文昌鱼RACK1基因在胚胎发育中的表达

脊椎动物活化的(蛋白)激酶C受体1(receptor for activated C-kinase 1,RACK1)在胚胎发育过程中起着至关重要的作用.克隆了RACK1基因在青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)中的同源基因AmphiRACK1,对其进行了系统的进化学分析,并研究了该基因在正常胚胎发育过程中和经LiCl处理胚胎发育中的时空表达图式.系统进化学分析结果表明,文昌鱼RACK1位于脊椎动物进化枝的基部.在正常胚胎发育中,AmphiRACK1基因在脑泡、神经管和体节中都有明显的表达.在经LiCl处理的胚胎中,该基因在体节中的分节型表达变模糊,表达下调;在脑泡和神经管中的表达下调甚至消失.此外,在成体文昌鱼的轮器、鳃血管、肝盲囊和肠上皮以及精巢中都检测到AmphiRACK1基因不同程度的表达.

Developmental expression of amphioxus RACK1

Vertebrate RACK1 plays a key role in embryonic development. This paper described the cloning, phylogenetic analysis and developmental expression of AmphiRACK1, the RACK1 homologous gene in amphioxus. Phylogenetic analysis indicated that amphioxus RACK1 wa

Neurochondrin und Rack1 vermitteln die Signalintegration der Proteinkinase A

Die Spezifität und Effizienz zellulärer Signalprozesse wird durch die intrazelluläre Kompartimentierung von Signalmolekülen erreicht. A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) bilden eine Familie aus Gerüstproteinen, die zeitliche und räumliche Lokalisation der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) übernehmen. Die direkte Interaktion wird dabei über die Dimerisierungs- und Dockingdomäne (DD-Domäne) der regulatorischen Untereinheiten von PKA vermittelt. Das charakteristische strukturelle Merkmal bei kanonischen AKAPs ist eine amphipathische Helix. Es existiert allerdings auch eine kleine Gruppe von nicht-kanonischen AKAPs, deren Bindung an die DD-Domäne nicht über eine amphipathische Helix vermittelt wird. In dieser Arbeit wurden die zwei potentiellen nicht-kanonischen AKAPs Neurochondrin (neurite-outgrowth promoting protein) und Rack1 (receptor of activated C-kinase 1) charakterisiert. Neurochondrin, dessen Expression mit dem Neuriten-Wachstum in jungen Neuronen korreliert ist und das vermutlich eine entscheidende Funktion bei der Langzeitpotenzierung im Hippocampus übernimmt, zeigt in SPR-Bindungsstudien eine hochaffine, nanomolare Interaktion mit der R-Untereinheit Typ IIalpha von PKA. Kompetitionsanalysen mit dem AKAP-Disruptor-Peptid Ht 31 und Untersuchungen mit der isolierten DD-Domäne von RIIalpha bestätigen eine spezifische Interaktion. Das nicht-kanonische RII-Bindemotiv von Neurochondrin ist aus zwei Domänen aufgebaut, die einen hohen alpha-helikalen Anteil besitzen, aber keine amphipathische Helix bilden. Peptidbasierte Interaktionsstudien der einzelnen Domänen zeigen dennoch ebenfalls nanomolare Affinitäten zu RIIalpha. Rack1 ist ein etabliertes Gerüstprotein mit einer propellerartigen beta-Faltblattstruktur, für das bereits über 100 verschiedene Interaktionspartner beschrieben werden konnten. Die Integration von Rack1 in unterschiedliche Signalprozesse ist äußerst vielfältig. Um dabei die Spezifität jeder einzelnen Interaktion zu gewährleisten, sind individuelle Bindungsstrategien nötig. Die niedrigaffine Interaktion zur RIbeta-Untereinheit von PKA wird daher über multiple Bindestellen vermittelt. Die DD-Domäne von RIbeta übernimmt dabei eine spezifische Funktion, wie unter anderem durch Kompetitionsanalysen mit dem RI-spezifischen AKAP-Disruptor-Peptid RIAD gezeigt werden konnte. Die einzigartige Struktur der DD-Domäne generiert zudem ein Bindemotiv für Rack1, das Ähnlichkeiten mit der „Rack1 interacting-Domäne“ (RAID) von PDE4D5 aufweist. Sowohl Neurochondrin als auch Rack1 besitzen essenzielle neuronale Funktionen. Daher erweitert die Identifizierung der beiden neuen nicht-kanonischen AKAPs nicht nur die strukturelle Diversität der AKAP-Familie, sondern trägt zudem zum Verständnis der neuronalen Signalintegration von PKA bei.

Proteomic analysis of the influence of the adipocyte secretome on Glioma Gl261 cells

Glioma is the most frequent form of malignant brain tumor in the adults and childhood. There is a global tendency toward a higher incidence of gliomas in highly developed and industrialized countries. Simultaneously obesity is reaching epidemic proportions in such developed countries. It has been highly accepted that obesity may play an important role in the biology of several types of cancer. We have developed an in vitro method for the understanding of the influence of obesity on glioma mouse cells (Gl261). 3T3-L1 mouse pre-adipocytes were induced to the maturity. The conditioned medium was harvested and used into the Gl261 cultures. Using two-dimension electrophoresis it was analyzed the proteome content of Gl261 in the presence of conditioned medium (CGl) and in its absence (NCGl). The differently expressed spots were collected and analyzed by means of mass spectroscopy (MALDI-TOF-MS). Significantly expression pattern changes were observed in eleven proteins and enzymes. RFC1, KIF5C, ANXA2, N-RAP, RACK1 and citrate synthase were overexpressed or only present in the CGl. Contrariwise, STI1, hnRNPs and phosphoglycerate kinase 1 were significantly underexpressed in CGl. Aldose reductase and carbonic anhydrase were expressed only in NCGl. Our results show that obesity remodels the physiological and metabolic behavior of glioma cancer cells. Also, proteins found differently expressed are implicated in several signaling pathways that control matrix remodeling, proliferation, progression, migration and invasion. In general our results support the idea that obesity may increase glioma malignancy, however, some interesting paradox finding were also reported and discussed.

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung neuer A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) im Modellorganismus C. elegans

In dieser Arbeit sollten neue Interaktionspartner der regulatorischen Untereinheit (R-UE) der Proteinkinase A (PKA) und des Modellorganismus C. elegans identifiziert und funktionell charakterisiert werden. Im Gegensatz zu Säugern (vier Isoformen), exprimiert der Nematode nur eine PKA-R-Isoform. Mittels in silico Analysen und so genannten „Pulldown“ Experimenten, wurde insbesondere nach A Kinase Ankerproteinen (AKAP) in C. elegans gesucht. Aus in silico Recherchen resultiert das rgs5 Protein als mögliches Funktionshomolog des humanen AKAP10. Rgs5 enthält eine potenzielle, amphipathische Helix (AS 421-446, SwissProt ID A9Z1K0), die in Peptide-SPOT-Arrays (durchgeführt im Biotechnologie Zentrum in Oslo, AG Prof. K. Taskén) eine Bindung an RI und RII-UE zeigt. Eine ähnliche Lokalisation von rgs5 und hAKAP10 in der Zelle, sowie vergleichende BRET² Studien, weisen auf eine mögliche Funktionshomologie zwischen AKAP10 und rgs5 hin. Die hier durchgeführten Analysen deuten darauf hin, dass es sich bei rgs5 um ein neues, klassisches AKAP mit „RII bindender Domäne“ Motiv im Modellorganismus C. elegans handelt. Basierend auf so genannten „pulldown“ Versuchen können, neben „klassischen“ AKAPs (Interaktion über amphipathische Helices), auch Interaktionspartner ohne typische Helixmotive gefunden werden. Dazu gehört auch RACK1, ein multifunktionales Protein mit 7 WD40 Domänen, das ubiquitär exprimiert wird und bereits mehr als 70 Interaktionspartner in unterschiedlichsten Signalwegen komplexiert (Adams et al., 2011). Durch BRET² Interaktionsstudien und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Analysen konnten hRI und kin2 als spezifische Interaktionspartner von RACK1 verifiziert werden. Untersuchungen zur Identifikation der Interaktionsflächen der beiden Proteine RACK1 und hRI zeigten im BRET² System, dass RACK1 über die WD40 Domänen 1-2 und 6-7 interagiert. Die Analyse unterschiedlicher hRI-Deletionsmutanten deutet auf die DD-Domäne im N-Terminus und zusätzlich auf eine potenzielle BH3 Domäne im C-Terminus des Proteins als Interaktionsfläche mit RACK1 hin. Die Koexpression von hRI BH3 und RACK1 zeigt einen auffälligen ein Phänotyp in Cos7 Zellen. Dieser zeichnet sich unter anderem durch eine Degradation des Zellkerns, DNA Kondensation und eine starke Vakuolisierung aus, was beides als Anzeichen für einen programmierten Zelltod interpretiert werden könnte. Erste Untersuchungen zum Mechanismus des ausgelösten Zelltods deuten auf eine Caspase unabhängige Apoptose (Paraptose) hin und einen bislang unbekannten Funktionsmechanismus der PKA hin.

The plasmodium receptor for activated C kinase protein inhibits Ca(2+) signaling in mammalian cells

Plasmodium falciparum, the most lethal malarial parasite, expresses an ortholog for the protein kinase C (PKC) activator RACK1. However, PKC has not been identified in this parasite, and the mammalian RACK1 can interact with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (InsP3R). Therefore we investigated whether the Plasmodium ortholog PfRACK also can affect InsP3R-mediated Ca(2+) signaling in mammalian cells. GFP-tagged PfRACK and endogenous RACK1 were expressed in a similar distribution within cells. PfRACK inhibited agonist-induced Ca(2+) signals in cells expressing each isoform of the InsP3R, and this effect persisted when expression of endogenous RACK1 was reduced by siRNA. PfRACK also inhibited Ca(2+) signals induced by photorelease of caged InsP3. These findings provide evidence that PfRACK directly inhibits InsP3-mediated Ca(2+) signaling in mammalian cells. Interference with host cell signaling pathways to subvert the host intracellular milieu may be an important mechanism for parasite survival. (C) 2009 Elsevier Inc. All rights reserved.

Impaired beta-adrenoceptor-induced relaxation in small mesenteric arteries from DOCA-salt hypertensive rats is due to reduced K-Ca channel activity

beta-Adrenoceptor (beta-AR)-mediated relaxation plays an important role in the regulation of vascular tone. beta-AR-mediated vascular relaxation is reduced in various disease states and aging. We hypothesized that beta-AR-mediated vasodilatation is impaired in DOCA-salt hypertension due to alterations in the cAMP pathway. beta-AR-mediated relaxation was determined in small mesenteric arteries from DOCA-salt hypertensive and control uninephrectomized (Uni) rats. To exclude nitric oxide (NO) and cyclooxygenase (COX) pathways, relaxation responses were determined in the presence of L-NNA and indomethacin, NO synthase inhibitor and COX inhibitors, respectively. Isoprenaline (ISO)-induced relaxation was reduced in arteries from DOCA-salt compared to Uni rats. Protein kinase A (PKA) inhibitors (H89 or Rp-cAMPS) or adenylyl cyclase inhibitor (SQ22536) did not abolish the difference in ISO-induced relaxation between the groups. Forskolin (adenylyl cyclase activator)-induced relaxation was similar between the groups. The inhibition of IKCa/SKCa channels (TRAM-34 plus UCL1684) or BKCa channels (iberiotoxin) reduced ISO-induced relaxation only in Uni rats and abolished the relaxation differences between the groups. The expression of SKCa channel was decreased in DOCA-salt arteries. The expression of BKCa channel a subunit was increased whereas the expression of BKCa channel p subunit was decreased in DOCA-salt arteries. The expression of receptor for activated C kinase 1 (RACK1), which is a binding protein for BKG, channel and negatively modulates its activity, was increased in DOCA-salt arteries. These results suggest that the impairment of beta-AR-mediated relaxation in DOCA-salt mesenteric arteries may be attributable to altered IKCa/SKCa and/or BKCa channels activities rather than cAMP/PKA pathway. Impaired beta-AR-stimulated BKCa channel activity may be due to the imbalance between its subunit expressions and RACK1 upregulation. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Insulin-like growth factor receptor activity in cancer biology & therapy responses

The Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (IGF-1R) has an essential function in normal cell growth and in cancer progression. However, anti-IGF-1R therapies have mostly been withdrawn from clinical trials owing to a lack of efficacy and predictive biomarkers. IGF-1R activity and signalling in cancer cells is regulated by its C-terminal tail, and in particular, by a motif that encompasses tyrosines 1250 and 1251 flanked by serines 1248 and 1252 (1248- SFYYS-1252). Mutation of Y1250/1251 greatly reduces IGF-1-promoted cell migration, interaction with the scaffolding protein RACK1 in the context Integrin signalling, and IGF- 1R kinase activity. Here we investigated the phosphorylation of the SFYYS motif and characterise the conditions under which this motif may be phosphorylated under. As phosphorylated residues, the SFYYS motif may also serve to recruit interacting proteins to the IGF-1R. To this end we identified a novel IGF-1R interacting partner which requires phosphorylated residues in the SFYYS motif to interact with the IGF-1R. This interaction was found to be IGF-1-dependent, and required the scaffold protein RACK1. The interaction of this binding protein with the IGF-1R likely functions to promote maximal phosphorylation of Shc and ERK in IGF-1-stimulated cell migration, and may be important for IGF-1 signalling in cancer cells. Lastly, we have investigated possible kinases that may confer resistance or sensitivity to the IGF-1R kinase inhibitor BMS-754807. In this screen we identified ATR as a mediator of resistance and showed that suppression or chemical inhibition of ATR synergised with BMS-754807 to reduce colony formation. This work has contributes to our understanding of IGF-1R kinase regulation and signalling and suggests that administration of anti-IGF-1R drugs with ATR inhibitors may have therapeutic benefit.

RGS14 (414)-mediated prevention of an episodic memory loss: a study of molecular mechanism

A large proportion of human populations suffer memory impairments either caused by normal aging or afflicted by diverse neurological and neurodegenerative diseases. Memory enhancers and other drugs tested so far against memory loss have failed to produce therapeutic efficacy in clinical trials and thus, there is a need to find remedy for this mental disorder. In search for cure of memory loss, our laboratory discovered a robust memory enhancer called RGS14(414). A treatment in brain with its gene produces an enduring effect on memory that lasts for lifetime of rats. Therefore, current thesis work was designed to investigate whether RGS14(414) treatment can prevent memory loss and furthermore, explore through biological processes responsible for RGS-mediated memory enhancement. We found that RGS14(414) gene treatment prevented episodic memory loss in rodent models of normal aging and Alzheimer´s disease. A memory loss was observed in normal rats at 18 months of age; however, when they were treated with RGS14(414) gene at 3 months of age, they abrogated this deficit and their memory remained intact till the age of 22 months. In addition to normal aging rats, effect of memory enhancer treatment in mice model of Alzheimer´s disease (AD-mice) produced a similar effect. AD-mice subjected to treatment with RGS14(414) gene at the age of 2 months, a period when memory was intact, showed not only a prevention in memory loss observed at 4 months of age but also they were able to maintain normal memory after 6 months of the treatment. We posit that long-lasting effect on memory enhancement and prevention of memory loss mediated through RGS14(414) might be due to a permanent structural change caused by a surge in neuronal connections and enhanced neuronal remodeling, key processes for long-term memory formation. A neuronal arborization analysis of both pyramidal and non-pyramidal neurons in brain of RGS14(414)-treated rats exhibited robust rise in neurites outgrowth of both kind of cells, and an increment in number of branching from the apical dendrite of pyramidal neurons, reaching to almost three times of the control animals. To further understand of underlying mechanism by which RGS14(414) induces neuronal arborization, we investigated into neurotrophic factors. We observed that RGS14 treatment induces a selective increase in BDNF. Role of BDNF in neuronal arborization, as well as its implication in learning and memory processes is well described. In addition, our results showing a dynamic expression pattern of BDNF during ORM processing that overlapped with memory consolidation further support the idea of the implication of this neurotrophin in formation of long-term memory in RGS-animals. On the other hand, in studies of expression profiling of RGS-treated animals, we have demonstrated that 14-3-3ζ protein displays a coherent relationship to RGS-mediated ORM enhancement. Recent studies have demonstrated that the interaction of receptor for activated protein kinase 1 (RACK1) with 14-3-3ζ is essential for its nuclear translocation, where RACK1-14-3-3ζ complex binds at promotor IV region of BDNF and promotes an increase in BDNF gene transcription. These observations suggest that 14-3-3ζ might regulate the elevated level of BDNF seen in RGS14(414) gene treated animals. Therefore, it seems that RGS-mediated surge in 14-3-3ζ causes elevated BDNF synthesis needed for neuronal arborization and enhanced ORM. The prevention of memory loss might be mediated through a restoration in BDNF and 14-3-3ζ protein levels, which are significantly decreased in aging and Alzheimer’s disease. Additionally, our results demonstrate that RGS14(414) treatment could be a viable strategy against episodic memory loss.

Influence de l’hypoxie dans la régulation du pH et les conséquences dans la progression tumorale et la résistance à la chimiothérapie

Résumé : La formation de métastases s’inscrit comme la finalité d’un processus darwinien dans lequel les cellules tumorales subissent des altérations génétiques et épigénétiques dans l’unique but de préserver un avantage prolifératif. L’environnement hypoxique, caractéristique des tumeurs solides, se révèle comme une pression de sélection et un facteur déterminant dans la progression tumorale. Face à l’hypoxie, une des adaptations majeures des cellules tumorales est le déséquilibre du pH cellulaire qui mène à la formation de métastases et à la résistance à la chimiothérapie. Cette thèse met en lumière de nouveaux liens moléculaires entre l’hypoxie et la régulation du pH dans des contextes d’invasion cellulaire et de chimiorésistance. Les échangeurs d’ions NHE1 et NHE6 sont au cœur de ces études où de nouveaux rôles dans la progression du cancer leur ont été attribués. Premièrement, nous avons observé l’influence de l’hypoxie sur la régulation de NHE1 par p90RSK et les conséquences fonctionnelles de cette interaction dans l’invasion cellulaire par les invadopodes. En conditions hypoxiques, NHE1 est activé par p90RSK résultant en une acidification extracellulaire. En modifiant le pH, NHE1 stimule la formation des invadopodes et la dégradation de la matrice extracellulaire. Ainsi, la phosphorylation de NHE1 par p90RSK en hypoxie apparaît comme un biomarqueur potentiel des cancers métastatiques. Peu étudié, le pH endosomal peut intervenir dans la chimiorésistance mais les mécanismes sont inconnus. Nous avons développé une méthode pour mesurer précisément le pH endosomal par microscopie. Ceci a permis d’illuminer un nouveau mécanisme de résistance induit par l’hypoxie et mettant en vedette l’échangeur NHE6. L’hypoxie favorise l’interaction de NHE6 avec RACK1 à la membrane plasmique empêchant la localisation endosomale de l’échangeur. Cette interaction mène à la séquestration de la doxorubicine dans des endosomes sur-acidifiés. Ces travaux mettent en évidence pour la première fois le rôle du pH endosomal et l’échangeur NHE6 comme des éléments centraux de la chimiorésistance induite par l’hypoxie. Cette thèse renforce donc l’idée voulant que les interactions entre les cellules tumorales et le microenvironnement hypoxique sont le « talon d’Achille » du cancer et la régulation du pH cellulaire est primordiale dans l’adaptation des cellules à l’hypoxie et l’instauration du phénotype malin du cancer. La découverte de nouveaux rôles pro-tumoraux pour NHE1 et NHE6 les placent à l’avant-plan pour le développement de stratégies thérapeutiques orientées contre la formation de métastases et la chimiorésistance.