Lipid peroxidation and generation of hydrogen peroxide in frozen-thawed ram semen supplemented with catalase or Trolox

Semen manipulation and cryopreservation-thaw procedures may accelerate the generation of reactive oxygen species (ROS). Sperm exposure to large amounts of ROS has been shown to cause membrane lipid peroxidation and cellular injury to the sperm. The objective of this study was to overcome the ROS production in frozen-thawed ram semen by the addition of the antioxidants catalase or Trolox to semen following thawing. Frozen-thawed ram semen (100 x 10(6) sperm/straw) was supplemented with PBS (control group), 100 mu g/ml catalase, or 100 mu M Trolox/10(8) sperm (catalase and Trolox being dissolved in PBS) and incubated (37 degrees C) for 5 min. Under the experimental conditions used in this study, the catalase and Trolox antioxidants failed to protect the sperm from the spontaneous production of ROS. However, when lipid peroxidation was induced by iron (FeSO(4)), the addition of Trolox promoted a reduction (P < 0.05) in the formation of TBARS in the semen, compared to the control and catalase semen samples. The generation of TBARS and H(2)O(2) occurred in the extender alone, without the presence of sperm cells. In conclusion, the addition of Trolox to frozen-thawed ram semen could be beneficial as it decreases the production of TBARS when oxidative stress is induced. It is possible that a longer incubation period could lead to different results. The concentration of catalase also needs to be further evaluated. The extender could contribute to the oxidative stress of sperm, as it is a source of ROS during the cryopreservation of semen. (C) 2010 Elsevier B.V. All rights reserved.

Lipid peroxidation and generation of hydrogen peroxide in frozen-thawed ram semen cryopreserved in extenders with antioxidants

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Trehalose and a calcium chelator for ram semen cryopreservation

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Motility and viability of ram sperm cryopreserved in a Tris-egg yolk extender supplemented with anti-oxidants

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Quality characteristics and fertilizing ability of ram sperm subpopulations separated by partition in an aqueous two-phase system

Centrifugal countercurrent distribution (CCCD) in an aqueous two-phase system (TPS) is a resolute technique revealing sperm heterogeneity and for the estimation of the fertilizing potential of a given semen sample. However, separated sperm subpopulations have never been tested for their fertilizing ability yet. Here, we have compared sperm quality parameters and the fertilizing ability of sperm subpopulations separated by the CCCD process from ram semen samples maintained at 20 degrees C or cooled down to 5 degrees C. Total and progressive sperm motility was evaluated by computer-assisted analysis using a CASA system and membrane integrity was evaluated by flow cytometry by staining with CFDA/Pl. The capacitation state, staining with chlortetracycline, and apoptosis-related markers, such as phosphatidylserine (PS) translocation detected with Annexin V. and DNA damage detected by the TUNEL assay, were determined by fluorescence microscopy. Additionally, the fertilizing ability of the fractionated subpopulations was comparative assessed by zona binding assay (ZBA). CCCD analysis revealed that the number of spermatozoa displaying membrane and DNA alterations was higher in samples chilled at 5 degrees C than at 20 degrees C. which can be reflected in the displacement to the left of the CCCD profiles. The spermatozoa located in the central and right chambers (more hydrophobic) presented higher values (P<0.01) of membrane integrity, lower PS translocation (P<0.05) and DNA damage (P<0.001) than those in the left part of the profile, where apoptotic markers were significantly increased and the proportion of viable non-capacitated sperm was reduced. We have developed a new protocol to recover spermatozoa from the CCCD fractions and we proved that these differences were related with the fertilizing ability determined by ZBA, because we found that the number of spermatozoa attached per oocyte was significantly higher for spermatozoa recovered from the central and right chambers, in both types of samples. This is the first time, to our knowledge that sperm recovered from a two-phase partition procedure are used for fertilization assays. These results open up new possibilities for using specific subpopulations of sperm for artificial insemination or in vitro fertilization, not only regarding better sperm quality but also certain characteristics such as subpopulations enriched in spermatozoa bearing X or Y chromosome that we have already isolated or any other feature. (C) 2011 Elsevier B.V. All rights reserved.

Viabilidade e capacitação espermáticas, geração de peróxido de hidrogênio(H2O2) e lipoperoxidação no sêmen ovino adicionado de plasma seminal ou antioxidante após a criopreservação

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Viabilidade e fertilidade de sêmen ovino criopreservado com glicerol e dimetilacetamida acrescido de trealose EDTA

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação de diferentes diluentes na criopreservação de sêmen ovino (Ovis aries)

Durante a criopreservação são inúmeras as alterações sofridas pelas células espermáticas, o que conduz à queda na motilidade e perda da sua viabilidade pós-descongelação. Por este motivo, surge a necessidade de aperfeiçoar os processos de tecnologia do sêmen, principalmente quanto ao uso de diluentes. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade de espermatozóides ovinos, submetidos ao processo de diluição e criopreservação, utilizando-se 3 diluentes (TES, TRIS e PBS) e 3 tempos de equilíbrio (4h, 8h e 12h), sendo o estudo dividido em 9 grupos: TES-4h, TES-8h, TES-12h, TRIS-4h, TRIS-8h, TRIS-12h, PBS-4h, PBS-8h e PBS-12h. Após a colheita, o sêmen foi avaliado macro e microscopicamente, e prédiluído nas soluções TES, TRIS e PBS, no entanto sem a adição dos crioprotetores (Solução A), onde permaneceram por 1h. Posteriormente, o sêmen foi diluído com as soluções TES, TRIS e PBS, já contendo os crioprotetores, novamente avaliado, para então ser envasado, sendo submetido aos diferentes tempos de equilíbrio, e em seguida, congelado. Após a descongelação, foi avaliado a motilidade e o vigor, e após o TTR, a motilidade, o vigor e o desprendimento do acrossoma. Na criopreservação com TRIS, a motilidade e o vigor foram estatisticamente similares (p>0,05) no sêmen congelado com equilíbrio de 4h (17,2% e 1,6), 8h (22,4% e 2,1) e 12h (14,8% e 1,6) (p>0,05). Após o TTR não foi observado diferença estatística (p>0,05) para a motilidade e o vigor em 4h (10,4% e 1,1) e em 12h (10,0% e 1,2) de equilíbrio, porém houve um aumento em 8h (15,6% e 1,6) (p<0,05). Não houve diferença estatística (p>0,05) no índice de desprendimento do acrossoma entre 4h (35,1) e 12h (37,6) de equilíbrio, havendo uma redução nestes índices em 8h (30,4) (p<0,05). Na criopreservação com TES, a motilidade do sêmen congelado com equilíbrio de 4h (24,8%) e 12h (27,6%) foram estatisticamente similares (p>0,05), sendo que o tempo de 8h (40,4%) diferiu estatisticamente dos demais. O vigor foi estatisticamente similar (p>0,05) para o sêmen descongelado com equilíbrio de 4h (2,0), 8h (2,6) e 12h (2,3), não diferindo estatisticamente (p>0,05). Após o TTR não foi observado diferença estatística (p>0,05) para a motilidade em 4h (18,8%) e em 12h (17,4%) de equilíbrio, porém houve um aumento em 8h (29,6%) (p<0,05). Em relação ao vigor e ao desprendimento do acrossoma não houve diferença estatística (p>0,05) em 4h (2,0 e 35,8), 8h (2,1 e 33,4) e 12h (1,8 e 42,2) de equilíbrio. Na criopreservação com o PBS, não foram observados motilidade e vigor após a descongelação. Esses resultados indicam que o diluente à base de TES e o tempo de equilíbrio de 8h mostraram-se mais adequados para a diluição e congelação de sêmen ovino.

Integridade e funcionalidade dos espermatozóides ovinos submetidos à criopreservação após a incorporação de colesterol, desmosterol, ácido oléico-linoléico e alfa-lactoalbumina

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Variabilidade das sub-populações de espermatozóides avaliados pela cinética em sistema computadorizado e combinação de sondas fluorescentes como praâmetro quantitativo do sêmen congelado de ovinos

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ