (IPP). Leur manipulation avec des composés chimiques démontre un grand potentiel pour la découverte de nouveaux médicaments. Malgré la demande toujours croissante en molécules capables d’interrompre sélectivement des IPP, le développement d’inhibiteurs d’IPP est fortement limité par la grande taille de la surface d’interaction. En considérant la nature de cette surface, la capacité à mimer des structures secondaires de protéines est très importante pour lier une protéine et inhiber une IPP. Avec leurs grandes capacités peptidomimétiques et leurs propriétés pharmacologiques intéressan-tes, les peptides cycliques sont des prototypes moléculaires de choix pour découvrir des ligands de protéines et développer de nouveaux inhibiteurs d’IPP. Afin d’exploiter pleinement la grande diversité accessible avec les peptides cycliques, l’approche combinatoire «one-bead-one-compound» (OBOC) est l’approche la plus accessible et puissante. Cependant, l’utilisation des peptides cycliques dans les chimiothèques OBOC est limitée par les difficultés à séquencer les composés actifs après le criblage. Sans amine libre en N-terminal, la dégradation d’Edman et la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) ne peuvent pas être utilisées. À cet égard, nous avons développé de nouvelles approches par ouverture de cycle pour préparer et décoder des chimiothèques OBOC de peptides cycliques. Notre stratégie était d’introduire un résidu sensible dans le macrocycle et comme ancrage pour permettre la linéarisation des peptides et leur largage des billes pour le séquençage par MS/MS. Tout d’abord, des résidus sensibles aux nucléophiles, aux ultraviolets ou au bromure de cyanogène ont été introduits dans un peptide cyclique et leurs rendements de clivage évalués. Ensuite, les résidus les plus prometteurs ont été utilisés dans la conception et le développement d’approches en tandem ouverture de cycle / clivage pour le décodage de chimiothèques OBOC de peptides cycliques. Dans la première approche, une méthionine a été introduite dans le macrocycle comme ancrage pour simultanément permettre l’ouverture du cycle et le clivage des billes par traitement au bromure de cyanogène. Dans la seconde approche, un résidu photosensible a été utilisé dans le macrocycle comme ancrage pour permettre l’ouverture du cycle et le clivage suite à une irradiation aux ultraviolets. Le peptide linéaire généré par ces approches peut alors être efficacement séquencé par MS/MS. Enfin, une chimiothèque OBOC a été préparée et criblée la protéine HIV-1 Nef pour identifier des ligands sélectifs. Le développement de ces méthodologies permttra l’utilisation de composés macrocycliques dans les chimiothèques OBOC et constitue une contribution importante en chimie médicinale pour la découverte de ligands de protéines et le développement d’inhibiteurs d’IPP.

Expression analysis of the AtPHO1 gene family in Arabidopsis thaliana and the involvement of AtPHO1 in the regulation of stomatal movements

Résumé Le transfert du phosphate des racines vers les feuilles s'effectue par la voie du xylème. Il a été précédemment démontré que la protéine AtPHO1 était indispensable au transfert du phosphate dans les vaisseaux du xylème des racines chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Le séquençage et l'annotation du génome d'Arabidopsis ont permis d'identifier dix séquences présentant un niveau de similarité significatif avec le gène AtPHO1 et constituant une nouvelle famille de gène appelé la famille de AtPHO1. Basée sur une étude moléculaire et génétique, cette thèse apporte des éléments de réponse pour déterminer le rôle des membres de ia famille de AtPHO1 chez Arabidopsis, inconnue à ce jour. Dans un premier temps, une analyse bioinformatique des séquences protéiques des membres de la famille de AtPHO1 a révélé la présence dans leur région N-terminale d'un domaine nommé SPX. Ce dernier est conservé parmi de nombreuses protéines impliquées dans l'homéostasie du phosphate chez la levure, renforçant ainsi l'hypothèse que les membres de la famille de AtPHO1 auraient comme AtPHO1 un rôle dans l'équilibre du phosphate dans la plante. En parallèle, la localisation tissulaire de l'expression des gènes AtPHO dans Arabidopsis a été identifiée par l'analyse de plantes transgéniques exprimant le gène rapporteur uidA sous le contrôle des promoteurs respectifs des gènes AtPHO. Un profil d'expression de chaque gène AtPHO au cours du développement de la plante a été obtenu. Une expression prédominante au niveau des tissus vasculaires des racines, des feuilles, des tiges et des fleurs a été observée, suggérant que les gènes AtPHO pourraient avoir des fonctions redondantes au niveau du transfert de phosphate dans le cylindre vasculaire de ces différents organes. Toutefois, plusieurs régions promotrices des gènes AtPHO contrôlent également un profil d'expression GUS non-vasculaire, indiquant un rôle putatif des gènes AtPHO dans l'acquisition ou le recyclage de phosphate dans la plante. Dans un deuxième temps, l'analyse de l'expression des gènes AtPHO durant une carence en phosphate a établi que seule l'expression des gènes AtPHO1, AtPHO1; H1 et AtPHO1; H10 est régulée par cette carence. Une étude approfondie de leur expression en réponse à des traitements affectant l'homéostasie du phosphate dans la plante a ensuite démontré leur régulation par différentes voies de signalisation. Ensuite, une analyse détaillée de la régulation de l'expression du gène AtPHO1; H1O dans des feuilles d'Arabidopsis blessées ou déshydratées a révélé que ce gène constitue le premìer gène marqueur d'une nouvelle voie de signalisation induite par l'OPDA, pas par le JA et dépendante de la protéine COI1. Ces résultats démontrent pour la première fois que l'OPDA et le JA peuvent activer différents gènes via des voies de signalisation dépendantes de COI1. Enfin, cette thèse révèle l'identification d'un nouveau rôle de la protéine AtPHO1 dans la régulation de l'action de l'ABA au cours des processus de fermeture stomatique et de germination des graines chez Arabidopsis. Bien que les fonctions exactes des protéines AtPHO restent à être déterminées, ce travail de thèse suggère leur implication dans la propagation de différents signaux dans la plante via la modulation du potentiel membranaire et/ou l'affectation de la composition en ions des cellules comme le font de nombreux transporteurs ou régulateur du transport d'ions. Summary Phosphate is transferred from the roots to the shoot via the xylem. The requirement for AtPHO1 protein to transfer phosphate to the xylem vessels of the root has been previously demonstrated in Arabidopsis thaliana. The sequencing and the annotation of the Arabidopsis genome had allowed the identification of ten sequences that show a significant level of similarity with the AtPHO1 gene. These 10 genes, of unknown functions, constitute a new gene family called the AtPHO1 gene family. Based on a molecular and genetics study, this thesis reveals some information needed to understand the role of the AtPHO1 family members in the plant Arabidopsis. First, a bioinformatics study revealed that the AtPHO sequences contained, in the N-terminal hydrophilic region, a motif called SPX and conserved among multiple proteins involved in phosphate homeostasis in yeast. This finding reinforces the hypothesis that all AtPHO1 family members have, as AtPHO1, a role in phosphate homeostasis. In parallel, we identified the pattern of expression of AtPHO genes in Arabidopsis via analysis of transgenic plants expressing the uidA reporter gene under the control of respective AtPHO promoter regions. The results exhibit a predominant expression of AtPHO genes in vascular tissues of all organs of the plant, implying that these AtPHO genes could have redundant functions in the transfer of phosphate to the vascular cylinder of various organs. The GUS expression pattern for several AtPHO promoter regions was also detected in non-vascular tissue indicating a broad role of AtPHO genes in the acquisition or in the recycling of phosphate in the plant. In a second step, the analysis of the expression of AtPHO genes during phosphate starvation established that only the expression of the AtPHO1, AtPHO1; H1 and AtPHO1; H10 genes were regulated by Pi starvation. Interestingly, different signalling pathways appeared to regulate these three genes during various treatments affecting Pi homeostasis in the plant. The third chapter presents a detailed analysis of the signalling pathways regulating the expression of the AtPHO1; H10 gene in Arabidopsis leaves during wound and dehydrated stresses. Surprisingly, the expression of AtPHO1; H10 was found to be regulated by OPDA (the precursor of JA) but not by JA itself and via the COI1 protein (the central regulator of the JA signalling pathway). These results demonstrated for the first time that OPDA and JA could activate distinct genes via COI1-dependent pathways. Finally, this thesis presents the identification of a novel role of the AtPHO1 protein in the regulation of ABA action in Arabidopsis guard cells and during seed germination. Although the exact role and function of AtPHO1 still need to be determined, these last findings suggest that AtPHO1 and by extension other AtPHO proteins could mediate the propagation of various signals in the plant by modulating the membrane potential and/or by affecting cellular ion composition, as it is the case for many ion transporters or regulators of ion transport.

Caractérisation et étude d'un élément régulateur du gène codant pour le récepteur à la vasopressine de type 2

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Pierre et Marie Curie, Paris VI, France

Caractérisation clinique et génétique d’une nouvelle forme d’ataxie autosomique récessive dans la population québécoise

Les ataxies autosomiques récessives sont un groupe de troubles neurologiques hétérogènes caractérisés par une incoordination brute des mouvements musculaires impliquant le dysfonctionnement nerveux du cervelet qui coordonne le mouvement. Plusieurs formes héréditaires ont été décrites dont la plus connue : l’ataxie de Friedriech. Dans cette thèse nous rapportons l'identification et la caractérisation d’une nouvelle forme dans la population québécoise. L’ataxie récessive spastique avec leucoencéphalopathie (ARSAL; aussi connue comme l’ataxie autosomique récessive spastique de type 3 (SPAX3); OMIM 611390) est la deuxième ataxie spastique décrite dans la population canadienne française. En effet, près de 50 % de nos cas sont originaires de la région de Portneuf. En 2006, nous avons décrit les caractéristiques cliniques de cette nouvelle forme d’ataxie. Un premier criblage du génome entier, constitué de plus de 500 marqueurs microsatellites, a permis la localisation du locus sur le chromosome 2q33-34. Suite au séquençage de plus de 37 gènes candidats et afin de rétrécir cet intervalle candidat, nous avons utilisé une micro-puce d’ADN constituée de marqueurs SNP «single nucleotide polymorphism» et nous avons identifié un deuxième intervalle candidat de 0.658Mb au locus 2q33 dans lequel se trouvent moins de 9 gènes. L’identification et la caractérisation de ces mutations a nécessité l’utilisation de diverses technologies de pointe. Trois mutations (une délétion et deux réarrangements complexes) dans le gène mitochondrial tRNA-synthetase (MARS2) ont été identifiées dans notre cohorte. Nous émettons l’hypothèse que la nature des mutations complexes est responsable d’un dérèglement de la transcription du gène, ce qui a un impact néfaste sur la fonction mitochondriale et le tissu neuronal.

Caractérisation phénotypique et génotypique d’isolats de Salmonella Typhimurium provenant de porcs sains ou septicémiques

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.

Caractérisation fonctionnelle du gène AP1S1 mutant associé au syndrome de MEDNIK

Dans les cellules eucaryotes, le trafic intracellulaire de nombreuses protéines est assuré par des vésicules de transport tapissées de clathrine. Les complexes adaptateurs de clathrine (AP) sont responsables de l’assemblage de ces vésicules et de la sélection des protéines qui seront transportées. Nous avons étudié cinq familles atteintes du syndrome neurocutané MEDNIK qui est caractérisé par un retard mental, une entéropathie, une surdité, une neuropathie périphérique, de l’icthyose et de la kératodermie. Tous les cas connus de cette maladie à transmission autosomique récessive sont originaires de la région de Kamouraska, dans la province de Québec. Par séquençage direct des gènes candidats, nous avons identifié une mutation impliquant le site accepteur de l’épissage de l’intron 2 du gène codant pour la sous-unité σ1 du complexe AP1 (AP1S1). Cette mutation fondatrice a été retrouvée chez tous les individus atteints du syndrome MEDNIK et altère l’épissage normal du gène, menant à un codon stop prématuré. Afin de valider l’effet pathogène de la mutation, nous avons bloqué la traduction de cette protéine chez le poisson zébré en injectant une séquence d’oligonucléotides antisenses spécifique à AP1S1. À 48 heures après la fertilisation, les larves knock down pour AP1S1 montrent une réduction de la pigmentation, une désorganisation de la structure de l’épiderme et une perturbation du développement moteur. Alors que la surexpression de l’AP1S1 humain dans ce modèle a permis la récupération du phénotype normal, l’expression de l’AP1S1 mutant fut sans effet sur les phénotypes moteurs et cutanés des larves knock down. Les résultats obtenus montrent que la mutation du AP1S1 responsable du syndrome de MEDNIK est associée à une perte de fonction et que la sous-unité σ1 du complexe AP1 joue un rôle crucial dans l’organisation de l’épiderme et le développement de la moelle épinière.

Extraction, purification et caractérisation d’isoformes d’hexokinase du tubercule de pomme de terre (Solanum tuberosum)

L’hexokinase (HK) est la première enzyme du métabolisme des hexoses et catalyse la réaction qui permet aux hexoses d’entrer dans le pool des hexoses phosphates et donc par le fait même la glycolyse. Bien que le glucose soit son principal substrat, cette enzyme peut aussi phosphoryler le mannose et le fructose. Malgré son importance dans le métabolisme primaire, l’HK n’a jamais été purifiée à homogénéité sous forme native. Le but de ce travail était donc de purifier une isoforme d’HK à partir de tubercule de Solanum tuberosum et par la suite de caractériser ses propriétés cinétiques. Bien avant que je commence mon travail, un groupe de recherche avait déjà séparé et partiellement purifié trois isoformes d’HK de S. tuberosum. Un protocole d’extraction était donc disponible, mais l’HK ainsi extraite était peu stable d’où le besoin d’y apporter certaines modifications. En y ajoutant certains inhibiteurs de protéases ainsi qu’en modifiant les concentrations de certains éléments, le tampon d’extraction ainsi modifié a permis d’obtenir un extrait dont l’activité HK était stable pendant au moins 72h après l’extraction, en empêchant la dégradation. À l’aide du tampon d’extraction optimisé et d’une chromatographie sur colonne de butyl sépharose, il a été possible de séparer 4 isoformes d’HKs. Par la suite, une isoforme d’HK (HK1) a été purifiée à l’homogénéité à l’aide de 5 étapes de chromatographie supplémentaires. En plus de caractériser les propriétés cinétiques de cette enzyme, l’analyse de séquençage par MS/MS a permis de l’associer au produit du gène StHK1 de Solanum tuberosum. Avec une activité spécifique de 10.2 U/mg de protéine, il s’agit de l’HK purifiée avec l’activité spécifique la plus élevée jamais rapportée d’un tissu végétal.L’ensemble des informations recueillies lors de la purification de HK1 a ensuite été utilisée pour commencer la purification d’une deuxième isoforme (HK3). Ce travail a permis de donner des lignes directrices pour la purification de cette isoforme et certains résultats préliminaires sur sa caractérisation enzymatique.

Polymorphisme de la capside des papillomavirus appartenant à l’espèce 9 des alphapapillomavirus

Le gène L1 encode pour la protéine majeure de la capside des papillomavirus humains (VPH). L’information relative au polymorphisme de L1 pour les types autres que VPH- 16 est jusqu’ici limitée. Cet ouvrage explore le polymorphisme de L1 en comparant les séquences des types phylogénétiquement apparentés VPH-31, -33, -35 à VPH-16. Des spécimens génitaux recueillis de 732 femmes VIH-séropositives et 323 VIHséronégatives ont été criblés à le recherche d’ADN de VPH par PCR consensus au niveau du gène L1. Les échantillons positifs pour VPH-16 (n=74), -31 (n=74), -33 (n=37) et -35 (n=58) étaient analysés par PCR-séquençage pour la totalité du gène L1. Le nombre de nucléotides substitués pour L1 variait de 19 pour VPH-33 à 52 pour VPH-31. Le rapport du nombre de variantes sur le nombre d’isolats testés était plus élevé pour VPH-31 (56.4%, p=0.05) et VPH-35 (60.3%, p=0.04) comparativement à VPH-16 (40.5%), alors que ce ratio était inférieur pour VPH-33 mais sans différence statistiquement significative (24.3%, p=0.14). La distance entre les variantes était plus grande à l’intérieur des cinq boucles présumément exposées à la surface de la protéine L1 que dans la séquence à l’extérieur (p<0.01) Des variations synonymes étaient observées chez 1.7% (95% CI 1.1- 2.3) des nucléotides intra-boucles et 2.4% (95% CI 1.2-3.7) de ceux extra-boucles. Les variations non-synonymes étaient rencontrées pour 1.8% (95% CI 1.1-2.5) des nucléotides intra-boucles et 0.2% (95% CI 0-0.4) pour les nucléotides extra-boucles. Les ratios dN/dS étaient inférieurs à 1.0 pour les régions extra-boucles et encore davantage pour les régions intra-boucles. Ces résultats suggèrent que les séquences des régions hypervariables de L1 ont été sélectionnées positivement.

Caractérisation des souches de Salmonella Typhimurium responsables de septicémies chez le porc

Depuis quelques années, il y a émergence de souches de Salmonella enterica sérovar Typhimurium multirésistantes causant une septicémie et la mort chez le porc. Ceci constitue un problème majeur pour l’industrie porcine et possiblement pour la santé publique. L’objectif de ce projet était de comparer et de caractériser une souche capable de causer une septicémie chez le porc et une souche commensale, en observant l’interaction avec des cellules épithéliales, des macrophages humains et d’identifier des gènes exprimés par les souches septicémiques et les souches commensales. Tout d’abord, l’infection de cellules épithéliales permet d’observer l’adhérence et l’invasion des bactéries, pour ainsi mettre en évidence la capacité des souches à coloniser le tractus gastro-intestinal. La souche commensale possède un pouvoir d’adhésion supérieur à la souche septicémique. Par la suite, l’infection de macrophages permet de caractériser le niveau de phagocytose et de survie. L’importance de la survie dans les macrophages pourrait permettre de faire un lien avec la septicémie. Toutefois, aucune différence n’est observable dans les conditions qui ont été testé. Ensuite, la technique SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) est utilisée pour capturer des gènes uniques à la souche septicémique et un autre SCOTS est fait pour capturer les gènes spécifiques à la souche commensale. Finalement, les gènes sont clonés, leur spécificité face aux souches est analysé par dot blot et ils sont identifiés par séquençage suivient d’une analyses bioinformatiques. Les gènes identifiés par SCOTS, lors des captures pour la souche septicémique et la souche commensale, se trouvent à être des gènes communs aux Salmonella. Toutefois, la différence de pathologie causée par les deux souches, n’est peut-être pas l’acquisition de nouveaux gènes, mais plutôt une différence d’expression entre les deux souches.

La régulation génique chez Solanum chacoense : de la pollinisation jusqu’à l’embryogenèse

Chez les végétaux supérieurs, l’embryogenèse est une phase clé du développement au cours de laquelle l’embryon établit les principales structures qui formeront la future plante et synthétise et accumule des réserves définissant le rendement et la qualité nutritionnelle des graines. Ainsi, la compréhension des évènements moléculaires et physiologiques menant à la formation de la graine représente un intérêt agronomique majeur. Toutefois, l'analyse des premiers stades de développement est souvent difficile parce que l'embryon est petit et intégré à l'intérieur du tissu maternel. Solanum chacoense qui présente des fleurs relativement grande facilitant l’isolation des ovules, a été utilisée pour l’étude de la biologie de la reproduction plus précisément la formation des gamètes femelles, la pollinisation, la fécondation et le développement des embryons. Afin d'analyser le programme transcriptionnel induit au cours de la structuration de ces étapes de la reproduction sexuée, nous avons mis à profit un projet de séquençage de 7741 ESTs (6700 unigènes) exprimés dans l’ovule à différents stades du développement embryonnaire. L’ADN de ces ESTs a été utilisé pour la fabrication de biopuces d’ADN. Dans un premier temps, ces biopuces ont été utilisé pour comparer des ADNc issus des ovules de chaque stade de développement embryonnaire (depuis le zygote jusqu’au embryon mature) versus un ovule non fécondé. Trois profils d’expression correspondant au stade précoce, intermédiaire et tardive ont été trouvés. Une analyse plus approfondie entre chaque point étudié (de 0 à 22 jours après pollinisation), a permis d'identifier des gènes spécifiques caractérisant des phases de transition spécifiques. Les annotations Fonctionnelles des gènes differentiellement exprimés nous ont permis d'identifier les principales fonctions cellulaires impliquées à chaque stade de développement, révélant que les embryons sont engagés dans des actifs processus de différenciation. Ces biopuces d’ADN ont été par la suite utilisé pour comparer différent types de pollinisation (compatible, incompatible, semi-compatible et inter-espèce) afin d’identifier les gènes répondants à plusieurs stimuli avant l'arrivé du tube pollinique aux ovules (activation à distance). Nous avons pu démontrer que le signal perçu par l’ovaire était différent et dépend de plusieurs facteurs, incluant le type de pollen et la distance parcourue par le pollen dans le style. Une autre analyse permettant la comparaison des différentes pollinisations et la blessure du style nous a permis d’identifier que les programmes génétiques de la pollinisation chevauchent en partie avec ceux du stress. Cela était confirmé en traitant les fleurs par une hormone de stress, méthyle jasmonate. Dans le dernier chapitre, nous avons utilisé ces biopuces pour étudier le changement transcriptionnel d’un mutant sur exprimant une protéine kinase FRK2 impliqué dans l’identité des ovules. Nous avons pu sélectionner plusieurs gènes candidat touchés par la surexpression de cette kinase pour mieux comprendre la voie se signalisation. Ces biopuces ont ainsi servi à déterminer la variation au niveau transcriptionnelle des gènes impliqués lors de différents stades de la reproduction sexuée chez les plantes et nous a permis de mieux comprendre ces étapes.

Étude sur le rôle des mutations de novo dans l’étiologie génétique de la schizophrénie

La schizophrénie est une maladie psychiatrique grave qui affecte approximativement 1 % de la population. Il est clairement établi que la maladie possède une composante génétique très importante, mais jusqu’à présent, les études ont été limitées au niveau de l’identification de facteurs génétiques spécifiquement liés à la maladie. Avec l’avènement des nouvelles avancées technologiques dans le domaine du séquençage de l’ADN, il est maintenant possible d’effectuer des études sur un type de variation génétique jusqu’à présent laissé pour compte : les mutations de novo, c.-à-d. les nouvelles mutations non transmises de manière mendélienne par les parents. Ces mutations peuvent avoir deux origines distinctes : une origine germinale au niveau des gamètes chez les parents ou une origine somatique, donc au niveau embryonnaire directement chez l’individu. L’objectif général de la présente recherche est de mieux caractériser les mutations de novo dans la schizophrénie. Comme le rôle de ces variations est peu connu, il sera également nécessaire de les étudier dans un contexte global au niveau de la population humaine. La première partie du projet consiste en une analyse exhaustive des mutations de novo dans la partie codante (exome) de patients atteints de schizophrénie. Nous avons pu constater que non seulement le taux de mutations était plus élevé qu’attendu, mais nous avons également été en mesure de relever un nombre anormalement élevé de mutations non-sens, ce qui suggère un profil pathogénique. Ainsi, nous avons pu fortement suggérer que les mutations de novo sont des actrices importantes dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. La deuxième partie du projet porte directement sur les gènes identifiés lors de la première partie. Nous avons séquencé ces gènes dans une plus grande cohorte de cas et de contrôles afin d’établir le profil des variations rares pour ces gènes. Nous avons ainsi conclu que l’ensemble des gènes identifiés par les études de mutations de novo possède un profil pathogénique, ce qui permet d’établir que la plupart de ces gènes ont un rôle réel dans la maladie et ne sont pas des artéfacts expérimentaux. De plus, nous avons pu établir une association directe avec quelques gènes qui montrent un profil aberrant de variations rares. La troisième partie du projet se concentre sur l’effet de l’âge paternel sur le taux de mutations de novo. En effet, pour la schizophrénie, il est démontré que l’âge du père est un facteur de risque important. Ainsi, nous avons tenté de caractériser l’effet de l’âge du père chez des patients en santé. Nous avons observé une grande corrélation entre l’âge du père et le taux de mutations germinales et nous avons ainsi pu répertorier certaines zones avec un grand nombre de mutations de novo, ce qui suggère l’existence de zone chaude pour les mutations. Nos résultats ont été parmi les premiers impliquant directement les mutations de novo dans le mécanisme génétique de la schizophrénie. Ils permettent de jeter un nouveau regard sur les réseaux biologiques à l’origine de la schizophrénie en mettant sous les projecteurs un type de variations génétiques longtemps laissé pour compte.

Étude de l’interaction entre le champignon mycorhizien Glomus irregulare et les bactéries du sol

Dans cette étude, nous avons isolé et cultivé des bactéries intimement liées aux spores du champignon mycorhizien Glomus irregulare prélevées dans la rhizosphère de plants d’Agrostis stolonifera L. récoltés dans un sol naturel. Le séquençage des 29 morphotypes isolés a révélé la présence de seulement sept taxons bactériens (Variovorax paradoxus, Microbacterium ginsengiosoli, Sphingomonas sp., Bacillus megaterium, B. simplex, B. cereus et Kocuria rhizophila). Des isolats de chacun de ces sept taxons ont ensuite été cultivés in vitro sur le mycélium de G. irregulare afin d’observer par microscopie leur capacité à croitre et à s’attacher au mycélium en absence d’éléments nutritifs autres que ceux fournis par le champignon. Tous les isolats, sauf B. cereus, ont été capables de bien croitre dans le système expérimental et de s’attacher au mycélium en formant des structures ressemblant à des biofilms sur la surface du champignon. Toutefois, B. simplex formait ces structures plus rapidement, soit en 15 jours, alors que les autres isolats les ont formés après 30 jours (K. rhizophila et B. megaterium) ou 45 jours (V. paradoxus, M. ginsengiosoli et Sphingomonas sp.). D’autre part, la technique PCR-DGGE a permis d’analyser la diversité bactérienne associée aux spores. La diversité des taxons associés aux spores de G. irregulare qu’il a été possible d’isoler et de cultiver in vitro a été nettement moindre que celle qui était présente sur la surface des spores, alors que la biodiversité bactérienne totale du sol a été encore beaucoup plus élevée. Les bactéries associées aux champignons mycorhiziens jouent probablement un rôle important dans la capacité des plantes à résister aux stress biotiques et abiotiques auxquels elles sont soumises.