木根麦冬rRNA基因进化的研究

木根麦冬（Ophiopogon xylorrhizus Wang et Dai）属于铃兰科（Convallariaceae）或广义百合科（Liliaceae s.l.）沿阶草族（Ophiopogoneae）沿阶草属（Ophiopogon Ker-Gawl.），属于典型的濒危植物。前人已从细胞学、种群生态学、生殖生物学和遗传结构与多样性等方面对木根麦冬进行了研究，但在分子进化和分子细胞遗传学水平上的研究近为空白。本文运用染色体的荧光原位杂交(FISH)、PCR扩增和克隆、DNA测序、系统发育重建等方法，对18S rDNA作了染色体原位定位，研究了木根麦冬的Ss rRNA基因结构特点，并重建了该基因的系统发育树，探讨了5S rRNA多基因家族的分子进化模式和木根麦冬的濒危机制。主要结果如下： 1．对木根麦冬三个居群七个个体、及其最近姐妹种林生麦冬（Ophiopogon svlvicola Wang et Tang）一个个体的5S rRNA基因进行了PCR扩增和TA克隆，在两个种中共得到1085个具有插入片段的阳性克隆。 2．对木根麦冬三个居群六个个体的294个SS rRNA基因克隆，及林生麦冬一个个体的45个克隆，总计339个克隆进行了DNA序列测定，这是目前已完成的最大的单个物种的5S rRNA数据。结果表明：两个种的序列高度多样化，在339个拷贝中仅仅有13对(3.8%)是相同的，序列长度变化在307bp-548bp之间，长度变异主要发生在间隔区，单个碱基的插入和缺失(indel)频率很高，5bp以上片段的插入，缺失有11个，插入的序列通常是其两侧序列的重复和倒位。术根麦冬序列的分化指数（sequence differentiation index，SDI）是0.078，林生麦冬是0.032，两个物种间是0.149，木根麦冬的序列之间的分化明显大于林生麦冬。 3．以PAUP程序对339个5S rRNA基因拷贝的DNA序列（包括编码区和间隔区）作了系统发育分析，结果如下：在得到一个唯一的最俭约树中，所有木根麦冬的拷贝被聚成一支，而林生麦冬的则被聚到另一支，统计支持率(bootstrap)达到lOO%，表明这两个物种所有的的5S rRNA基因拷贝分别来自各自的一个祖先拷贝（建立者拷贝），而其共同祖先的其它拷贝则在物种形成中或之后丢失：在多基因家族中如此长期而单一的拷贝偏选( sorting)过程尚未有前人报道;由此基因系统发育树可以看出，在这两个物种形成之后，“建立者拷贝”经历了多次扩增过程而形成了一个直系的（orthologous）多基因家族。 4．在木根麦冬分支中，很少有亚分支是全部由一个居群或一个个体的拷贝组成的，不同居群、不同个体的拷贝混合在同一个亚分支中;对基因系统发育树、序列多样性和序列分化指数分析表明，5S rRNA基因家族内一致化（homogeruzation）过程很弱，不同拷贝是独立进化的，这在串联．重复的多拷贝基因家族中是不寻常的;由上述分析我们推测，在术根麦冬的进化历史上，居群间的基因交流远远比今天频繁，可能是某些外在因素在近期发生变化，导致自交和自交衰退，并进而导致濒危。 5．利用荧光原位杂交技术，成功地将18S rRNA基因定位在木根麦冬减数分裂期的染色体上，两对强信号和一对弱信号分别位于三对二价体染色体上。

麦冬（Ophiopogon japonicus (L.f)Ker Gawl）花粉的发育、精子结构及绒毡层的变化

麦冬的花粉发育自小孢子母细胞开始，经连续型减数分裂，产生游离的单细胞小孢子;小孢子进一步发育，经两次有丝分裂，最终发育为包含有二个精细胞和一个营养核的成熟花粉。在此发育过程中，内质网、线粒体、高尔基体和脂体含量丰富。 麦冬的精子细胞为伸长的细胞，具有椭圆形的头部和长长的尾部细胞质突起，细胞器较少，是线粒体，但缺乏质体，没有明显的二型性;其精细胞伸长的尾部细胞质突起是在生殖细胞有丝分裂时产生，而不是以后由精子细胞本身发育;两个精子细胞之间除了头部的联结外，还有尾部的联接，但没有任何结构上的联结;一个精子细胞的头部常与营养核十分靠近;另外，在精子与精子之间或精子与营养核之间的贴近点上，常可见到多层膜的结构，根据精细胞之间的联结和精细胞与营养核之间的靠近，推测麦冬的成熟花粉中存在雄性生殖单位。 麦冬的花粉壁发育在四分体后期开始，首先产生纤维状的原外壁，由原外壁上依次发育出原基柱层、原覆盖层和原基足层，当四分体分离时，花粉外壁外层已发育完全;在单细胞小孢子时期，外壁内层发育，为极薄的一层，同时内壁－1开始发育;到了二细胞花粉时期，内壁－1开始发育;到了二细胞花粉时期，内壁－1发育完全，并在萌发孔处发育特殊的蜂窝状结构;紧接内壁－1层，发育出内壁－2层。在其壁发育过程中，花粉中大量沿周围平行于花粉壁排列的内质网可能与花粉壁的形成有关。 麦冬的绒毡层发育属分泌型。在小孢子母细胞时期，绒毡层细胞达到了发育的顶峰，此时，细胞器非常丰富，大量的线粒体、高尔基体和质体，尤为内质网含量最为丰富;原乌氏体出现较早，小孢子母细胞时期绒毡层细胞中就已出现;四分体时期，大量乌氏体被排入内切向面的质膜和纤维素壁之间;到了小孢子早期，绒毡层细胞失去细胞壁，原乌氏体分布在质膜的凹陷处，孢粉素物质开始在其上沉积，发育为乌氏体，乌氏体有单个和复合两种类型;到花粉成熟时，绒毡层细胞彻底解体。

An efficient combination of supercritical fluid extraction and high-speed counter-current chromatography to extract and purify homoisoflavonoids from Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker-Gawler

Supercritical fluid extraction (SFE) was used to extract homoisoflavonoids from Ophiopogon japonicus (Thunb.) Ker-Gawler. The optimization of parameters was carried out using an orthogonal test L-9 (3)(4) including pressure, temperature, dynamic extraction time and the amount of modifier. The process was then scaled up by 100 times with a preparative SFE system under the optimized conditions of 25 MPa, 55 degrees C, 4.0 h and 25% methanol as a modifier. Then crude extracts were separated and purified by high-speed counter-current chromatography (HSCCC) with a two-phase solvent system composed of n-hexane/ethyl acetate/methanol/ACN/water (1.8:1.0:1.0:1.2:1.0 v/v). There three homoisoflavonoidal compounds including methylophiopogonanone A 6-aldehydo-isoophiopogonone A, and 6-formyl-isoophiopogonanone A, were successfully isolated and purified in one step. The collected fractions were analyzed by HPLC. In each operation, 140 mg crude extracts was separated and yielded 15.3 mg of methylophiopogonanone A (96.9% purity), 4.1 mg of 6-aldehydo-isoophiopogonone A (98.3% purity) and 13.5 mg of 6-formyl-isoophiopogonanone A (97.3% purity) respectively. The chemical structure of the three homoisoflavonoids are identified by means of ESI-MS and NMR analysis.

沿阶草族的染色体研究及系统学问题的探讨

本论文对沿阶草族Ophiopogoneae(Endl.)Kunth的研究历史作了回顾，从染色体、形态学和解剖学角度对此族作了研究，并作了数值分类和分支 系统学分析的尝试，在此基础上探讨了这个族的系统学问题． 1)本论文对此族三属37种123居群的染色体数目、基数及核型不对称性作了研究，其中19种的染色体为首次报道．它们是：P．macrostegiaHance， P.yunnanensis Wang et Tang，P.ophiopogonoides Wang et Tang,O. sarmentosus Wang et Dai,O.tienensis Wang et Tang, O.sylvicola Wang et Tang, O.fooningensis Wang et Dai, O.mairei L6vl.，O.szechuanensis Wang et Tang, O.angustiatus (Wang et Tang) S.C.Chen, O.amblyphyllus Wang et Dai,O.clavatus Wright ex Oliver,O.clivioidesD.M.Zhang et Hong, O.longiscaposus D.M.Zhang et Hong,O.umbraticola Hance,O.fuiD.M.Zhang ntHong,O.zingiberaceus Wang et Dai,O.gangxiensisd.M.Zhang et Hong,O. lo fouense L6vl. 2)在此族中首次报道了2n = 2x = 34的异基数二倍体，同时在O.umbraticola，O.japonicus,O.cLarkei中报道了2n=68的异基数二倍体，过核型和减数分裂等证明异基数是在二倍体水平上形成，并发展成倍性系列的． 3)在此族中首次报道了B染色体的存在，已确证了两种(P.macrostegia和D.tienensis)．一种尚需进一步确证(O.Larkei)． 4)通过对随体位置的系统研究，发现在此族中随体位置具有分类价值． 5)通过对8个种内多倍体、4个多倍体种的研究，表明多倍体分布于较北、海拔较高的地方，而亚洲热带地区的种，则无多倍体，同时在具异基数种类和核型较不对称种类上亦有这种分布特征;在确定了分布的多度中心的基础上，提出喜马拉雅_横断山脉到川西、川南一带是沿阶草属和山麦冬属的近代分化中心． 6)通过染色体结构和数目几个角度的研究，表明球子草属与其他两属在。染色体水平上已发生很大分化，但其属内的分化则不表现在染色体上．其他二属内部则有基数、倍性和核型不对称方面的分化．综观此族，染色体具有由核 型对称向不对称、由二倍体向多倍体、由种内多倍体向多倍体种，由单一基数向种内异基数几个方向进化的趋势． 7)通过对此族的形态观察和分析，提出茎或根状茎分枝方式是属下分类的重要依据;认为本族植物的花序是由圆锥花序简化而来，但残留着圆锥花序特征;并提出了本族花、茎、叶、根几个方面的形态演化趋势． 8)通过对此族二属21种的子房解剖，发现三属均有半下位子房，因而认为子房半下位作为分属检索性状是不合适的．此外还观察到子房着生位置在种内亦有变异，对这种变异的意义进行了探讨． 9)通过此族三属46种2变种的数值分类处理，表明本族由球子草群和沿阶草一山麦冬群两大类群组成，山麦冬属仅是与沿阶草属一个组（葶花组）并列的分类单元，其内部分化较小，而沿阶草属则较大． 10)通过46个性状计算了山麦冬属和沿阶草属共6个广布的“群内总体相 似度”(IOS)，表明山麦冬属3个种种内个体之间、种间个体之间的分化很小，且可能有杂交现象，结合染色体资料和分布特征，认为这个属的发生是个相当晚近的事件． 11)本文从形态和染色体角度，认为沿阶草族是一个自然类群;由分支系 统学分析表明，此族由二个单系类群（球子草属和沿阶草属）组成，沿阶草属含两个单系的组，其中各含3个系，山麦冬属为其中一个系．这一结果与数值 分类结果和染色体资料相符． 12)为避免单一分类方法可能导致的不合理结果，本文以自拟的一种综合分类方法，把谱系、进化、分化诸因素均予考虑，得出一个三维图象，以图象 上相对等径的球作为分类依据，得出的结果与分支系统学和数值分类结果基本一致．因此，山麦冬属作为与沿阶草属等阶的分类地位，应予重新考虑． 13）本文最后对这个族的全面修订提出几点建议. 14）此外，本文还描述了沿阶草属4个新种.

木根麦冬基因流动与居群遗传变异的时空动态研究

本报告对木根麦冬的生态、遗传与进化等方面进行了综合研究，分析了木根麦冬居群内个体育性变异与基因流的模式与强度，研究了木根麦冬居群遗传变异在时间与空间的动态变化过程，深入探讨了该物种的适应策略、自然选择与进化模式。同时对生物进化中的一些基本问题进行了尝试性探讨。 一、影响有性繁殖生物居群中交配与繁殖成功的行为、生态与遗传现象最终决定等位基因与基因型的相对频率及其在世代间的变化。植物的交配系统不仅决定了居群未来世代的基因型频率，而且还影响到植物居群的有效大小、基因流和选择等其它进化因素。我们利用等位酶多态性，采用似然性方法与计算机模拟为木根麦冬三个居群的种子确定父本。共有90.1%的种子可以在居群中找到唯一的最可能父本。在这些种子中，56.1%在0.95的显著水平上可以确定唯一亲本。并且还发现：1．个体自交越多，产生的种子就越多;2．个体提供 给自己的有效花粉比提供给别的植株的有效花粉多，3．只接受花粉而不提供花粉的植株产生的种子少;4．只接受花粉而不提供花粉的植株产生种子的机会也少，综合我们以前的研究结果，可以认为，木根麦冬的交配系统正在或已经发 生了转变，从以异交为主到以自交为主。 二、点模式分析的结果表明在所研究的三个居群中，木根麦冬个体都表现出相对随机的分布。空间自相关分析却发现开花个体在空间聚集分布，呈斑块状开花。这个结果也表明个体空间分布模式与开花状态没有直接关系，集团性开花可能是一个促进花粉传播的适应特征：开花个体的聚集可能对传粉者形成强有力的吸引。空间自相关分析表明木根麦冬居群中大多数等位基因都聚集成一定大小的斑块。基因的聚集突出的说明了木根麦冬居群内基因流动的状况，花粉与种子的传播受到限制。传粉能力弱的传粉者以及种子的近距离的散布使基因局限于一定的小范围内，从而形成基因斑块，而斑块的大小由传粉者的活动范围及种子的传播距离决定。 三、基因纯合导致有害的隐性基因或部分致死的基因表达，使纯合子适合度降低，因此纯合子频率在世代间的变化将是衡量近交衰退的一个较好的指标。木根麦冬中亲代居群的观察杂合度大大高于子代居群，这个结果表明大量的纯合子在从种子到成株的过程中被淘汰。大量的纯合子被淘汰可能时由于隐性致死或有害等位基因纯合的结果，自交以及有亲缘关系的个体之间交配使有害等位基因与致死等位基因纯合，从而使一个远交种中出现自交衰退，过量的纯合子被淘汰是自交衰退的直接后果。

Tropical influence in oriental gardens in Brazil

In the contemporary landscaping, among the gardening styles, the Japanese Garden plays very important rule and influence. The Japanese Garden has originated in China-the cradle of gardening culture; and Korea. Their vegetable elements, architectural features and fauna are characteristic, due to use of stones, water, bridges, stoned lamp, bonsai, carps and bamboo (Prunus serrulata, Camellia japonica, Ophiopogon japonicas) and many others. In Brazil, the Japanese Garden has massive influence, the presence of native elements typically tropical is very noticeable. This influence can be observed both in architecture, vegetation and fauna. Thus, this study aimed to identify and analyze the tropical elements in Japanese Gardens in cities such as São Paulo. Japanese Gardens in Brazil were chosen from the following cities: Sao Paulo State, Garça, Jaboticabal and Ribeirão Preto. It was observed, mostly in the presence of different palms species, plants of the Zingiberales order, Alpinia purpurata and styled architectural elements such as lakes. Some elements were able to apply the philosophy of the Japanese Garden, other not.

Caractérisation et délimitation des sous-espèces de Gesneria viridiflora (Gesneriaceae) dans les Antilles

Une taxonomie révisée et une connaissance des limites d’espèces demeurent toujours importantes dans les points chauds en biodiversité comme les Antilles où de nombreuses espèces endémiques sont retrouvées. Des limites d’espèces divergentes impliquent un différent nombre d’espèces retrouvées dans un écosystème, ce qui peut exercer une influence sur les décisions prises face aux enjeux de conservation. Les genres Gesneria et Rhytidophyllum qui forment les principaux représentants de la famille des Gesneriaceae dans les Antilles comprennent plusieurs taxons aux limites d’espèces ambigües et quelques espèces qui ont des sous-espèces reconnues. C’est le cas de Gesneria viridiflora (Decne.) Kuntze qui comprend quatre sous-espèces géographiquement isolées et qui présentent des caractères végétatifs et reproducteurs similaires et variables. Une délimitation d’espèces approfondie de ce complexe d’espèce est effectuée ici à partir d’une approche de taxonomie intégrative considérant des données morphologiques, génétiques et bioclimatiques. Les données morphologiques quantitatives et qualitatives obtenues à partir de spécimens d’herbier sont utilisées pour délimiter des groupes morphologiques à l’aide d’une analyse en coordonnées principales. Ces groupes sont ensuite testés à l’aide de séquences d’ADN de quatre régions nucléaires en utilisant une méthode bayesienne basée sur la théorie de la coalescence. Finalement, les occurrences et les valeurs de variables de température et de précipitation qui y prévalent sont utilisées dans une analyse en composantes principales bioclimatique pour comparer les groupes délimités morphologiquement et génétiquement. Les résultats de l’analyse morphologique multivariée supportent la distinction entre les groupes formés par les sous-espèces actuellement reconnues de G. viridiflora. Les résultats, incluant des données génétiques, suggèrent une distinction jusqu’ici insoupçonnée des populations du Massif de la Hotte au sud-ouest d’Haïti qui sont génétiquement plus rapprochées des populations de Cuba que de celles d’Hispaniola. Bioclimatiquement, les groupes délimités par les analyses morphologiques et génétiques sont distincts. L’approche de taxonomie intégrative a permis de distinguer cinq espèces distinctes plutôt que les quatre sous-espèces acceptées jusqu’à aujourd’hui. Ces espèces sont : G. acrochordonanthe, G. quisqueyana, G. sintenisii, G. sylvicola et G. viridiflora. Une carte de distribution géographique, un tableau de la nouvelle taxonomie applicable et une clé d’identification des espèces sont présentés. La nouvelle taxonomie déterminée dans cette étude démontre un endémisme insoupçonné dans plusieurs régions du point chaud en biodiversité des Antilles et souligne l’importance d’investiguer les limites d’espèces dans les groupes diversifiés comprenant des taxons aux limites d’espèces incomprises.

Caractérisation et délimitation des sous-espèces de Gesneria viridiflora (Gesneriaceae) dans les Antilles

Une taxonomie révisée et une connaissance des limites d’espèces demeurent toujours importantes dans les points chauds en biodiversité comme les Antilles où de nombreuses espèces endémiques sont retrouvées. Des limites d’espèces divergentes impliquent un différent nombre d’espèces retrouvées dans un écosystème, ce qui peut exercer une influence sur les décisions prises face aux enjeux de conservation. Les genres Gesneria et Rhytidophyllum qui forment les principaux représentants de la famille des Gesneriaceae dans les Antilles comprennent plusieurs taxons aux limites d’espèces ambigües et quelques espèces qui ont des sous-espèces reconnues. C’est le cas de Gesneria viridiflora (Decne.) Kuntze qui comprend quatre sous-espèces géographiquement isolées et qui présentent des caractères végétatifs et reproducteurs similaires et variables. Une délimitation d’espèces approfondie de ce complexe d’espèce est effectuée ici à partir d’une approche de taxonomie intégrative considérant des données morphologiques, génétiques et bioclimatiques. Les données morphologiques quantitatives et qualitatives obtenues à partir de spécimens d’herbier sont utilisées pour délimiter des groupes morphologiques à l’aide d’une analyse en coordonnées principales. Ces groupes sont ensuite testés à l’aide de séquences d’ADN de quatre régions nucléaires en utilisant une méthode bayesienne basée sur la théorie de la coalescence. Finalement, les occurrences et les valeurs de variables de température et de précipitation qui y prévalent sont utilisées dans une analyse en composantes principales bioclimatique pour comparer les groupes délimités morphologiquement et génétiquement. Les résultats de l’analyse morphologique multivariée supportent la distinction entre les groupes formés par les sous-espèces actuellement reconnues de G. viridiflora. Les résultats, incluant des données génétiques, suggèrent une distinction jusqu’ici insoupçonnée des populations du Massif de la Hotte au sud-ouest d’Haïti qui sont génétiquement plus rapprochées des populations de Cuba que de celles d’Hispaniola. Bioclimatiquement, les groupes délimités par les analyses morphologiques et génétiques sont distincts. L’approche de taxonomie intégrative a permis de distinguer cinq espèces distinctes plutôt que les quatre sous-espèces acceptées jusqu’à aujourd’hui. Ces espèces sont : G. acrochordonanthe, G. quisqueyana, G. sintenisii, G. sylvicola et G. viridiflora. Une carte de distribution géographique, un tableau de la nouvelle taxonomie applicable et une clé d’identification des espèces sont présentés. La nouvelle taxonomie déterminée dans cette étude démontre un endémisme insoupçonné dans plusieurs régions du point chaud en biodiversité des Antilles et souligne l’importance d’investiguer les limites d’espèces dans les groupes diversifiés comprenant des taxons aux limites d’espèces incomprises.