木根麦冬rRNA基因进化的研究

木根麦冬（Ophiopogon xylorrhizus Wang et Dai）属于铃兰科（Convallariaceae）或广义百合科（Liliaceae s.l.）沿阶草族（Ophiopogoneae）沿阶草属（Ophiopogon Ker-Gawl.），属于典型的濒危植物。前人已从细胞学、种群生态学、生殖生物学和遗传结构与多样性等方面对木根麦冬进行了研究，但在分子进化和分子细胞遗传学水平上的研究近为空白。本文运用染色体的荧光原位杂交(FISH)、PCR扩增和克隆、DNA测序、系统发育重建等方法，对18S rDNA作了染色体原位定位，研究了木根麦冬的Ss rRNA基因结构特点，并重建了该基因的系统发育树，探讨了5S rRNA多基因家族的分子进化模式和木根麦冬的濒危机制。主要结果如下： 1．对木根麦冬三个居群七个个体、及其最近姐妹种林生麦冬（Ophiopogon svlvicola Wang et Tang）一个个体的5S rRNA基因进行了PCR扩增和TA克隆，在两个种中共得到1085个具有插入片段的阳性克隆。 2．对木根麦冬三个居群六个个体的294个SS rRNA基因克隆，及林生麦冬一个个体的45个克隆，总计339个克隆进行了DNA序列测定，这是目前已完成的最大的单个物种的5S rRNA数据。结果表明：两个种的序列高度多样化，在339个拷贝中仅仅有13对(3.8%)是相同的，序列长度变化在307bp-548bp之间，长度变异主要发生在间隔区，单个碱基的插入和缺失(indel)频率很高，5bp以上片段的插入，缺失有11个，插入的序列通常是其两侧序列的重复和倒位。术根麦冬序列的分化指数（sequence differentiation index，SDI）是0.078，林生麦冬是0.032，两个物种间是0.149，木根麦冬的序列之间的分化明显大于林生麦冬。 3．以PAUP程序对339个5S rRNA基因拷贝的DNA序列（包括编码区和间隔区）作了系统发育分析，结果如下：在得到一个唯一的最俭约树中，所有木根麦冬的拷贝被聚成一支，而林生麦冬的则被聚到另一支，统计支持率(bootstrap)达到lOO%，表明这两个物种所有的的5S rRNA基因拷贝分别来自各自的一个祖先拷贝（建立者拷贝），而其共同祖先的其它拷贝则在物种形成中或之后丢失：在多基因家族中如此长期而单一的拷贝偏选( sorting)过程尚未有前人报道;由此基因系统发育树可以看出，在这两个物种形成之后，“建立者拷贝”经历了多次扩增过程而形成了一个直系的（orthologous）多基因家族。 4．在木根麦冬分支中，很少有亚分支是全部由一个居群或一个个体的拷贝组成的，不同居群、不同个体的拷贝混合在同一个亚分支中;对基因系统发育树、序列多样性和序列分化指数分析表明，5S rRNA基因家族内一致化（homogeruzation）过程很弱，不同拷贝是独立进化的，这在串联．重复的多拷贝基因家族中是不寻常的;由上述分析我们推测，在术根麦冬的进化历史上，居群间的基因交流远远比今天频繁，可能是某些外在因素在近期发生变化，导致自交和自交衰退，并进而导致濒危。 5．利用荧光原位杂交技术，成功地将18S rRNA基因定位在木根麦冬减数分裂期的染色体上，两对强信号和一对弱信号分别位于三对二价体染色体上。