Études des interactions entre la mucine et certains polymères bioadhésifs

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Études des interactions entre la mucine et certains polymères bioadhésifs

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude de la protéine sigma 1 de réovirus par génétique inverse.

Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus.

Inconclusive results in conventional serological screening for Chagas` disease in blood banks: evaluation of cellular and humoral response

To find the most reliable screening method for Trypanosoma cruzi infection in blood banks. Epidemiological data, lymphoproliferation assay, parasitological, conventional serological tests: immunofluorescence, haemagglutination, ELISA with epimastigote and trypomastigote antigens and reference serological tests: trypomastigote excreted-secreted antigens (TESA) blot and chemiluminescent ELISA assay with mucine from trypomastigote forms were applied to individuals with inconclusive serology, non-chagasic individuals and chronic chagasic patients. TESA blot had the best performance when used as a single test in all the groups. In the inconclusive group 20.5% of individuals were positive for TESA blot, 23.3% for either lymphoproliferation or TESA blot, and 17.8% for lymphoproliferation only. Positive lymphoproliferation without detectable antibodies was observed in 5.47% of all inconclusive serology cases. Analysis of six parameters (three serological assays, at least one parasitological test, one lymphoproliferation assay and epidemiological data) in the inconclusive group showed that diagnosis of Chagas` disease was probable in 15 patients who were positive by two or more serological tests or for whom three of those six parameters were positive. TESA blot is a good confirmatory test for Chagas` disease in the inconclusive group. Although lymphoproliferation suggests the diagnosis of Chagas` disease in the absence of antibodies when associated with a high epidemiological risk of acquiring Chagas` disease, the data from this study and the characteristics of the lymphoproliferation assay (which is both laborious and time-consuming) do not support its use as a confirmatory test in blood-bank screening. However, our findings underscore the need to develop alternative methods that are not based on antibody detection to improve the diagnosis when serological tests are inconclusive.

Dressing liposomal particles with chitosan and poly(vinylic alcohol) for oral vaccine delivery

Liposomes have been used as adjuvants since 1974. One major limitation for the use of liposomes in oral vaccines is the lipid structure instability caused by enzyme activities. Our aim was to combine liposomes that could encapsulate antigens (i.e., Dtxd, diphtheria toxoid) with chitosan, which protects the particles and promotes mucoadhesibility. We employed physical techniques to understand the process by which liposomes (SPC: Cho, 3: 1) can be sandwiched with chitosan (Chi) and stabilized by PVA (poly-vinylic alcohol), which are biodegradable, biocompatible polymers. Round, smooth-surfaced particles of REVs-Chi (reversed-phase vesicles sandwiched by Chi) stabilized by PVA were obtained. The REVs encapsulation efficiencies (Dtxd was used as the antigen) were directly dependent on the Chi and PVA present in the formulation. Chi adsorption on the REVs surface was accompanied by an increase of zeta-potential. In contrast, PVA adsorption on the REVs-Chi surface was accompanied by a decrease of zeta-potential. The presence of Dtxd increased the Chi surface-adsorption efficiency. The PVA affinity by mucine was 2,000 times higher than that observed with Chi alone and did not depend on the molecule being in solution or adsorbed on the liposomal surface. The liberation of encapsulated Dtxd was retarded by encapsulation within REVs-Chi-PVA. These results lead us to conclude that these new, stabilized particles were able to be adsorbed by intestinal surfaces, resisted degradation, and controlled antigen release. Therefore, REVs-Chi-PVA particles can be used as an oral delivery adjuvant.

Purification, Characterization, and Preliminary X-Ray Diffraction Analysis of a Lactose-Specific Lectin from Cymbosema roseum Seeds

The unique carbohydrate-binding property of lectins makes them invaluable tools in biomedical research. Here, we report the purification, partial primary structure, carbohydrate affinity characterization, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of a lactose-specific lectin from Cymbosema roseum seeds (CRLII). Isolation and purification of CRLII was performed by a single step using a Sepharose-4B-lactose affinity chromatography column. The carbohydrate affinity characterization was carried using assays for hemagglutination activity and inhibition. CRLII showed hemagglutinating activity toward rabbit erythrocytes. O-glycoproteins from mucine mucopolysaccharides showed the most potent inhibition capacity at a minimum concentration of 1.2 A mu g mL(-1). Protein sequencing by mass spectrometry was obtained by the digestion of CRLII with trypsin, Glu-C, and AspN. CRLII partial protein sequence exhibits 46% similarity with the ConA-like alpha chain precursor. Suitable protein crystals were obtained with the hanging-drop vapor-diffusion method with 8% ethylene glycol, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5, and 11% PEG 8,000. The monoclinic crystals belong to space group P2(1) with unit cell parameters a = 49.4, b = 89.6, and c = 100.8 A....

Synthese tumorassoziierter Glycopeptidkonjugate basierend auf den epithelialen Mucinen MUC1 und MUC4 als potentielle Antitumorvakzine

Die Immuntherapie stellt eine hoffnungsvolle Alternative zu etablierten Behandlungsmethoden für Krebserkrankungen dar. Durch die Aktivierung des Immunsystems erhofft man sich eine selektive Abtötung von Tumorzellen. Eine solche Aktivierung kann durch Vakzinierung mit Glycopeptiden, welche Partialstrukturen tumorassoziierter Oberflächenglycoproteine darstellen, erfolgen. Um eine effektive Immunantwort zu erreichen, ist allerdings eine Konjugation dieser Glycopeptide mit immunogenen Trägern nötig. Zur Darstellung solcher Konjugate wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst mehrere, mit tumorassoziierten Kohlenhydraten glycosylierte Aminosäurebausteine dargestellt. Diese Bausteine wurden anschließend zur Festphasensynthese von Glycopeptiden eingesetzt. Durch ein neuartiges, chemoselektives Kupplungsverfahren konnten diese tumorassoziierten Glycopeptide an ein immunogenes Trägerprotein angebunden werden. Weiterhin wurde durch Festphasenpeptidsynthese ausgehend von einem tetrafunktionellen Lysin-Baustein ein dendrimeres Glycopeptid (MAP) erzeugt. Die Darstellung von vollsynthetischen Vakzinen gelang in Form von Konjugaten bestehend aus einem universellen T-Zell-Epitop und einem tumorassoziierten Glycopeptid. Diese Synthesen wurden ausgehend von einem festphasengebundenen, orthogonal geschützten Lysin durchgeführt. Abschließend wurde die Synthese von Konjugaten bestehend aus einem tumorassoziierten Glycopeptid und dem Mitogen Pam3Cys untersucht.

Synthese potentieller Antitumorvakzine aus tumorassoziierten Glycopeptiden des Mucins MUC1 und Versuche zur Festphasensynthese von Oligosacchariden

Festphasenoligosaccharidsynthesen: Um den mit der Synthese der Saccharidbausteine verbundenen Zeitaufwand zu reduzieren, sollten festphasenunterstützte, leicht automatisierbare Strategien entwickelt werden. Für die Optimierungen ist es notwendig, über Analysetechniken zu verfügen, die eine quantitative Verfolgung des Reaktionsablaufes erlauben. Zur Bestimmung der Konzentration freier Hydroxylgruppen wurde hierbei eine einfache und effiziente Reaktionsabfolge gefunden, die eine UV-spektroskopische Analyse erlaubt. rnZur Verknüpfung zwischen Kohlenhydrat und polymerem Träger (Polystyrol, Tentagel) kamen der PTMSE-, ein p-Alkoxybenzyl- und zwei Alkylthioanker zum Einsatz. Die Bedingungen zur Anknüpfung der mit Carboxylgruppen ausgestatteten Anker über Amidbindungen an das Harz, zur Spaltung der Lävulinoylschutzgruppe, sowie zur reduktiven Öffnung der Benzylidenacetalschutzgruppe wurden optimiert, sodass sich diese Reaktionen nun in sehr hohen Ausbeuten am polymeren Träger durchführen lassen. rnSpeziell Glycosylierungsreaktionen zeigten jedoch erhebliche Kompatibilitätsprobleme mit der polymeren Matrix. Die Ausbeuten aller an der festen Phase durchgeführten Glycosylierungen lagen bei maximal 5 Prozent. rnGlycopeptidsynthesen: Einige Tumorzellen unterscheiden sich von gesunden Zellen durch ein verändertes Profil an Oberflächenglycoproteinen. So ist das membranständige Glycoprotein MUC1 in malignen Epithelzellen stark überexprimiert und zeigt infolge veränderter Aktivitäten mehrerer Glycosyltransferasen ein modifiziertes Glycosylierungsmuster. Diese tumorspezifischen Strukturveränderungen stellen einen interessanten Angriffspunkt zur Entwicklung von Antitumorvakzinen dar. Um zu potentiellen Impfstoffen zu gelangen, ist es jedoch nötig, die Immunogenität der selbst nur schwach immunogenen Glycopeptide durch Konjugation zu erhöhen. rnIm Rahmen dieser Arbeit sollten vollsynthetische Konjugate, auf Basis einer 16 Aminosäuren langen, tumorassoziierten Glycopeptidpartialstruktur aus dem MUC1, zur möglichen Verwendung als Antitumorvakzine synthetisiert werden. Die Darstellung erfolgte in einer automatisierten Festphasensynthese nach der Fmoc-Strategie. rnZur Steigerung der Immunogenität wurde das glycosylierte Hexadecapeptid über einen Spacer mit einem T-Zell-Epitop aus dem Tetanustoxoidprotein sowie mit einem Mitogen verknüpft. Zur Synthese des Mitogenkonjugates sind noch Optimierungen im Syntheseablauf und insbesondere bei der Reinigung notwendig. Die immunologische Evaluierung des MUC1-Tetanustoxin-Heterotopkonjugates als mögliches Antitumorvakzin ist geplant. rn

Mucinartige Glycopeptide als Inhibitoren selektinvermittelter Zelladhäsionsprozesse

Es wurden Glycopeptide mit einer Partialsequenz aus der N-terminalen Domäne des natürlichen Selektinliganden PSGL-1 synthetisiert, welche prinzipiell als kompetitive Inhibitoren unerwünschter selektinvermittelter Zelladhäsionsphänomene fungieren könnten. Grundsätzlich könnte es möglich sein, auf diesem Wege entsprechende chronisch entzündliche Krankheiten wie rheumatoide Arthritis zu behandeln und bestimmte akut eintretende schwere Schädigungen von gesundem Gewebe sowie die Metastasenbildung maligner Tumore zu unterdrücken. Das tatsächliche Potential der hergestellten Glycopeptide als Liganden der Selektine kann nun in biologischen Tests geprüft werden. Der gewählte Ausschnitt aus dem P-Selektin-Glycoprotein-Liganden-1 (PSGL-1) reicht von Tyr48 bis Pro59 und umfasst so sämtliche Aminosäurereste der Sequenz, die für das Auftreten einer hochaffinen Rezeptorbindung erforderlich sind. Dabei ist die Seitenkette von Thr57 mit einem O-Glycan modifiziert, welches das in natürlichen Selektinliganden häufig vorkommende Tetrasaccharid Sialyl-Lewisx bzw. ein Mimetikum desselben enthält und die für Mucine typische Form der Anbindung an das peptidische Rückgrat über eine N-Acetyl-α-D-galactosamineinheit aufweist. Zum Aufbau der komplexen Glycopeptidstrukturen wurde zunächst eine Strategie für die Synthese des an die Hydroxylaminosäure gebundenen Oligosaccharids im Gramm-Maßstab ausgearbeitet. Dabei kam der Wahl eines geeigneten Schutzgruppenmusters besondere Bedeutung zu. Das entwickelte Konzept basiert allein auf chemischen Methoden und ermöglicht die parallele Herstellung potentieller Mimetika. So wurde in dieser Arbeit L-Fucose durch D-Arabinose und N-Acetyl-D-neuraminsäure durch (S)-Cyclohexylmilchsäure ersetzt. Die erhaltenen Glycosylaminosäure-Bausteine wurden schließlich in die Glycopeptid-synthesen an der festen Phase eingebracht, welche nach vollständiger Deblockierung die gewünschten Zielverbindungen lieferten.rn

Synthese und biologische Evaluierung von fluorierten und carbaanalogen Glycopeptiden für die Entwicklung von tumorselektiven Vakzinen

Tumorassoziierte Kohlenhydrat-Antigene werden von einer Vielzahl epithelialer Tumoren in erhöhtem Maße exprimiert und können sowohl als selektive Tumormarker, als auch als Zielstrukturen zur Entwicklung von synthetischen Krebsvakzinen dienen. Mucine, allen voran MUC1, sind hochgradig O-glycosylierte Zelloberflächenproteine, die im Fall maligner Zellen in deutlich überexprimierter Form mit charakteristisch veränderten Glycosylierungsmustern auftreten und somit vom Immunsystem erkannt werden können. Die relativ schwache Immunogenität und die geringe metabolische Stabilität dieser Glycopeptid-Epitope stehen jedoch der Entwicklung effizienter, auf Kohlenhydraten basierender Krebsvakzine entgegen.rnEin interessanter Ansatz, die Stabilität und Immunogenität der Vakzinbausteine zu erhöhen, ohne dabei deren Tumorspezifität nennenswert zu beeinträchtigen, stellt die Verwendung von modifizierten Glycopeptid-Konjugaten mit Kohlenhydratmimetika dar, z.B. basierend auf Fluor- und Carbazuckern. rnUm die Eignung solcher bislang unbekannter MUC1-Antigenanaloga als Vakzinbausteine zu untersuchen, konnten im Rahmen dieses Promotionsvorhabens Synthesen zu verschiedenen, modifizierten Antigen-Threonin-Konjugaten erarbeitet werden. Dabei konnte neben der erstmaligen Synthese eines in 6-Position fluorierten Carbazuckers auch ein 1→3 verknüpftes Carbadisaccharid synthetisiert werden. Zudem wurden mehrere Vertreter der in Position 6 bzw. 6‘ fluorierten TN, T und der beiden ST-Antigene dargestellt und über eine Festphasenpeptidsynthese in die aus 20 Aminosäuren bestehende tandem-repeat-Sequenz des MUC1 eingebaut. Eine anschließende Konjugation dieser Glycopeptide über einen nicht-immunogenen Spacer auf Triethylenglycol Basis an Carrierproteine wie BSA und das Tetanus Toxoid lieferte nicht nur potente Tumorvakzine, sondern auch die für die Durchführung von ELISA-Studien benötigten Glycopeptid-Konjugate. rnIn ersten ELISA und Neutralisationsexperimenten konnte gezeigt werden, dass bereits erhaltene Antikörper gegen strukturell sehr ähnliche Vakzine in der Lage sind, die neuartigen fluorierten Glycopeptide zu erkennen und an ihnen zu binden. Zusätzlich konnte erstmals in Impfstudien gezeigt werden, dass mit diesen neuen fluorierten Glycopeptid-TTox-Konjugaten nicht nur eine stakt toleranzbrechende humorale Immunantwort induziert werden kann, sondern auch dass diese MUC1 spezifischen Antikörper zudem in der Lage sind Brustkrebszellen der Linie MCF-7 zu erkennen und zu binden. rnrn

Étude du rôle de l'activité glycosidase de la protéine virale o1 dans l'infectivité du réovirus

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Étude du rôle de l'activité glycosidase de la protéine virale o1 dans l'infectivité du réovirus

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.