Overexpression of RNase H partially complements the growth defect of an Escherichia coli delta topA mutant: R-loop formation is a major problem in the absence of DNA topoisomerase I.

Previous biochemical studies have suggested a role for bacterial DNA topoisomerase (TOPO) I in the suppression of R-loop formation during transcription. In this report, we present several pieces of genetic evidence to support a model in which R-loop formation is dynamically regulated during transcription by activities of multiple DNA TOPOs and RNase H. In addition, our results suggest that events leading to the serious growth problems in the absence of DNA TOPO I are linked to R-loop formation. We show that the overexpression of RNase H, an enzyme that degrades the RNA moiety of an R loop, can partially compensate for the absence of DNA TOPO I. We also note that a defect in DNA gyrase can correct several phenotypes associated with a mutation in the rnhA gene, which encodes the major RNase H activity. In addition, we found that a combination of topA and rnhA mutations is lethal.

Les R-loops et leurs conséquences sur l'expression génique chez Escherichia coli.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.

Interaction entre la RNase HI et la RNase E dans le métabolisme des R-loops et la dégradation des ARNms chez Escherichia coli.

Chez la bactérie Escherichia coli, la topoisomérase I et la gyrase représentent deux topoisomérases majeures qui participent à la régulation du surenroulement de l’ADN. Celles-ci sont codées respectivement par les gènes topA et par gyrA et gyrB. Chez les mutants topA, l’excès de surenroulement négatif qui est généré en amont de la polymérase ARN lors de la phase d’élongation de la transcription de l’ADN, entraine la formation de R-loops. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui in vivo sont formés lorsque l’ARN nouvellement transcrit forme un hybride avec le brin d’ADN matrice, le brin d’ADN complémentaire demeurant sous forme simple brin. La RNase HI est une endoribonucléase codée par le gène rnhA. Elle dégrade l’ARN de R-loops, entre autres, pour empêcher l’initiation de la réplication à des sites autres que l’origine normale, oriC. Chez les mutants rnhA, on observe une réplication indépendante de l’origine oriC. Ce type de réplication appelé cSDR, pourrait donc expliquer, du moins en partie, l’inhibition de la croissance de doubles mutants topA rnhA. A l’aide de la mutagenèse au transposon Tn5, il a été possible d’isoler des suppresseurs extragéniques qui permettaient la croissance des doubles mutants topA rnhA. Plusieurs de ces suppresseurs ont le transposon inséré dans le gène codant pour la RNase E, l’endoribonucléase principale impliquée dans la dégradation des ARNms chez E. coli. La majorité des insertions se retrouvent dans la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée dans l’assemblage d’un complexe multiprotéique appelé l’ARN dégradosome. Les résultats obtenus démontrent que ces suppresseurs diminuent le cSDR ainsi que la réponse SOS induite constitutivement en l’absence de la RNase HI. Sachant que la RNase HI est une endoribonucléase tout comme la RNase E, une collaboration entre les deux enzymes suggère que la RNase E pourrait également jouer un rôle potentiel dans le contrôle de la formation des R-loops et bien évidemment de leur retrait au sein de la cellule. À l’opposé, il est possible que la RNase HI puisse avoir comme autre fonction la prise en charge de la maturation et de la dégradation des molécules d’ARNs.

Gene enrichment using antibodies to DNA/RNA hybrids : mapping the ribosomal DNA of slime mold and rat

A novel method for gene enrichment has been developed and applied to mapping the rRNA genes of two eucaryotic organisms. The method makes use of antibodies to DNA/RNA hybrids prepared by injecting rabbits with the synthetic hybrid poly(rA)•poly(dT). Antibodies which cross-react with non-hybrid nucleic acids were removed from the purified IgG fraction by adsorption on columns of DNA-Sepharose, oligo(dT)-cellulose, and poly(rA)-Sepharose. Subsequent purification of the specific DNA/RNA hybrid antibody was carried out on a column of oligo(dT)-cellulose to which poly(rA) was hybridized. Attachment of these antibodies to CNBr-activated Sepharose produced an affinity resin which specifically binds DNA/RNA hybrids.

In order to map the rDNA of the slime mold Dictyostelium discoideum, R-loops were formed using unsheared nuclear DNA and the 178 and 268 rRNAs of this organism. This mixture was passed through a column containing the affinity resin, and bound molecules containing R- loops were eluted by high salt. This purified rDN A was observed directly in the electron microscope. Evidence was obtained that there is a physical end to Dictyostelium rDN A molecules approximately 10 kilobase pairs (kbp) from the region which codes for the 268 rRNA. This finding is consistent with reports of other investigators that the rRNA genes exist as inverse repeats on extra-chromosomal molecules of DNA unattached to the remainder of the nuclear DNA in this organism.

The same general procedure was used to map the rRNA genes of the rat. Molecules of DNA which contained R-loops formed with the 188 and 288 rRNAs were enriched approximately 150- fold from total genomal rat DNA by two cycles of purification on the affinity column. Electron microscopic measurements of these molecules enabled the construction of an R-loop map of rat rDNA. Eleven of the observed molecules contained three or four R-loops or else two R-loops separated by a long spacer. These observations indicated that the rat rRNA genes are arranged as tandem repeats. The mean length of the repeating units was 37.2 kbp with a standard deviation of 1.3 kbp. These eleven molecules may represent repeating units of exactly the same length within the errors of the measurements, although a certain degree of length heterogeneity cannot be ruled out. If significantly shorter or longer repeating units exist, they are probably much less common than the 37.2 kbp unit.

The last section of the thesis describes the production of antibodies to non-histone chromosomal proteins which have been exposed to the ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS). The presence of low concentrations of SDS did not seem to affect either production of antibodies or their general specificity. Also, a technique is described for the in situ immunofluorescent detection of protein antigens in polyacrylamide gels.

Effet de la RNase HI sur l’expression génique et sur le surenroulement de l’ADN chez Escherichia coli

Les R-loops générés durant la transcription sont impliqués dans de nombreuse fonctions incluant la réplication, la recombinaison et l’expression génique tant chez les procaryotes que chez les eucaryotes. Plusieurs études ont montré qu’un excès de supertours négatifs et des séquences riches en bases G induisent la formation de R-loops. Jusqu’à maintenant, nos résultats nous ont permis d’établir un lien direct entre les topoisomérases, le niveau de surenroulement et la formation de R-loops. Cependant, le rôle physiologique des R-loops est encore largement inconnu. Dans le premier article, une étude détaillée du double mutant topA rnhA a montré qu’une déplétion de RNase HI induit une réponse cellulaire qui empêche la gyrase d’introduire des supertours. Il s’agit ici, de la plus forte évidence supportant les rôles majeurs de la RNase HI dans la régulation du surenroulement de l’ADN. Nos résultats ont également montré que les R-loops pouvaient inhiber l’expression génique. Cependant, les mécanismes exacts sont encore mal connus. L’accumulation d’ARNs courts au détriment d’ARNs pleine longueur peut être causée soit par des blocages durant l’élongation de la transcription soit par la dégradation des ARNs pleine longueur. Dans le deuxième article, nous montrons que l’hypersurenroulement négatif peut mener à la formation de R-loops non-spécifiques (indépendants de la séquence nucléotidique). La présence de ces derniers, engendre une dégradation massive des ARNs et ultimement à la formation de protéines tronquées. En conclusion, ces études montrent l’évidence d’un lien étroit entre la RNase HI, la formation des R-loops, la topologie de l’ADN et l’expression génique. De plus, elles attestent de la présence d’un nouvel inhibiteur de gyrase ou d’un mécanisme encore inconnu capable de réguler son activité. Cette surprenante découverte est élémentaire sachant que de nombreux antibiotiques ciblent la gyrase. Finalement, ces études pourront servir également de base à des recherches similaires chez les cellules eucaryotes.

Genetic studies on the role of type IA DNA topoisomerases in DNA metabolism and genome maintenance in Escherichia coli

Le surenroulement de l’ADN est important pour tous les processus cellulaires qui requièrent la séparation des brins de l’ADN. Il est régulé par l’activité enzymatique des topoisomérases. La gyrase (gyrA et gyrB) utilise l’ATP pour introduire des supertours négatifs dans l’ADN, alors que la topoisomérase I (topA) et la topoisomérase IV (parC et parE) les éliminent. Les cellules déficientes pour la topoisomérase I sont viables si elles ont des mutations compensatoires dans un des gènes codant pour une sous-unité de la gyrase. Ces mutations réduisent le niveau de surenroulement négatif du chromosome et permettent la croissance bactérienne. Une de ces mutations engendre la production d'une gyrase thermosensible. L’activité de surenroulement de la gyrase en absence de la topoisomérase I cause l’accumulation d’ADN hyper-surenroulé négativement à cause de la formation de R-loops. La surproduction de la RNase HI (rnhA), une enzyme qui dégrade l’ARN des R-loops, permet de prévenir l’accumulation d’un excès de surenroulement négatif. En absence de RNase HI, des R-loops sont aussi formés et peuvent être utilisés pour déclencher la réplication de l’ADN indépendamment du système normal oriC/DnaA, un phénomène connu sous le nom de « constitutive stable DNA replication » (cSDR). Pour mieux comprendre le lien entre la formation de R-loops et l’excès de surenroulement négatif, nous avons construit un mutant conditionnel topA rnhA gyrB(Ts) avec l’expression inductible de la RNase HI à partir d’un plasmide. Nous avons trouvé que l’ADN des cellules de ce mutant était excessivement relâché au lieu d'être hypersurenroulé négativement en conditions de pénurie de RNase HI. La relaxation de l’ADN a été montrée comme étant indépendante de l'activité de la topoisomérase IV. Les cellules du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) forment de très longs filaments remplis d’ADN, montrant ainsi un défaut de ségrégation des chromosomes. La surproduction de la topoisomérase III (topB), une enzyme qui peut effectuer la décaténation de l’ADN, a corrigé les problèmes de ségrégation sans toutefois restaurer le niveau de surenroulement de l’ADN. Nous avons constaté que des extraits protéiques du mutant topA rnhA gyrB(Ts) pouvaient inhiber l’activité de surenroulement négatif de la gyrase dans des extraits d’une souche sauvage, suggérant ainsi que la pénurie de RNase HI avait déclenché une réponse cellulaire d’inhibition de cette activité de la gyrase. De plus, des expériences in vivo et in vitro ont montré qu’en absence de RNase HI, l’activité ATP-dépendante de surenroulement négatif de la gyrase était inhibée, alors que l’activité ATP-indépendante de cette enzyme demeurait intacte. Des suppresseurs extragéniques du défaut de croissance du triple mutant topA rnhA gyrB(Ts) qui corrigent également les problèmes de surenroulement et de ségrégation des chromosomes ont pour la plupart été cartographiés dans des gènes impliqués dans la réplication de l’ADN, le métabolisme des R-loops, ou la formation de fimbriae. La deuxième partie de ce projet avait pour but de comprendre les rôles des topoisomérases de type IA (topoisomérase I et topoisomérase III) dans la ségrégation et la stabilité du génome de Escherichia coli. Pour étudier ces rôles, nous avons utilisé des approches de génétique combinées avec la cytométrie en flux, l’analyse de type Western blot et la microscopie. Nous avons constaté que le phénotype Par- et les défauts de ségrégation des chromosomes d’un mutant gyrB(Ts) avaient été corrigés en inactivant topA, mais uniquement en présence du gène topB. En outre, nous avons démontré que la surproduction de la topoisomérase III pouvait corriger le phénotype Par- du mutant gyrB(Ts) sans toutefois corriger les défauts de croissance de ce dernier. La surproduction de topoisomérase IV, enzyme responsable de la décaténation des chromosomes chez E. coli, ne pouvait pas remplacer la topoisomérase III. Nos résultats suggèrent que les topoisomérases de type IA jouent un rôle important dans la ségrégation des chromosomes lorsque la gyrase est inefficace. Pour étudier le rôle des topoisomérases de type IA dans la stabilité du génome, la troisième partie du projet, nous avons utilisé des approches génétiques combinées avec des tests de « spot » et la microscopie. Nous avons constaté que les cellules déficientes en topoisomérase I avaient des défauts de ségrégation de chromosomes et de croissance liés à un excès de surenroulement négatif, et que ces défauts pouvaient être corrigés en inactivant recQ, recA ou par la surproduction de la topoisomérase III. Le suppresseur extragénique oriC15::aph isolé dans la première partie du projet pouvait également corriger ces problèmes. Les cellules déficientes en topoisomérases de type IA formaient des très longs filaments remplis d’ADN d’apparence diffuse et réparti inégalement dans la cellule. Ces phénotypes pouvaient être partiellement corrigés par la surproduction de la RNase HI ou en inactivant recA, ou encore par des suppresseurs isolés dans la première partie du projet et impliques dans le cSDR (dnaT18::aph et rne59::aph). Donc, dans E. coli, les topoisomérases de type IA jouent un rôle dans la stabilité du génome en inhibant la réplication inappropriée à partir de oriC et de R-loops, et en empêchant les défauts de ségrégation liés à la recombinaison RecA-dépendante, par leur action avec RecQ. Les travaux rapportés ici révèlent que la réplication inappropriée et dérégulée est une source majeure de l’instabilité génomique. Empêcher la réplication inappropriée permet la ségrégation des chromosomes et le maintien d’un génome stable. La RNase HI et les topoisomérases de type IA jouent un rôle majeur dans la prévention de la réplication inappropriée. La RNase HI réalise cette tâche en modulant l’activité de surenroulement ATP-dependante de la gyrase, et en empêchant la réplication à partir des R-loops. Les topoisomérases de type IA assurent le maintien de la stabilité du génome en empêchant la réplication inappropriée à partir de oriC et des R-loops et en agissant avec RecQ pour résoudre des intermédiaires de recombinaison RecA-dépendants afin de permettre la ségrégation des chromosomes.

Interactions of G-quadruplex binders and Topoisomerase I inhibitors in cancer cells

Top1-DNA cleavage complexes (Top1ccs) trigger an accumulation of antisense RNAPII transcripts specifically at active divergent CpG-island promoters in a replication independent and Top1 dependent manner, leading to transcription-dependent genome instability and altered transcription regulation. Using different cancer cell lines of colon and osteo origins, we show that they display different sensitivity to CPT and G4 binder that is independent from Top1 level. To look at the interactions between Top1 and G4, we show that co-treatment with G4 binders potentiate the cell cytotoxicity of CPT regardless of the treatment sequences. Potentiation is indicated by a reduced inhibition concentration (IC50) with a more profound cytotoxicity in CPT-resistant cell lines, HCT15 and U2OS, hence, indicating an interaction between Top1inhibitor and G4 binders. Moreover, computational analysis confirmed the present of G4 motifs in genes with CPT-induced antisense transcription. G4 motifs are present mostly 5000 bp upstream from transcription start site and notably lower in genes. Comparisons between genes with no antisense transcription and genes with antisense transcription show that G4 motifs in this region are notably lower in the genes with antisense transcripts. Since CPT increases negative supercoils at promoters of intermediate activity, the formation of G4 is also increased in CPT-treated cells. Suprisingly, formation of G4 is regulated in parallel to the transient stabilization of R-loops, indicating a role in response to CPT-induced stress. G4 formation is highly elevated in Pyridostatin treated cells, which previous study shows increased formation of γH2Ax foci. This effect is also seen in the CPT-resistant cell lines, HCT15, indicating that the formation is a general event in response to CPT. We also show that R-loop formation is greatly increased in Pyridostatin treated cells. In order to study the role of R-loops and G4 structures in Top1cc-dependant repair pathway, we inhibited tyrosyl-phosphodiestrase 1 (TDP-1) using a TDP-1 inhibitor.

Natural compounds Camptothecin and Triptolide: highly specific enzyme inhibitors and tools to dissect transcriptional functions

With this work I elucidated new and unexpected mechanisms of two strong and highly specific transcription inhibitors: Triptolide and Campthotecin. Triptolide (TPL) is a diterpene epoxide derived from the Chinese plant Trypterigium Wilfoordii Hook F. TPL inhibits the ATPase activity of XPB, a subunit of the general transcription factor TFIIH. In this thesis I found that degradation of Rbp1 (the largest subunit of RNA Polymerase II) caused by TPL treatments, is preceded by an hyperphosphorylation event at serine 5 of the carboxy-terminal domain (CTD) of Rbp1. This event is concomitant with a block of RNA Polymerase II at promoters of active genes. The enzyme responsible for Ser5 hyperphosphorylation event is CDK7. Notably, CDK7 downregulation rescued both Ser5 hyperphosphorylation and Rbp1 degradation triggered by TPL. Camptothecin (CPT), derived from the plant Camptotheca acuminata, specifically inhibits topoisomerase 1 (Top1). We first found that CPT induced antisense transcription at divergent CpG islands promoter. Interestingly, by immunofluorescence experiments, CPT was found to induce a burst of R loop structures (DNA/RNA hybrids) at nucleoli and mitochondria. We then decided to investigate the role of Top1 in R loop homeostasis through a short interfering RNA approach (RNAi). Using DNA/RNA immunoprecipitation techniques coupled to NGS I found that Top1 depletion induces an increase of R loops at a genome-wide level. We found that such increase occurs on the entire gene body. At a subset of loci R loops resulted particularly stressed after Top1 depletion: some of these genes showed the formation of new R loops structures, whereas other loci showed a reduction of R loops. Interestingly we found that new peaks usually appear at tandem or divergent genes in the entire gene body, while losses of R loop peaks seems to be a feature specific of 3’ end regions of convergent genes.

Engineering Computational Emotion - A Reference Model for Emotion in Artificial Systems

Emotion is generally argued to be an influence on the behavior of life systems, largely concerning flexibility and adaptivity. The way in which life systems acts in response to a particular situations of the environment, has revealed the decisive and crucial importance of this feature in the success of behaviors. And this source of inspiration has influenced the way of thinking artificial systems. During the last decades, artificial systems have undergone such an evolution that each day more are integrated in our daily life. They have become greater in complexity, and the subsequent effects are related to an increased demand of systems that ensure resilience, robustness, availability, security or safety among others. All of them questions that raise quite a fundamental challenges in control design. This thesis has been developed under the framework of the Autonomous System project, a.k.a the ASys-Project. Short-term objectives of immediate application are focused on to design improved systems, and the approaching of intelligence in control strategies. Besides this, long-term objectives underlying ASys-Project concentrate on high order capabilities such as cognition, awareness and autonomy. This thesis is placed within the general fields of Engineery and Emotion science, and provides a theoretical foundation for engineering and designing computational emotion for artificial systems. The starting question that has grounded this thesis aims the problem of emotion--based autonomy. And how to feedback systems with valuable meaning has conformed the general objective. Both the starting question and the general objective, have underlaid the study of emotion, the influence on systems behavior, the key foundations that justify this feature in life systems, how emotion is integrated within the normal operation, and how this entire problem of emotion can be explained in artificial systems. By assuming essential differences concerning structure, purpose and operation between life and artificial systems, the essential motivation has been the exploration of what emotion solves in nature to afterwards analyze analogies for man--made systems. This work provides a reference model in which a collection of entities, relationships, models, functions and informational artifacts, are all interacting to provide the system with non-explicit knowledge under the form of emotion-like relevances. This solution aims to provide a reference model under which to design solutions for emotional operation, but related to the real needs of artificial systems. The proposal consists of a multi-purpose architecture that implement two broad modules in order to attend: (a) the range of processes related to the environment affectation, and (b) the range or processes related to the emotion perception-like and the higher levels of reasoning. This has required an intense and critical analysis beyond the state of the art around the most relevant theories of emotion and technical systems, in order to obtain the required support for those foundations that sustain each model. The problem has been interpreted and is described on the basis of AGSys, an agent assumed with the minimum rationality as to provide the capability to perform emotional assessment. AGSys is a conceptualization of a Model-based Cognitive agent that embodies an inner agent ESys, the responsible of performing the emotional operation inside of AGSys. The solution consists of multiple computational modules working federated, and aimed at conforming a mutual feedback loop between AGSys and ESys. Throughout this solution, the environment and the effects that might influence over the system are described as different problems. While AGSys operates as a common system within the external environment, ESys is designed to operate within a conceptualized inner environment. And this inner environment is built on the basis of those relevances that might occur inside of AGSys in the interaction with the external environment. This allows for a high-quality separate reasoning concerning mission goals defined in AGSys, and emotional goals defined in ESys. This way, it is provided a possible path for high-level reasoning under the influence of goals congruence. High-level reasoning model uses knowledge about emotional goals stability, letting this way new directions in which mission goals might be assessed under the situational state of this stability. This high-level reasoning is grounded by the work of MEP, a model of emotion perception that is thought as an analogy of a well-known theory in emotion science. The work of this model is described under the operation of a recursive-like process labeled as R-Loop, together with a system of emotional goals that are assumed as individual agents. This way, AGSys integrates knowledge that concerns the relation between a perceived object, and the effect which this perception induces on the situational state of the emotional goals. This knowledge enables a high-order system of information that provides the sustain for a high-level reasoning. The extent to which this reasoning might be approached is just delineated and assumed as future work. This thesis has been studied beyond a long range of fields of knowledge. This knowledge can be structured into two main objectives: (a) the fields of psychology, cognitive science, neurology and biological sciences in order to obtain understanding concerning the problem of the emotional phenomena, and (b) a large amount of computer science branches such as Autonomic Computing (AC), Self-adaptive software, Self-X systems, Model Integrated Computing (MIC) or the paradigm of models@runtime among others, in order to obtain knowledge about tools for designing each part of the solution. The final approach has been mainly performed on the basis of the entire acquired knowledge, and described under the fields of Artificial Intelligence, Model-Based Systems (MBS), and additional mathematical formalizations to provide punctual understanding in those cases that it has been required. This approach describes a reference model to feedback systems with valuable meaning, allowing for reasoning with regard to (a) the relationship between the environment and the relevance of the effects on the system, and (b) dynamical evaluations concerning the inner situational state of the system as a result of those effects. And this reasoning provides a framework of distinguishable states of AGSys derived from its own circumstances, that can be assumed as artificial emotion.

Bacteriophage T4 gene 41 helicase and gene 59 helicase-loading protein: A versatile couple with roles in replication and recombination

Bacteriophage T4 uses two modes of replication initiation: origin-dependent replication early in infection and recombination-dependent replication at later times. The same relatively simple complex of T4 replication proteins is responsible for both modes of DNA synthesis. Thus the mechanism for loading the T4 41 helicase must be versatile enough to allow it to be loaded on R loops created by transcription at several origins, on D loops created by recombination, and on stalled replication forks. T4 59 helicase-loading protein is a small, basic, almost completely α-helical protein whose N-terminal domain has structural similarity to high mobility group family proteins. In this paper we review recent evidence that 59 protein recognizes specific structures rather than specific sequences. It binds and loads the helicase on replication forks and on three- and four-stranded (Holliday junction) recombination structures, without sequence specificity. We summarize our experiments showing that purified T4 enzymes catalyze complete unidirectional replication of a plasmid containing the T4 ori(uvsY) origin, with a preformed R loop at the position of the R loop identified at this origin in vivo. This replication depends on the 41 helicase and is strongly stimulated by 59 protein. Moreover, the helicase-loading protein helps to coordinate leading and lagging strand synthesis by blocking replication on the ori(uvsY) R loop plasmid until the helicase is loaded. The T4 enzymes also can replicate plasmids with R loops that do not have a T4 origin sequence, but only if the R loops are within an easily unwound DNA sequence.

Quantitative stem-loop RT-PCR for detection of microRNAs

Plant microRNAs (miRNAs) are a class of endogenous small RNAs that are essential for plant development and survival. They arise from larger precursor RNAs with a characteristic hairpin structure and regulate gene activity by targeting mRNA transcripts for cleavage or translational repression. Efficient and reliable detection and quantification of miRNA expression has become an essential step in understanding their specific roles. The expression levels of miRNAs can vary dramatically between samples and they often escape detection by conventional technologies such as cloning, northern hybridization and microarray analysis. The stem-loop RT-PCR method described here is designed to detect and quantify mature miRNAs in a fast, specific, accurate and reliable manner. First, a miRNA-specific stem-loop RT primer is hybridized to the miRNA and then reverse transcribed. Next, the RT product is amplified and monitored in real time using a miRNA-specific forward primer and the universal reverse primer. This method enables miRNA expression profiling from as little as 10 pg of total RNA and is suitable for high-throughput miRNA expression analysis.

Stereochemical analysis of the antigenic tip of the V3 loop peptide of HIV-1 gp120

A novel multiple turn conformation has been observed for a segment GPGRAFY in the crystal structure of a complex of HIV-1 gp120 V3 loop peptide with the Fab fragment of a neutralizing antibody [Ghiara ct al. (1994) Science 264, 82-85]. A structural motif has been defined for the peptide segment, employing idealized backbone conformations characterized by ranges of virtual C-alpha torsion angles and bond angles. A search of 122 high-resolution protein crystal structures has permitted identification of 24 examples of similar structural motifs. Two major conformational families have been identified, which differ primarily in the conformation at residue 3. The observed conformation at residue 3 in family 1 is left-handed helical (alpha(L)) and that in family 2 is right-handed helical (alpha(R)). Of the 10 examples in family 1, 9 examples have Gly residues at position 3. Of the 12 examples in family 2, 7 examples have Asn/Asp at position 3. Computer modeling of the V3 loop tip sequence using the two backbone conformational families as starting points leads to minimum-energy conformations in which antigenically important side-chains occupy similar spatial arrangements. This stereochemical analysis of the V3 loop tip sequence suggests a rational basis for the design of synthetic analog peptides for use as viral antagonists or synthetic antigens. (C) Munksgaard 1995.

Synthetic peptide models for the redox-active disulfide loop of glutaredoxin. Conformational studies

Two cyclic peptide disulfides Boc-Cys-Pro-X-Cys-NHMe (X = L-Tyr or L-Phe) have been synthesized as models for the 14-membered redox-active disulfide loop of glutaredoxin. 'H NMR studies at 270 MHz in chloroform solutions establish a type I 0-turn conformation for the Pro-X segment in both peptides, stabilized by a 4-1 hydrogen bond between the Cys(1) CO and Cys(4) NH groups. Nuclear Overhauser effects establish that the aromatic ring in the X = Phe peptide is oriented over the central peptide unit. In dimethyl sulfoxide solutions two conformational species are observed in slow exchange on the NMR time scale, for both peptides. These are assigned to type I and type I1 p-turn structures with -Pro-Tyr(Phe)-as the corner residues. The structural assignments are based on correlation of NMR parameters with model 14-membered cyclic cystine peptides with Pro-X spacers. Circular dichroism studies based on the -S-Sn- u* transition suggest a structural change in the disulfide bridge with changing solvent polarity, establishing conformational coupling between the peptide backbone and the disulfide linkage in these systems.