Synthesis, biological activity, and preliminary pharmacokinetic evaluation of analogues of a phosphosulfomannan angiogenesis inhibitor (PI-88)

The phosphosulfomannan 1 (PI-88) is a mixture of highly sulfated oligosaccharides that is currently undergoing clinical evaluation in cancer patients. As well as it's anticancer properties, 1 displays a number of other interesting biological activities. A series of analogues of 1 were synthesized with a single carbon (pentasaccharide) backbone to facilitate structural characterization and interpretation of biological results. In a fashion similar to 1, all compounds were able to inhibit heparanase and to bind tightly to the proangiogenic growth factors FGF-1, FGF-2, and VEGF. The compounds also inhibited the infection of cells and cell-to-cell spread of herpes simplex virus (HSV-1). Preliminary pharmacokinetic data indicated that the compounds displayed different pharmacokinetic behavior compared with 1. Of particular note was the n-octyl derivative, which was cleared 3 times less rapidly than 1 and may provide increased systemic exposure.

Oleaginous yeast Cryptococcus curvatus exhibits interplay between biosynthesis of intracellular sugars and lipids

Patterns of the biosynthesis ofmajor metabolites of the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus NRRL Y-1511 were investigated during cultivation on sugar-based media. When lactose or sucrose was employed as substrate under nitrogen-limited conditions, the yeast strain accumulated high quantities of intra-cellular total sugars (ITS) at the beginning of fermentation (up to 68% w/w), with ITS values progressively decreasing to 20%, w/w, at the end of the fermentation. Decrease in ITS content and consumption of extracellular lactose led to a subsequent rise in lipid accumulation, reaching 29.8% in dry cell weight at 80 g/L of initial lactose concentration. Lactose was a more favorable substrate for lipid production than sucrose. In nitrogen-excess conditions, ITS were produced in significant quantities despite the continuous presence of nitrogen in the medium. Growth on lactose was not followed by secretion of extra-cellular b-galactosidase. High quantities of extra-cellular invertase were observed during growth on sucrose. The composition of ITS was highly influenced by the sugar used as substrate. Cellular lipids contained mainly palmitic and to lesser extent linoleic and stearic acids. This is the first report in the literature that demonstrates the interplay between the biosynthesis of intra-cellular total sugars and lipid synthesis for oleaginous yeast strains.

Sympodiomyces attinorum sp nov., a yeast species associated with nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens

Four strains of a novel yeast species were isolated from laboratory nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens in Brazil. Three strains were found in older sponges and one was in a waste deposit in the ant nests. Sequencing of the D1/D2 region of the large-subunit rRNA gene showed that the novel species, named Sympodiomyces attinorum sp. nov., is phylogenetically related to Sympodiomyces parvus. Unlike Sympodiomyces parvus, Sympodiomyces attinorum can ferment glucose, assimilate methyl alpha-D-glucoside, salicin and citrate, and grow at 37 degreesC, thus enabling these two species to be distinguished. Differentiation from other related species is possible on the basis of other growth characteristics. The type strain of Sympodiomyces attinorum is UNESP-S156(T) (=CBS 9734(T)=NRRL Y-27639(T)).

Candida flosculorum sp nov and Candida floris sp nov., two yeast species associated with tropical flowers

Two ascomycetous yeast species, Candida flosculorum sp. nov. and Candida floris sp. nov., were isolated from tropical flowers and their associated insects. C. flosculorum was isolated from flower bracts of Heliconia velloziana and Heliconia episcopalis (Heliconiaceae) collected from two Atlantic rain forest sites in Brazil. C. floris was isolated from flowers of lpomoea sp. (Convolvulaceae) growing on the banks of the river Paraguai in the pantanal ecosystem in Brazil and from an adult of the stingless bee Trigona sp. and a flower of Merremia quinquefolia (Convolvulaceae) in Costa Rica. C. flosculorum belongs to the Metschnikowiaceae clade and C. floris belongs to the Starmerella clade. The type strain of C. flosculorum is UFMG-JL13(T) (=CBS 10566(T) =NRRL Y-48258(T)) and the type strain of C. floris is UWO(PS) 00-226.2(T) (=CBS 10593(T) =NRRL Y-48255(T)).

Candida bromeliacearum sp nov and Candida ubatubensis sp nov., two yeast species isolated from the water tanks of Canistropsis seidelii (Bromeliaceae)

Strains belonging to two novel yeast species, Candida bromeliacearum and Candida ubatubensis, were isolated from the bromeliad tank of Canistropsis seidelii (Bromeliaceae) in a sandy coastal plain (restinga) ecosystem site in an Atlantic rainforest of south-eastern Brazil. These species were genetically distinct from all other currently accepted ascomycetous yeasts, based on sequence divergence in the D1/D2 domains of the large-subunit rDNA and in the small-subunit rDNA. The species occupy basal positions in the Metschnikowiaceae clacle. The type strains are Candida bromeliacearum UNESP 00-103(T) (=CBS 10002(T) = NRRL Y-27811(T)) and Candida ubatubensis UNESP 01-247R(T) (=CBS 10003(T) = NRRL Y-27812(T)).

Candida leandrae sp nov., an asexual ascomycetous yeast species isolated from tropical plants

The novel yeast species Candida leandrae is described based on eight isolates from decaying fruits of Leandra reversa Cogn. (Melastomataceae) in an Atlantic rainforest site in Brazil, one from a Convolvulaceae flower in Costa Rica and one from a drosophilid in Hawai'i. The strains differed in their colony morphology, one being butyrous and smooth and the other being filamentous and rugose. Sequences of the D1/D2 domains of the large-subunit rRNA gene from both morphotypes were identical. C. leandrae belongs to the Kodamaea clade and is closely related to Candida restingae. The two species can be separated on the basis of growth at 37degreesC and the assimilation of melezitose, negative in the novel species. The type culture of C. leandrae is strain UNESP 00-64R(T) (= CBS 9735(T) = NRRL Y-27757(T)).

Candida heliconiae sp nov., Candida picinguabensis sp nov and Candida saopaulonensis sp nov., three ascomycetous yeasts from Heliconia velloziana (Heliconiaceae)

Strains belonging to three novel yeast species, Candida heliconiae (four isolates), Candida picinguabensis (three isolates) and Candida saopaulonensis (two isolates), were recovered in the year 2000 from water of flower bracts of Heliconia velloziana L. Emigd. (Heliconiaceae) found in a forest ecosystem site in an Atlantic rainforest of south-eastern Brazil. C. picinguabensis and C. saopaulonensis were nearly identical in morphology and physiology, but sequence divergence in the D1/D2 domain of the large-subunit rDNA indicated that they should be regarded as different species. They belong to the Metschnikowiaceae clade. C. heliconiae had affinities to Pichia mexicana and related species, but was genetically isolated from all currently accepted species in that group. The type strains are C. heliconiae UNESP 00-91 C1(T) (= CBS 10000(T) = NRRL Y-27813(T)), C. picinguabensis UNESP 00-89(T) (= CBS 9999(T) = NRRL Y-27814(T)) and C. saopaulonensis UNESP 00-99(T) (=CBS 10001(T) = NRRL Y-27815(T)).

Bandoniozyma gen. nov., a Genus of Fermentative and Non-Fermentative Tremellaceous Yeast Species

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Prospecção de bioprodutos de interesse industrial a partir da fermentação do glicerol por leveduras

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Unraveling the structure of sugarcane bagasse after soaking in concentrated aqueous ammonia (SCAA) and ethanol production by Scheffersomyces (Pichia) stipitis

Abstract Background Fuel ethanol production from sustainable and largely abundant agro-residues such as sugarcane bagasse (SB) provides long term, geopolitical and strategic benefits. Pretreatment of SB is an inevitable process for improved saccharification of cell wall carbohydrates. Recently, ammonium hydroxide-based pretreatment technologies have gained significance as an effective and economical pretreatment strategy. We hypothesized that soaking in concentrated aqueous ammonia-mediated thermochemical pretreatment (SCAA) would overcome the native recalcitrance of SB by enhancing cellulase accessibility of the embedded holocellulosic microfibrils. Results In this study, we designed an experiment considering response surface methodology (Taguchi method, L8 orthogonal array) to optimize sugar recovery from ammonia pretreated sugarcane bagasse (SB) by using the method of soaking in concentrated aqueous ammonia (SCAA-SB). Three independent variables: ammonia concentration, temperature and time, were selected at two levels with center point. The ammonia pretreated bagasse (SCAA-SB) was enzymatically hydrolysed by commercial enzymes (Celluclast 1.5 L and Novozym 188) using 15 FPU/g dry biomass and 17.5 Units of β-glucosidase/g dry biomass at 50°C, 150 rpm for 96 h. A maximum of 28.43 g/l reducing sugars corresponding to 0.57 g sugars/g pretreated bagasse was obtained from the SCAA-SB derived using a 20% v/v ammonia solution, at 70°C for 24 h after enzymatic hydrolysis. Among the tested parameters, pretreatment time showed the maximum influence (p value, 0.053282) while ammonia concentration showed the least influence (p value, 0.612552) on sugar recovery. The changes in the ultra-structure and crystallinity of native SCAA-SB and enzymatically hydrolysed SB were observed by scanning electron microscopy (SEM), x-ray diffraction (XRD) and solid-state 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. The enzymatic hydrolysates and solid SCAA-SB were subjected to ethanol fermentation under separate hydrolysis and fermentation (SHF) and simultaneous saccharification and fermentation (SSF) by Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124 respectively. Higher ethanol production (10.31 g/l and yield, 0.387 g/g) was obtained through SSF than SHF (3.83 g/l and yield, 0.289 g/g). Conclusions SCAA treatment showed marked lignin removal from SB thus improving the accessibility of cellulases towards holocellulose substrate as evidenced by efficient sugar release. The ultrastructure of SB after SCAA and enzymatic hydrolysis of holocellulose provided insights of the degradation process at the molecular level.

Optimization of lipase production from yeasts strains isolated from olive mil wastewater

Dissertação submetida à Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Aplicada.

Produção de lipídios microbianos a partir de glicerol bruto gerado na síntese de biodiesel

Diante da grande quantidade de glicerol bruto gerado na síntese do biodiesel e seu baixo valor comercial, torna-se fundamental encontrar formas alternativas para converter este substrato em produtos com valor agregado. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes leveduras oleaginosas capazes de metabolizar o glicerol bruto, gerado como coproduto na síntese de biodiesel, visando produzir biomassa como fonte de lipídios. Todos os cultivos foram realizados em frascos agitados, em condições estabelecidas de acordo com cada etapa do trabalho, sendo obtidos dados relativos ao crescimento celular e à produção de lipídios, tratados estatisticamente conforme o propósito. Lipomyces lipofer NRRL Y-1155 apresentou diferenças significativas em relação às outras leveduras oriundas de banco de cultura, atingindo 57,64% de lipídios na biomassa. Estas leveduras apresentarem perfis de ácidos graxos diferenciados, semelhantes aos dos principais óleos vegetais utilizadas na síntese de biodiesel, com predominância de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente ácido linoleico (68,3% na levedura Rhodotorula glutinis NRRL YB-252). O ácido gama-linolênico, um ácido graxo essencial ω6, foi detectado em todas as leveduras analisadas, sendo que na biomassa de Candida cylindracea NRRL Y-17506 chegou a 23,1%. Através de um planejamento experimental Plackett-Burman, verificou-se que as variáveis concentração de extrato de levedura e de MgSO4.7H20 demonstraram maior influência na produção de lipídios por uma linhagem silvestre de Rhodotorula mucilaginosa. Para esta levedura, a partir da análise de efeitos foi possível estabelecer a seguinte condição para a produção de lipídios: 30,0 g.L-1 glicerol; 5,0 g.L-1 KH2PO4; 1,0 g.L-1 Na2HPO4; 3,0 g.L-1 MgSO4.7H2O; 1,2 g.L-1 extrato de levedura; pH inicial 4,5; temperatura 25°C. Nestas condições conseguiu-se um teor de lipídios de 59,96% e lipídios totais produzidos de 5,51 g.L-1 . Também foi possível observar aumento no teor de lipídios da biomassa ao longo do tempo de cultivo, bem como o aumento do teor relativo do ácido linoleico, que atingiu 52%. Dentre as leveduras isoladas a partir de amostras ambientais do Extremo Sul do Brasil, a levedura identificada como Cryptococcus humicola se destacou das demais, apresentando proporção de 23,5% de ácidos graxos saturados, 14,8% de ácidos graxos monoinsaturados e 54,9% de ácidos graxos poli-insaturados, destacando-se o ácido linoleico. O planejamento Plackett-Burman foi também utilizado para esta levedura, sendo que as variáveis concentração de extrato de levedura e glicerol bruto demonstraram maior influência na produção de lipídios. Posteriormente, um delineamento composto central rotacional (DCCR) foi proposto visando à otimização da produção de lipídios. Os modelos empíricos preditivos obtidos para biomassa máxima e lipídios totais permitiram estabelecer para a produção de lipídios por Cryptococcus humicola a seguinte condição otimizada: 100,0 g.L-1 glicerol; 5,0 g.L-1 KH2PO4; 1,0 g.L-1 Na2HPO4; 4,8 g.L-1 extrato de levedura; pH inicial 4,5; temperatura 25°C. Esta condição representou um incremento de cerca de 2 vezes nos lipídios totais em relação à melhor condição estabelecida pelo planejamento Plackett-Burmann e um acréscimo de cerca de 4,8 vezes em relação às condições testadas inicialmente, atingindo 37,61% de lipídios e 8,85 g.L-1 de lipídios totais. Deste modo, os propósitos de valorização de um coproduto oriundo da síntese de biodiesel, bem como a produção de um óleo com potencial para a produção de biodiesel, foram cumpridos.

Isolamento, seleção e cultivo de leveduras com potencia biotecnológico para a produção de endo-xilaneses

Xilanases são enzimas que catalisam a hidrólise das xilanas e têm sido em grande parte, obtidas a partir de bolores e bactérias. No entanto poucos estudos têm sido relatados sobre a produção destas enzimas por leveduras. O presente trabalho teve como objetivo isolar leveduras de diferentes fontes vegetais visando à produção de xilanases, além de maximizar sua produção, estudar o uso de diferentes fontes de nitrogênio e cultivar as leveduras em meios contendo coprodutos agroindustriais. As amostras de alimentos e resíduos foram enriquecidas em caldo extrato de malte e levedura e isoladas em Ágar Nutriente Wallerstein, as leveduras isoladas foram, a seguir, avaliadas quanto à capacidade de degradar xilana presente no meio e produzir halos de hidrólise, os quais foram visualizados através do uso do corante vermelho congo. Os micro-organismos selecionados como potenciais produtores de xilanase foram crescidos em meio complexo líquido e as atividades enzimáticas de endoxilanase, β-xilosidase, carboximetilcelulase, celulase total, pH e concentração de biomassa foram avaliadas ao longo de 96 h de cultivo. Dentre as leveduras isoladas, sete foram selecionadas, e a 18Y foi a que apresentou a maior atividade de endo- xilanase (2,7 U.mL-1 ), sendo esta isolada de chicória e identificada como Cryptococcus laurentii. Esta estirpe apresentou capacidade de produzir xilanase com baixos níveis de celulase, sendo assim selecionada neste trabalho. A maximização de endo-xilanase foi avaliada fazendo uso de planejamento experimental onde primeiramente foi realizado um planejamento fracionário 2 6-2 para verificar os efeitos do pH inicial e as concentrações de xilana, peptona, (NH4)2SO4, extrato de levedura e KH2PO4 sobre a atividade enzimática. Após selecionar as variáveis xilana, peptona, pH e extrato de levedura foi realizado um delineamento composto central rotacional (24 ) onde todos os cultivos foram mantidos a 30°C, 150 rpm durante 96 h sendo retiradas alíquotas para determinação das atividades, pH e biomassa. A produção máxima foi de 6,9 U.mL-1 usando 10,0 g.L-1 de extrato de levedura, 10,0 g.L-1 de peptona, 10,0 g.L-1 de xilana, 1,0 g.L-1 de (NH4)2SO4 em pH 6,5 o que permitiu um incremento de mais de 250% sobre a atividade. Posteriormente foram realizados ensaios avaliando diferentes fontes e concentrações de nitrogênio orgânico e inorgânico. A presença de NH4NO3 e (NH₄)₂SO₄ usados na concentração de 3% proporcionaram as maiores atividades de endo-xilanase (6,2 e 6,0 U.mL-1 respectivamente). O sulfato de amônio foi selecionado e fixado em 1 g.L-1 e logo após um planejamento completo 22 foi realizado onde as variáveis xilana e extrato de levedura foram estudadas e as demais fixadas. As condições ótimas estabelecidas para a produção da enzima foram: concentração de xilana de 18,6 g.L-1 , concentração de extrato de levedura de 10 g.L-1 atingindo 14 U.mL-1 . Após a maximização enzimática estudou-se o crescimento de Pichia pastoris NRRL Y-1603 e Cryptococcus laurentti em cinco substratos agroindustriais visando a possibilidade estes substratos substituírem a xilana em cultivos para a produção de endo-xilanase. Os ensaios foram realizados utilizando os subtratos pré-tratados com NaOH 4% e não tratados. Para inserção dos mesmos aos meios de cultivo, estes foram moídos e adicionados na concentração de 2%. O pré-tratamento para todos as fontes de hemicelulose foi eficiente e promoveu aumento nas atividades produzidas. Cryptococcus laurentti apresentou maior atividade enzimática (8,7 U.mL-1 ) em farelo de arroz desengordurado e pré- tratado enquanto que a levedura Pichia pastoris NRRL Y-1603 apresentou sua melhor condição para produção de endo-xilanase quando cultivada em meio contendo casca de aveia e o farelo de arroz pré-tratados, alcançando atividades máximas de 7,6 e 7,5 U.mL-1 .

Sympodiomyces attinorum sp nov., a yeast species associated with nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens

Four strains of a novel yeast species were isolated from laboratory nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens in Brazil. Three strains were found in older sponges and one was in a waste deposit in the ant nests. Sequencing of the D1/D2 region of the large-subunit rRNA gene showed that the novel species, named Sympodiomyces attinorum sp. nov., is phylogenetically related to Sympodiomyces parvus. Unlike Sympodiomyces parvus, Sympodiomyces attinorum can ferment glucose, assimilate methyl alpha-D-glucoside, salicin and citrate, and grow at 37 degreesC, thus enabling these two species to be distinguished. Differentiation from other related species is possible on the basis of other growth characteristics. The type strain of Sympodiomyces attinorum is UNESP-S156(T) (=CBS 9734(T)=NRRL Y-27639(T)).

Caracterización histopatológica de un modelo de neumonía tóxica por inoculación de 3-metil indol en borregos y ratas

UANL