Synthese, Evaluierung und 18 F-Markierung von neuen Liganden zur Visualisierung der Strychnin-insensitiven Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im Gehirn. Folglich spielen Glutamat-kontrollierte Rezeptorsysteme eine entscheidende Rolle in neurologischen Vorgängen, wie beispielsweise in Lern- und Gedächtnisprozessen. Gerade der NMDA-Rezeptor ist in eine Vielzahl solcher Vorgänge involviert und wird vor allem mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und zerebraler Ischämie in Verbindung gebracht. Folglich stellt die Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus eine Möglichkeit dar, den Verlauf solcher Prozesse zu untersuchen.rnDie Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ist eine leistungsstarke Anwendung in der molekularen Bildgebung und erlaubt die in vivo-Visualisierung sowie Quantifizierung biochemischer Prozesse. Durch die Verwendung geeigneter Tracer können bestimmte pathologische und neurologische Abläufe beurteilt werden. rnZurzeit sind keine geeigneten PET-Tracer zur Untersuchung des NMDA-Rezeptors verfügbar. Bisher dargestellte PET-Liganden zeichneten sich durch nicht zufriedenstellende Affinitäten und Selektivitäten aus und führten meist auf Grund der hohen Lipophilie zu einem hohen Maß an unspezifischer Bindung. rnDie Strychnin-insensitive Glycinbindungsstelle des NMDA-Rezeptors stellt ein vielversprechendes Target dar, spezifische Liganden für diese Bindungsstelle zu synthetisieren. Hier zeichnen sich einige Verbindungsklassen durch exzellente Affinitäten und Selektivitäten sowie durch vielversprechende in vivo-Eigenschaften aus. rnAuf Grundlage dieser biologischen Daten wurden zwei Substanzen der 2-Indolcarbonsäure, nämlich die 4,6-Dichlor-3-(2-oxo-3-phenylimidazolidin-1-ylmethyl)-1H-indol-2-carbonsäure (MDJ-114) und die (E)-4,6-Dichlor-3-(2-phenylcarbamoylvinyl)-1H-indol-2-carbonsäure (GV150526), als Leitstruktur gewählt. Ferner wurde das 7-Chlor-4-hydroxy-3-(3-phenoxyphenyl)-1H-chinolin-2-on (L-701,324) aus der Substanzklasse der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-one als dritte Leitstruktur gewählt.rnFür diese Substanzen wurden 19F-markierte Analogverbindungen synthetisiert, um als inaktive Referenzverbindungen auf ihre Eignung überprüft zu werden. Hierzu wurde eine Fluorethoxygruppierung im terminalen Phenylring der entsprechenden Leitstruktur eingeführt. Durch Variation der Fluorethoxysubstitution in ortho-, meta- und para-Stellung, konnten die besten Affinitäten in einem kompetitiven Rezeptorbindungsassay durch Verdrängung von [3H]MDL-105,519 bestimmt werden. Als Maß für die Lipophilie wurden die entsprechenden log D-Werte über die HPLC-Methode bestimmt. Basierend auf den Ergebnissen der Evaluierung wurden zwei Derivate identifiziert, welche zur 18F-Markierung genutzt werden sollten (GV150526-Derivat 34: log D = 0,23 ± 0,03, IC50 = 0,20 ± 0,25 µM, Ki = 0,13 ± 0,16 µM; L701,324-Derivat 55: log D = - 0,25 ± 0,01, IC50 = 78 ± 37 µM, Ki = 51 ± 24 µM). Die 18F-Markierung erfolgte durch die Reaktion des entsprechenden Markierungsvorläufers mit dem Markierungssynthon 2-[18F]Fluorethyltosylat, welches durch die Umsetzung von Ethylenditosylat mit [18F]Fluorid hergestellt wurde. Die Radiosynthesen der beiden 18F-markierten Verbindungen [18F]34 (4,6-Dichlor-3-{2-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenylcarbamoyl]-vinyl}-1H-indol-2-carbonsäure) und [18F]55 (7-Chlor-3-{3-[4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenoxy]-phenyl}-4-hydroxy-1H-chinolin-2-on) wurden optimiert sowie semipräparative Abtrennverfahren entwickelt. Beide Tracer wurden auf ihre in vivo-Eignung im µPET-Experiment untersucht. Die Zeitaktivitätskurven lassen erkennen, dass beide Tracer entgegen der Erwartung nicht die Blut-Hirn-Schranke überwinden können. Für das GV150526-Derivat ([18F]34) wurden zusätzlich Autoradiographiestudien durchgeführt. Die erhaltenen Aufnahmen zeigten ein heterogenes Verteilungsmuster der Aktivitätsanreicherung. Ebenso wurde ein hohes Maß an unspezifischer Bindung beobachtet. Möglicherweise sind Cross-Affinitäten zu anderen Rezeptorsystemen oder der recht hohe lipophile Rest des Moleküls hierfür verantwortlich. Ein Grund für die unzureichende Hirngängigkeit der Radioliganden kann sich in der Carboxylatfunktion des GV150526-Derivats bzw. in der 4-Hydroxy-1H-chinolin-2-on-Einheit des L-701,324-Derivats wiederspiegeln. rnAuf Grundlage dieser Resultate können Versuche unternommen werden, für die Verbindungsklasse der 2-Indolcarbonsäuren entsprechende Ester als Prodrugs mit einer verbesserten Bioverfügbarkeit darzustellen. Ebenso können neue Strukturen als Grundlage für neue PET-Tracer untersucht werden.rnrn

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbonsäuren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell für physiologische Lern- und Gedächtnisvorgänge und eine krankhafte Überaktivierung wird als potentielle Ursache für eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind für die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und für die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer´sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabhängige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen könnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht möglich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbonsäure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinität und Spezifität zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter für die Hirngängigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorläufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekundären Markierungsvorläufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) ermöglichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-geschützten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 – 38 % erhalten. Die anschließende Entfernung der Schutzgruppe führte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 – 7 %. Die Überprüfung des biochemischen Konzepts in vivo durch µ-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivität hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zurückführen lässt.

Synthese, n.c.a. 18F-Markierung und Evaluierung von Antagonisten der Strychnin-unempfindlichen-Glycinbindungsstelle auf Basis der 4-Amino-5,7-Dichlor-1,2,3,4-Tetrahydro-Chinolin-2-Carbonsäure

ZUSAMMENFASSUNGDer glutamaterge N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA) ist ein wichtiger ionotroper Rezeptor, der die exzitatorische synaptische Transmission im zentralen Nervensystem von Säugetieren vermittelt. Der NMDA-Rezeptor nimmt unter den Glutamatrezeptoren dabei eine Sonderstellung ein, da er mit einer Reihe von neurodegenerativen Erkrankungen wie dem Morbus Parkinson, dem Morbus Huntington, dem Morbus Alzheimer, der Schizophrenie und der Epilepsie in Zusammenhang gebracht wird. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung geeigneter 18F-markierter NMDA-Rezeptorliganden zur nicht-invasiven Visualisierung des NMDA-Rezeptorkomplexes mittels der Positronenemissionstomographie.Die 19F-Analoga ADTC1, tADTC1 und tADTC3 - 5 und das nicht-fluorierte 12C-Analogon tADTC2 wurden synthetisiert und ihre in-vitro Affinität und Lipophilie bestimmt. Mit Ausnahme von ADTC1 und tADTC5 die mikromolare Affinitäten besitzen, haben die Liganden in [H-3]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassays niedrige nanomolare Affinitäten für die Glycinbindungsstelle. Die Lipophilie der Verbindungen wurde mit drei verschiedenen Verfahren untersucht und ergab logD7,4-Werte von ungefähr 1 für cADTC1 und tADTC1 – 4, während tADTC5 mit einem logD7,4 von –1,15 eine sehr niedrige Lipophilie aufwies. Die Radiosynthesen der 18F-Liganden wurden hinsichtlich der Umsetzung der Markierungsvorläufer mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat oder [F-18]Fluorid untersucht und optimiert. Die höchsten radiochemischen Ausbeuten von ungefähr 90% wurden, unter Verwendung von NaOH als Hilfsbase, bei der 18F-Fluorethylierung von t[F-18]ADTC4 und t[F-18]ADTC5 mit 2-[F-18]Fluorethyltosylat erzielt.

Specific PET-ligands for selected 5-HT and GABA A-receptor subtypes = PET-Liganden mit Spezifität für definierte 5-HT und GABA A-Rezeptor-Subtypen

Für diese Arbeit wurden sechs neue Benzodiazepinderivate, TC07, TC08, TC09, TC10, TC11 und TC12, hergestellt. Diese wurden mittels Radioligandenbindungsassay sowohl auf ihre Bindungseigenschaften für Membranen des Cerebellum, des Hippo-campus und des Cortex der Ratte hin untersucht, als auch für Membranen von HEK293 Zellen, die transient rekombinante GABAA Rezeptoren exprimierten. Zusätz-lich wurden kompetitive in situ Rezeptorautoradiographien an Rattenhirnschnitten mit den Liganden [3H]Ro15-4513 und [3H]R015-1788 durchgeführt. Zusammen ergaben sich aus diesen Experimenten deutliche Hinweise auf eine Selektivität der Verbindun-gen TC07, TC11 und TC12 für a5-Untereinheiten enthaltende GABAA Rezeptoren mit a5-Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich. In vivo Bindungsexperimente in Ratten, mit [3H]Ro15-1788 als Tracer und TC07 als Kompetitor, ergaben, dass TC07 mehr [3H]Ro15-1788 im Vorderhirn als im Cerebellum verdrängt. Bezog man die regionale Verteilung der a5-Untereinheit des GABAA Rezep-tors im Rattenhirn mit ein – sehr wenige a5-Untereinheiten im Cerebellum, etwa 20 % der GABAA Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus – untermauerten diese Ergeb-nisse die Vermutung, TC07 könne a5-selektiv sein. Diese Daten bestätigten darü-berhinaus, dass TC07 die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Für elektrophysiologische Messungen mit TC07 und TC12 wurden die oben erwähnten transient transfizierten HEK293 Zellen verwendet, welche die GABAA Rezeptor Unte-reinheitenkombination a5b3g2 exprimierten. Das Dosis-Antwort Verhalten ergab keinen signifikanten Effekt für TC12. Die Daten von TC07 dagegen lassen auf einen schwach negativ modulatorischen Effekt schließen, was, zumindest theoretisch, die Möglichkeit eröffnet, TC07 auch als sogenannten cognitive enhancer einzusetzen. Der errechnete Ki-Wert lag in derselben Größenordnung wie der Ki-Wert, der anhand der Bindungsas-saydaten errechnet wurde. Insgesamt rechtfertigen die bisherigen Ergebnisse die radiochemische Markierung mit 18F von drei der sechs getesteten Verbindungen in der Reihenfolge TC07, TC12 und TC11. Des Weiteren wurde [18F]MHMZ, ein potentiell 5-HT2A selektiver Ligand und PET-Tracer einschließlich Vorläufer und Referenzverbindungen, mit hohen Ausbeuten syn-thetisiert (Herth, Debus et al. 2008). Autoradiographieexperimente mit Rattenhirn-schnitten zeigten hervorragende in situ Bindungseigenschaften der neuen Verbindung. Die Daten wiesen eine hohe Selektivität für 5-HT2A Rezeptoren in Verbindung mit einer niedrigen unspezifischen Bindung auf. [18F]MHMZ erfährt in vivo eine schnelle Metabo-lisierung, wobei ein polarer aktiver Metabolit entsteht, welcher vermutlich nicht die Blut-Hirn-Schranke passieren kann. Transversale, sagittale und coronale Kleintier-PET-Bilder des Rattenhirns zeigten eine hohe Anreicherung im frontalen Cortex und im Striatum, während im Cerebellum so gut wie keine Anreicherung festzustellen war. Diese Verteilung deckt sich mit der bekann-ten Verteilung der 5-HT2A Rezeptoren. Die in vivo Anreicherung scheint sich ebenfalls gut mit der Verteilung der in den Autoradiographieexperimenten gemessenen Bindung zu decken. Nach Berechnungen mit dem 4-Parameter Referenzgewebe Modell beträgt das Bindungspotential (BP) für den frontalen Cortex 1,45. Das Cortex zu Cerebellum Verhältnis wurde auf 2,7 nach 30 Minuten Messzeit bestimmt, was bemerkenswert nah an den von Lundkvist et al. für [11C]MDL 100907 publizierten Daten liegt. Abgesehen von der etwas niedrigeren Affinität waren die gemessenen in vitro, in situ und in vivo Daten denen von [3H]MDL 100907 und [11C]MDL 100907 sehr ähnlich, so dass wir ein [18F]Analogon in der Hand haben, das die bessere Selektivität von MDL 100907 verglichen mit Altanserin mit der längeren Halbwertszeit und den besse-ren Eigenschaften für die klinische Routine von 18F verglichen mit 11C verbindet. Die Ergebnisse von [18F]MHMZ rechtfertigenden weitere Experimente, um diesen Liganden für die klinische Routine am Menschen nutzbar zu machen.

Mécanismes de plasticité synaptique dans l’amygdale lors de la réactivation de la mémoire de peur auditive chez le rat : interaction dynamique des récepteurs NMDA et AMPA

La plasticité synaptique est une propriété indispensable à l’acquisition de la mémoire chez toutes les espèces étudiées, des invertébrés aux primates. La formation d’une mémoire débute par une phase de plasticité qui inclut une restructuration synaptique ; ensuite elle se poursuit par la consolidation de ces modifications, contribuant à la mémoire à long terme. Certaines mémoires redeviennent malléables lorsqu’elles sont rappelées. La trace mnésique entre alors dans une nouvelle de phase de plasticité, au cours de laquelle certaines composantes de la mémoire peuvent être mises à jour, puis reconsolidées. L’objectif de la présente thèse est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sont activés lors du rappel d’une mémoire. Nous avons utilisé un modèle de conditionnement Pavlovien, combiné à l’administration d’agents pharmacologiques et à l’analyse quantitative de marqueurs de plasticité synaptique, afin d’étudier la dynamique de la mémoire de peur auditive chez des rats Sprague Dawley. La circuiterie neuronale et les mécanismes associatifs impliqués dans la neurobiologie de cette mémoire sont bien caractérisés, en particulier le rôle des récepteurs glutamatergiques de type NMDA et AMPA dans la plasticité synaptique et la consolidation. Nos résultats démontrent que le retour de la trace mnésique à un état de labilité nécessite l’activation des récepteurs NMDA dans l’amygdale baso-latérale à l’instant même du rappel, alors que les récepteurs AMPA sont requis pour l’expression comportementale de la réponse de peur conditionnée. D’autre part, les résultats identifient le rappel comme une phase bien plus dynamique que présumée, et suggèrent que l’expression de la peur conditionnée mette en jeu la régulation du trafic des récepteurs AMPA par les récepteurs NMDA. Le présent travail espère contribuer à la compréhension de la neurobiologie fondamentale de la mémoire. De plus, il propose une intégration des résultats aux modèles animaux d’étude des troubles psychologiques conséquents aux mémoires traumatiques chez l’humain, tels que les phobies et les syndromes de stress post-traumatiques.

Die funktionelle Rolle von LRP1 in der tPA-vermittelten Aktivierung von NMDA-Rezeptoren

Das Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein 1 (LRP1) scheint neben seiner ursprünglichen Rolle als Lipoproteinrezeptor auch eine fundamentale Rolle bei der Einleitung von Signaltransduktionskaskaden im sich entwickelnden Gehirn zu spielen. Einer seiner Hauptliganden ist die Serinprotease Tissue-type Plasminogen Aktivator (tPA), welche NMDA-Rezeptor-abhängig MAP Kinasenaktivierung induzieren kann. In dieser Studie sollte daher untersucht werden, ob LRP1 und der NMDA Rezeptor in der tPA-vermittelten Signaltransduktion miteinander kooperieren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl LRP1 als auch der NMDA Rezeptor an der tPA-induzierten Erk1/2 Phosphorylierung beteiligt sind, da dieser Effekt mit den spezifischen Inhibitoren RAP, MK-801 und DL-AP5 blockiert werden konnte. Eine weitere Bestätigung der LRP1-Spezifität zeigte sich durch shRNA knock-down Experimente. Calcium Imaging Experimente ergaben, dass die Applikation von tPA sowohl in primären, hippokampalen Neuronen als auch in der neuronalen Zelllinie HT22 zu einem robusten Einstrom von Calcium in die Zelle führte, welcher mit dem NMDA Rezeptor Inhibitor MK-801 und dem LRP1 Inhibitor RAP blockiert werden konnte. RNAi Experimente und Überexpressionsstudien bestätigten die Beteiligung von PSD-95 als intrazelluläres Adapterprotein, welches die beiden Rezeptoren miteinander verbindet. Als Bindungsstelle für PSD-95 konnte mit Hilfe von LRP1 knock-in Mausneuronen die distale NPxY(2) Domäne am LRP1 C-Terminus identifiziert werden. Diese Ergebnisse führten zu der Hypothese eines multimeren tPA-LRP1-NMDA Rezeptor Komplexes, der über die primäre Bindung von tPA an LRP1 aktiviert wird und anschließend das Signal an den NMDA Rezeptor weiterleitet. Somit weisen die Ergebnisse dieser Arbeit auf einen neuen, tPA-vermittelten Mechanismus zur Öffnung von Glutamatrezeptoren hin, der eine funktionelle Kooperation von dem Lipoproteinrezeptor LRP1 mit dem NMDA Rezeptor voraussetzt.

Neue 18 F-markierte Liganden zur Visualisierung des GABA A, alpha 5-Rezeptorstatus mittels PET

Die heutige Verfügbarkeit der molekularen Bildgebung ermöglicht einen signifikanten Einfluss auf die Diagnostik und die Therapiekontrolle von neurodegenerativen Erkrankungen, die unter anderem durch Fehlsteuerungen im GABAergen System auftreten können. Die Visualisierung und Quantifizierung des GABAA-alpha5-Subtyps durch PET könnte dabei zu einem besseren Verständnis von Erkrankungen wie Alzheimer und traumatischen Neurosen (emotionales Langzeitgedächtnis) beitragen. Ferner eröffnen GABAA/alpha5-subtypselektive Liganden die Möglichkeit, wesentliche Grundlagen der elementaren Vorgänge von Lernen und Erinnern zu untersuchen. 7,8,9,10-Tetrahydro-(7,10-ethan)-1,2,4-triazol[3,4-alpha]phthalazine stellen sich als vielverspre-chende Leitstrukturen zur Entwicklung neuer 18F-markierter alpha5-subtypselektiver GABAA-Rezeptorliganden für die PET dar. Um diese neuartigen Substanzen hinsichtlich ihrer Potenz als GABAA-alpha5-subtypselektive Radioliganden zu verifizieren, wurden zunächst die entsprechenden 19F-Derivate TC07-TC12 synthetisiert. Diese Referenzverbindungen wurden in Rezeptor-bindungsassays und in Autoradiographien mit [3H]Ro 15-4513 als zu verdrängender Radioligand evaluiert. In beiden Experimenten als auch in in vivo-Verdrängungsexperimenten an Ratten konnte eine hohe Affinität im nanomolaren Bereich als auch eine hohe Selektivität bezüglich der GABAA/alpha5-Untereinheit für einige der dargestellten Referenzverbindungen nachgewiesen werden. Gemäß diesen vielversprechenden Ergebnissen wurden verschiedene Markie-rungsvorläufer für eine 18F-Direktmarkierung der relevantesten Substanz TC07 in einer mehrstufigen organischen Synthese dargestellt. Die anschließende 18F-Markierung erfolgte über eine nukleophile Substitution mit [18F]Fluorid. Die Reaktionsparameter wurden hinsichtlich Reaktionstemperatur und dauer, Markierungsvorläuferkonzentration, Basenabhängigkeit und verschiedenen Markierungsmethoden optimiert. Daraus resultierend konnte [18F]TC07 mit bis zu 45 % radiochemischer Ausbeute erhalten werden. Die zerfallskorrigierte, gesamtradiochemische Ausbeute von nca [18F]TC07 in isotonischer NaCl-Lösung betrug 15 %. Basierend auf den bisher erhaltenen Ergebnissen wurde der Radioligand in in vitro-, ex vivo- und in vivo µPET-Experimenten evaluiert. Die zunächst durchgeführten in vitro-Experimente deuteten auf eine homogene Verteilung der Aktivität hin und zeigten keine spezifische Anreicherung. Diese Ergebnisse wurden sowohl in ex vivo- als auch in in vivo-µPET-Studien bestätigt. Auch hier konnte nur eine niedrige Aktivitätsanreicherung, eine homogene Verteilung im gesamten Gehirn und keine Übereinstimmung mit der bekannten GABAA/alpha5-Subtypverteilung gefunden werden. Eine im Anschluss durchgeführte Metabolismusstudie zeigte eine langsame Metabolisierungsrate des [18F]TC07 und auch eine Organverteilungsstudie zeigte keine außergewöhnlichen Anreicherungen. Aus den erhaltenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Radioligand [18F]TC07 kein geeigneter Tracer zur in vivo-Visualisierung der alpha5-Untereinheit des GABAA-Rezeptors ist.

Synthese, biochemische und physikochemische Charakterisierung von Liganden der Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors

Die exzitatorische Neurotransmission erfolgt über ionotrope Glutamat-Rezeptoren von denen dem NMDA-(N-Methyl-D-aspartat)-Rezeptor durch seine hohe Leitfähigkeit für Ca2+-Ionen eine besondere Rolle zugesprochen wird. Bei seiner Überaktivierung kommt es zu exzitotoxischen Prozessen, die direkt mit neurodegenerativen Erkrankungen einhergehen und nach einem Schlaganfall, bei akuten Epilepsien, Morbus Parkinson, Alzheimer Demenz aber auch im Bereich der neuropathischen Schmerzentstehung eine wichtige Rolle spielen.rnDurch das Eingreifen in die glutamatvermittelten pathologischen Prozesse verspricht man sich daher die Möglichkeit einer Neuroprotektion bei der Therapie verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, die primär auf völlig unterschiedliche Ursachen zurückzuführen sind.rnAusgehend von in früheren Arbeiten synthetisierten Hydantoin-substituierten Dichlor-indol-2-carbonsäure-Derivaten, die hochaffine Eigenschaften zur Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors aufweisen, sollten neue Derivate entwickelt und untersucht werden, die hinsichtlich ihrer Affinität zur Glycin-Bindungsstelle des NMDA-Rezeptors, ihrer Pharmakokinetik sowie physikochemischen Parameter in präparativ-organischen, radiopharmazeutischen und zell- bzw. tierexperimentellen Studien in vitro sowie in vivo charakterisiert werden sollten. Von besonderem Interesse war dabei die Evaluierung der synthetisierten Verbindungen in einem Verdrängungsassay mit dem Radioliganden [3H]MDL105,519 mit dem der Einfluss der strukturellen Modifikationen auf die Affinität zur Glycin-Bindungsstelle des Rezeptors untersucht wurde, sowie die Selektivität und die Potenz der Liganden abgeschätzt wurde.rnIm Rahmen der Struktur-Wirkungs-Untersuchungen mit Hilfe der Bindungsexperimente konnten bestimmte Strukturmerkmale als essentiell herausgestellt bzw. bekräftigt werden. Die Testverbindungen zeigten dabei IC50-Werte im Bereich von 0,0028 bis 51,8 μM. Die entsprechenden Ester dagegen IC50-Werte von 23,04 bis >3000 μM. Als vielversprechende Strukturen mit Affinitäten im niedrigen nanomolaren Bereich stellten sich Derivate mit einer 4,6-Dichlor-oder Difluor-Substitution am Indolgrundgerüst (2,8 bis 4,6 nM) heraus. Auch die Substitution des Phenylhydantoin-Teils durch das bioisostere Thienylhydantoin führte zu einer gleichbleibenden ausgeprägten Affinität (3,1 nM). rnZur Abschätzung der Bioverfügbarkeit, insbesondere der Fähigkeit zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke, wurden die Lipophilien bei einer Auswahl der Testverbindungen durch Bestimmung ihrer log P-Werte ermittelt. Neben dem Verfahren der potentiometrischen Titration wurde eine HPLC-Methode an einer RP-Phase verwendet.rnUm das Zytotoxizitätsprofil der synthetisierten Strukturen frühzeitig abschätzen zu können, wurde ein schnell durchführbares, zellbasiertes in vitro-Testsystem, der kommerziell erhältliche „Cell Proliferation Kit II (XTT-Test)“, eingesetzt. rnIm Rahmen von Positronen-Emissions-Tomographie-Experimenten an Ratten wurde eine Aussage bezüglich der Aufnahme und Verteilung eines radioaktiv markierten, hochaffinen Liganden an der Glycinbindungsstelle des NMDA-Rezeptors im Gehirn getroffen. Dabei wurden sowohl ein Carbonsäure-Derivat sowie der korrespondierende Ethylester dieser Testung unterworfen.rn

Cerebro-corticale und subcorticale Prozessierung vestibulärer Informationen im intakten und lädierten System der Ratte (Micro-PET-Studie)

In dieser Studie wurde anhand des Modells der Ratte das Gleichgewichtssystem auf cerebro-corticaler Ebene untersucht, und das Verhalten des Gehirns nach akuten sowie chronischen Ausfällen mit funktioneller Bildgebung untersucht. rnMit der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) kann die Metabolismusrate bestimmter Gehirnareale gemessen werden. Narkotisierte Tiere wurden unter galvanischer vestibulärer Stimulation im PET gemessen und die Ergebnisse wurden mit Kontrollstimulations-Messungen verglichen. Es konnten verschiedene Areale, die eine erhöhte Stoffwechselaktivität aufwiesen, ermittelt werden. Dazu gehören der somatosensorische und der insuläre Cortex, Teile des auditorischen Cortexes, der anteriore cinguläre sowie der entorhinale Cortex. Subcorticale Strukturen wie der Hippocampus, die Amygdala sowie die latero-dorsalen thalamischen Kerne wiesen ebenfalls erhöhten Stoffwechsel unter vestibulärer Stimulation auf. rnBei dieser PET-Studie handelt es sich um die erste funktionell-bildgebende Studie, die Verarbeitung vestibulärer Informationen bei Ratten in vivo darstellt. Die anatomische Verbindung der gefundenen Areale wurde mit anterograden und retrograden neuronalen Tracings unterstützt. rnDarüber hinaus wurde markiertes Gewebe, welches die Verbindung zwischen thalamischen und cerebro-corticalen Kernen der vestibulären Verschaltung aufweist, immunhistochemisch auf dessen Neurotransmission hin untersucht. Das katecholaminergen und dem opioidergen System wurde untersucht. Eine Beteiligung katecholaminerger Transmitter konnte nicht nachgewiesen werden. Neurone im somatosensorischen Cortex, die positiv auf einen Opioid-Rezeptor-Antikörper getestet wurden erhalten anterograd markierte Terminale aus dem thalamischen Kern LDDM, der mittels der PET als vestibulär identifiziert werden konnte. rnBasierend auf den Ergebnissen der ersten bildgebenden Studie wurde in einer zweiten funktionell-bildgebenden Studie die zentral-vestibuläre Verschaltung unterbrochen, indem relevante thalamische Kerngebiete (LDDM, LDVL) elektrolytisch zerstört wurden. Die Stoffwechselaktivität wurde anschließend bei diesen Tieren an verschiedenen Zeitpunkten nach der Läsion im PET unter vestibulärer Stimulation gemessen. Die Stoffwechselaktivität dieser Tiere wurde mit der Stoffwechselaktivität von Kontroll-Tieren verglichen. rnBei dieser Studie wurde zum ersten Mal, mittels funktioneller Bildgebung gezeigt, welche Bereiche des Gehirns nach akuter und chronischer Läsion des vestibulären Systems an Kompensationsmechanismen beteiligt sind. Alle Gehirnareale, die in verschiedenen Zeitfenstern (1, 3, 7 und 20 Tage nach Läsion) erhöhten Metabolismus aufweisen, sind Teil der vestibulären Verschaltung. Es handelt sich dabei um Areale der Okulomotorik und des räumlichen Gedächtnisses: das Postsubiculum, den Colliculus superior, das mediale Corpus geniculatum, den entorhinalen Cortex sowie die Zona incerta.rn

Oxidativer Stress als Modulator der NMDA-Rezeptorexpression auf zerebrovaskulären Endothelzellen

Oxidativer Stress in Form reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und Exzitotoxizität durch supraphysiologische Konzentrationen des Neurotransmitters Glutamat sind nicht nur beteiligt an der Pathogenese vielzähliger neurodegenerativer Erkrankungen wie Schlaganfall, Hirntrauma, Alzheimer Demenz oder Multipler Sklerose, sondern spielen zudem eine Schlüsselrolle im dort beobachteten Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke. Glutamat führt durch Stimulation neuronaler und endothelialer NMDA-Rezeptoren zu einer Generierung von ROS. Nicht verfolgt worden war bisher, welche Auswirkungen ROS umgekehrt auch auf den NMDA-Rezeptor haben könnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, ob und in welcher Weise die Exposition gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies einen Einfluss auf die Expression und Aktivierbarkeit von NMDA-Rezeptoren auf zerebrovaskulären Endothelzellen ausübt.rnEs konnte zunächst die Expression der funktionell obligaten NR-1 Untereinheit des NMDA-Rezeptors auf der verwendeten Zelllinie b.End3 mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie gesichert werden. Ein Nachweis von mRNA für die Untereinheiten NR1 und NR2B, C und D erfolgte mittels RT-PCR. In der Analyse der replizierten RNA zeigten sich Hinweise für eine heterogene Komposition der exprimierten endothelialen NMDA-Rezeptoren.rnEs konnte weiter mit Hilfe der In-Cell-Western-Technik gezeigt werden, dass die Expression des NMDA-Rezeptors durch transiente Stimulation mit reaktiven Sauerstoffspezies im Sinne einer Heraufregulation moduliert werden kann. Die Stimulation der Zellen mit den reaktiven Sauerstoffspezies O2-, ONOO- und H2O2 führte dabei im Experiment zu einer deutlichen Zunahme der NR1-Expression, die spätestens nach 72 Stunden höchst signifikant war.rnUm zu überprüfen, welche Bedeutung diese Überexpression für die Integrität der Blut-Hirn-Schranke unter den exzitotoxischen Bedingungen hoher Glutamatkonzentrationen haben könnte, wurde mit Hilfe des ECIS-Systems („Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing“) die Impedanz ROS-präexponierter Endothelmonolayer gemessen. Auf Rezeptorstimulation mit dem spezifischen Agonisten NMDA reagierten die vorbehandelten Gruppen mit einem Abfall der Impedanz gegenüber der nicht vorbehandelten Kontrolle.rnrnDie vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass ROS in der Lage sind, funktionelle endotheliale NMDA-Rezeptoren zu induzieren und auf diesem Weg zu einem verstärkten Abfall der BHS-Integrität unter den Bedingungen exzitotoxischen und oxidativen Stresses führen. Dies stellt einen neuen Mechanismus zur Erklärung der Pathogenese des Blut-Hirn-Schrankenversagens dar.

90 Nb: potential radionuclide for application in immuno-PET : development of appropriate production strategy and first in vivo evaluation of 90 Nb-labeled monoclonal antibody

Die Nuklearmedizin ist ein modernes und effektives Werkzeug zur Erkennung und Behandlung von onkologischen Erkrankungen. Molekulare Bildgebung, die auf dem Einsatz von Radiopharmaka basiert, beinhaltet die Einzel-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) und Positronenemissions¬tomographie (PET) und ermöglicht die nicht-invasive Visualisierung von Tumoren auf nano-und picomolarer Ebene.rnDerzeit werden viele neue Tracer für die genauere Lokalisierung von kleinen Tumoren und Metastasen eingeführt und hinsichtlich ihrer Eignung untersucht. Die meisten von ihnen sind Protein-basierte Biomoleküle, die die Natur selbst als Antigene für die Tumorzellen produziert. Dabei spielen Antikörper und Antikörper-Fragmente eine wichtige Rolle in der Tumor-Diagnostik und Behandlung. Die PET-Bildgebung mit Antikörpern und Antikörperfragmenten bezeichnet man als immuno-PET. Ein wichtiger Aspekt hierbei ist, dass entsprechende Radiopharmaka benötigt werden, deren Halbwertszeit mit der Halbwertszeit der Biomoleküle korreliert ist.rnIn neueren Arbeiten wird 90Nb als potenzieller Kandidat für die Anwendung in der immuno-PET vorgeschlagen. Seine Halbwertszeit von 14,6 Stunden ist geeignet für die Anwendung mit Antikörperfragmenten und einige intakten Antikörpern. 90Nb hat eine relativ hohen Anteil an Positronenemission von 53% und eine optimale Energie für die β+-Emission von 0,35 MeV, die sowohl eine hohe Qualität der Bildgebung als auch eine niedrige Aktivitätsmenge des Radionuklids ermöglicht.rnErsten grundlegende Untersuchungen zeigten: i) dass 90Nb in ausreichender Menge und Reinheit durch Protonen-Bombardierung des natürlichen Zirkonium Targets produziert, ii) aus dem Targetmaterial in entsprechender radiochemischer Reinheit isoliert und iii) zur Markierung des monoklonalen Antikörpers (Rituximab) verwendet werden kann und iv) dieser 90Nb-markierte mAb eine hohe in vitro Stabilität besitzt. Desweiteren wurde eine alternative und schnelle Abtrennungsmethode entwickelt, die es erlaubt 90Nb, mit einer geeigneten radiochemischen und radionuklidischen Reinheit für eine anschließende Markierung von Biomolekülen in einer Stunde zu aufzureinigen. Schließlich wurden erstmals 90Nb-markierte Biomolekülen in vivo untersucht. Desweiteren wurden auch Experimente durchgeführt, um den optimalen bifunktionellen Chelatbildner (BFC) für 90Niob zu finden. Mehrere BFC wurden hinsichtlich Komplexbildung mit NbV untersucht. Desferrioxamin (Df) erwies sich als geeignetster Chelator für 90Nb. Der monoklonale Antikörper Bevacizumab (Avastin®) wurde mit 90Nb markiert und eine Biodistributionsstudie und eine PET-Untersuchung durchgeführt. Alle diese Ergebnisse zeigten, dass 90Nb ein vielversprechendes Radionuklid für die Immuno-PET ist, welches sogar für weitere kommerzielle Anwendungen in der klinischen Routine geeignet zu sein scheint.rn

Die Rolle von LRP1 in der Funktion des NMDA-Rezeptors

Ein funktionelles Zusammenspiel von LRP1, einem Mitglied der LDL-Rezeptorfamilie, mit dem NMDA-Rezeptor, einem Glutamat Rezeptor, wurde durch die Interaktion beider Proteine sowie eine tPa-vermittelte, LRP1-abhängige Signalübertragung durch den NMDA-Rezeptor belegt. Darüber hinaus zeigen Mäuse mit einem konditionellen neuronalen knock-out des Lrp1 Gens Verhaltensänderungen, die mit einer beeinträchtigten Signalübertragung durch NMDA-Rezeptoren assoziiert werden könnten. Die genaue Rolle von LRP1 in der NMDA-Rezeptor-Funktion bleibt allerdings noch unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von LRP1 bei der Expression der NR2B-Untereinheit des NMDA-Rezeptors an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone untersucht. Zu diesem Zweck wurde die knock-in Mauslinie LRP1ΔNPxY2, die sich durch eine Alanin Substitution im NPxY2 Motiv des LRP1 auszeichnet, eingesetzt. rnEs konnte gezeigt werden, dass diese knock-in Mutation in einer erhöhten Expression von LRP1 und der NMDA-Rezeptoruntereinheiten NR1 und NR2B an der Zelloberfläche primärer kortikaler Neurone resultiert. Der Effekt konnte durch eine reduzierte Endozytoserate von LRP1 und der NR1-und NR2B-Untereinheiten in primären LRP1ΔNPxY2 Neuronen erklärt werden. Darüber hinaus wurde ein verändertes Phosphorylierungsmuster der Internalisierungssignale der NR2B-Rezeptoruntereinheit Serin S1480 und Tyrosin Y1472 an der Zelloberfläche primärer LRP1ΔNPxY2 Neurone detektiert. Die verantwortlichen Kinasen Fyn und Kasein-Kinase II sind allerdings in LRP1ΔNPxY2 Neuronen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen nicht abweichend reguliert. In den Co-Immunopräzipitationsexperimenten wurde gezeigt, dass die Bindung von LRP1 mit NR2B durch die Phosphorylierung reguliert wird und dieser Regulationsmechanismus in LRP1ΔNPxY2 Neuronen beeinträchtigt ist. Dies resultiert in einer stärkeren Bindung von NR2B-Rezeptoruntereinheit an LRP1. Aufgrund reduzierter Internalisierungsraten von LRP1 in LRP1ΔNPxY2 Neuronen führt dieser Umstand zu einer Akkumulation beider Rezeptorproteine an der Zelloberfläche. Schließlich wurden die NMDA-Rezeptor-assoziierten Verhaltensänderungen wie die Hyperaktivität und die Defizite im direkten und umgekehrten räumlichen Lernvermögen in den LRP1ΔNPxY2 Tieren nachgewiesen. Zusammengefasst, demonstrieren diese Ergebnisse, dass LRP1 eine kritische Rolle in der Regulierung der NR2B-Expression an der Zelloberfläche spielt.

Synthese und Evaluierung von (Radio)Liganden für den Free Fatty Acid Rezeptor 1

Der Free Fatty Acid Receptor 1 (FFAR1) ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, welcher neben einer hohen Expression im Gehirn auch eine verstärkte Expressionsrate auf den β-Zellen des Pankreas aufweist. Diese Expressionsmuster machen ihn zu einem idealen Target für die Visualisierung der sogenannten β-Zell-Masse mittels molekularer bildgebender Verfahren wie der PET. Eine Entwicklung geeigneter Radiotracer für die β-Zell-Bildgebung würde sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie von Typ-1- und Typ-2-Diabetes ein wertvolles Hilfsmittel darstellen.rnAufbauend auf einem von Sasaki et al. publiziertem Agonisten mit einem vielversprechendem EC50-Wert von 5,7 nM wurden dieser Agonist und zwei weitere darauf basierende 19F-substituierte Moleküle als Referenzverbindungen synthetisiert (DZ 1-3). Für die 18F-Markierung der Moleküle DZ 2 und DZ 3 wurden die entsprechenden Markierungsvorläufer (MV 1-3) synthetisiert und anschließend die Reaktionsparameter hinsichtlich Temperatur, Lösungsmittel, Basensystem und Reaktionszeit für die nukleophile n.c.a. 18F-Fluorierung optimiert. Die abschließende Entschützung zum fertigen Radiotracer wurde mit NaOH-Lösung durchgeführt und die Tracer injektionsfertig in isotonischer NaCl-Lösung mit radiochemischen Ausbeuten von 26,9 % ([18F]DZ 2) und 39 % ([18F]DZ 3) erhalten.rnZusätzlich wurde ein Chelator zur 68Ga-Markierung an den Liganden gekoppelt (Verb. 46) und die Markierungsparameter optimiert. Nach erfolgter Markierung mit 95 % radiochemischer Ausbeute, wurde der Tracer abgetrennt und in vitro Stabilitätsstudien durchgeführt. Diese zeigten eine Stabilität von mehr als 90 % über 120 min in sowohl humanem Serum (37 °C) als auch isotonischer NaCl-Lösung.rnMit einem ebenfalls synthetisierten fluoreszenzmarkierten Derivat des Liganden (Verb. 43) wurden erste LSM-Bilder an sowohl Langerhansschen Inseln als auch FFAR1-tragenden RIN-M Zellen durchgeführt, welche einen vielversprechenden Uptake des neuen Liganden in die Zellen zeigen. Weitere Untersuchungen und biologische Evaluierungen stehen noch aus. Mit den Referenzsubstanzen wurden zusätzlich Vitalitätsstudien an Langerhansschen Inseln durchgeführt, um einen negativen toxischen Einfluss auszuschließen.rn

Evaluation Of Soft-tissue Lesions With (18)f-fdg Pet/ct: Initial Results Of A Prospective Trial.

Although MRI is utilized for planning the resection of soft-tissue tumors, it is not always capable of differentiating benign from malignant lesions. The risk of local recurrence of soft-tissue sarcomas is increased when biopsies are performed before resection and by inadequate resections. PET associated with computed tomography using fluorodeoxyglucose labeled with fluorine-18 ((18)F-FDG PET/CT) may help differentiate between benign and malignant tumors, thus avoiding inadequate resections and making prior biopsies unnecessary. The purpose of this study was to evaluate the usefulness of (18)F-FDG PET/CT in differentiating benign from malignant solid soft-tissue lesions. Patients with solid lesions of the limbs or abdominal wall detected by MRI were submitted to (18)F-FDG PET/CT. The maximum standardized uptake value (SUVmax) cutoff was determined to differentiate malignant from benign tumors. Regardless of the (18)F-FDG PET/CT results all patients underwent biopsy and surgery. MRI was performed in 54 patients, and 10 patients were excluded because of purely lipomatose or cystic lesions. (18)F-FDG PET/CT was performed in the remaining 44 patients. Histopathology revealed 26 (59%) benign and 18 (41%) malignant soft-tissue lesions. A significant difference in SUVmax was observed between benign and malignant soft-tissue lesions. The SUVmax cutoff of 3.0 differentiated malignant from benign lesions with 100% sensitivity, 83.3% specificity, 89.6% accuracy, 78.3% positive predictive value, and 100% negative predictive value. (18)F-FDG PET/CT seems to be able to differentiate benign from malignant soft-tissue lesions with good accuracy and very high negative predictive value. Incorporating (18)F-FDG PET/CT into the diagnostic algorithm of these patients may prevent inadequate resections and unnecessary biopsies.