Interacção do vanádio com a miosina de músculo esquelético de coelho

Relatório de projecto de licenciatura, Bioquímica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2009

Influência da obesidade sobre a composição de cadeias pesadas de Miosina e Fibrose intersticial miocárdica de ratos normotensos e espontaneamente hipertensos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Expressão gênica e protéica de isoformas de cadeia pesada de miosina e maciez da carne de bovinos de diferentes grupos genéticos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Influência do aumento energético proveniente de dieta hiperlipídica na disfunção cardíaca em ratos com estenose aórtica supravalvar: participação das cadeias pesadas de miosina e da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático

Pós-graduação em Fisiopatologia em Clínica Médica - FMB

Identificação e quantificação das proteínas miofibrilares, isoformas da cadeia pesada de miosina (MyHC) e o amaciamento da carne de bovinos Nelore (Bos indicus)

Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal - FCAV

Antidepressivo modula o comportamento e a expressão gênica das cadeias de miosina, serca2 e fosfolambam em ratos com insuficiência aórtica?

Introduction: Aortic insufficiency (AoI), a volume overload, is characterized by the diastolic reflux of blood from the regurgitating aorta to the left ventricle. This effect results from malfunctioning aortic cusps. The main cause of AoI in developing countries is rheumatic fever, including Brazil, and valvar degeneration in developed countries. There is a strong association between cardiovascular diseases and depression. Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRI) are one of the most prescribed antidepressants in the world. Previous studies of our laboratory showed that the utilization of a SSRI, paroxetine, improved cardiac function in rats with sub-chronic AoI and reduced the daily ingestion of hypertonic sodium (NaCl 0,3M). Cardiovascular diseases can determine behavior changes like increase of anxiety, and it is yet unknown if AoI would determine anxiety or anhedonia, incapacity of obtaining pleasure through physical or sensorial experiences. A possible target for SSRI action could be a change in the expression of enzyme isoforms that collaborate in the contractile function of the heart muscle, like the heavy chains of myosine, the sarcoplasmatic reticulum Ca2+/ATPase (SERCA) and its regulator protein, phospholamban (PLB). Objectives: Evaluation of behavior parameters for anxiety and anhedonia state and genic expression of a-myosine, b-myosine, SERCA2a and PLB in the heart tissue of rats with subchronic AoI that received treatment with an SSRI (paroxetine) for 4 weeks. Methods: Surgery to induce AoI was performed on male Wistar rats, anxiety was evaluated by the elevated plus-maze (EPM) and state of anhedonia was tested by ingestion of 2% sucrose solution. After euthanasia the heart tissue was collected and total RNA was extracted to be analyzed by the RT-qPCR method. Results: Heart fractional shortening was preserved in rats with AoI that were treated compared to rats with AoI that were not treated. There was no statistically ...

Caracterización funcional de mutaciones en el gen MYH7 en pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH)

La miocardipatía hipertrófica (MCH) es una enfermedad cardiaca de causa genética con un nivel relativamente alto de prevalencia. Varios genes que codifican proteínas sarcoméricas están involucrados en esta alteración. Uno de los genes que más se ve alterado en esta enfermedad es el gen MYH7, que codifica la cadena pesada de la miosina 7. En el presente trabajo se ha analizado el DNA de pacientes con MCH diagnosticada con el objetivo de buscar y caracterizar mutaciones en el gen MYH7. Idioma: español.

Influência das proteínas motoras e CK2 no processo de interação Leishmania braziliensis-macrófago.

O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago.

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Perfil de imunoglobulinas e correlação de autoanticorpos com a ocorrência de diversas formas clínicas em pacientes chagásicos crônicos

Introdução: O dano miocárdico na doença de Chagas resulta tanto da ação parasitária quanto da resposta imune do hospedeiro humano. O mimetismo molecular entre proteínas do Trypanosoma cruzi e vários antígenos do hospedeiro tem sido amplamente descrito gerando células T CD8+ e anticorpos autorreativos. Entretanto, a geração dos autoanticorpos e seu papel na imunopatogenia da doença de Chagas ainda não têm sido elucidados, o que nos levou, neste trabalho, a avaliar a produção de imunoglobulina G total (IgGt) e seus isotipos anti-T. cruzi, proteínas cardíacas e sua possível associação com as diferentes formas clínicas da doença de Chagas. Métodos: A produção de IgGt e isotipos foi mensurada pelo método de ELISA no soro de pacientes com as formas clínicas indeterminada (IND, n=72), cardíaca (CARD, n=47) e digestiva/cardio-digestiva (DIG/CARD-DIG, n=12) da doença de Chagas, usando como antígenos as formas epimastigota e tripomastigota do T. cruzi e proteínas cardíacas humana (miosina e troponina T). As amostras de indivíduos não infectados saudáveis (CONT, n= 30) e pacientes com cardiomiopatia isquêmica (ISCH, n=15) foram usadas como controle. Os títulos de autoanticorpos foram correlacionados com parâmetros da função cardíaca obtidos por exames eletrocardiográficos, radiográficos e ecocardiográficos. Resultados: Neste estudo foram incluídos 131 indivíduos sem diferença significativa relativa à idade ou sexo. Destes, 55% foram classificados como IND, 35,9% CARD e 9,1% DIG/CARD-DIG. Os títulos de IgGt foram mais elevados em pacientes com as formas clínicas IND, CARD e DIG/CARD-DIG do que em indivíduos CONT e ISCH usando os antígenos as formas tripomastigotas e epimastigotas do T. cruzi e, proteínas cardíacas humanas. Os pacientes com formas clínicas CARD e DIG/CARD-DIG mostraram a produção mais elevada de IgG total dirigida contra antígenos de tripomastigota e epimastigota do que os IND. Os grupos de pacientes IND e CARD apresentaram uma similar produção de IgG total específica direcionada à miosina e troponina T, e mais elevada do que em indivíduos CONT e ISCH. Há uma correlação negativa entre a produção de anticorpos anti-proteínas cardíacas com a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) em pacientes chagásicos crônicos. Os pacientes foram agrupados em baixo e alto produtores de autoanticorpos e comparados com a fração de ejeção demonstrando que em pacientes alto produtores de anti-troponina T (p=0.042) e miosina (p=0.013) a FEVE foi mais baixa do que os baixo produtores. A maioria dos pacientes chagásicos produz simultaneamente autoanticorpos direcionados à ambas proteínas cardíacas (r=0.9508, p=0.0001). Conclusões: Estes resultados indicam que os autoanticorpos anti- troponina T e miosina cardíaca parecem induzir redução FEVE e deve ser associado com o desenvolvimento de cardiomiopatia chagásica

Detecção de anticorpo anticoração em camundongos Balb/c imunizados com Streptococcus mutans

Anticorpos para antígenos cardíacos foram analisados por ELISA em 14 soros de camundongos Balb/c hiperimunizados com Streptococcus mutans, inativado pelo formaldeído. Os níveis de anticorpos da classe IgG anticoração e antimiosina elevaram-se significativamente nos animais imunizados quando comparados com os controles, especialmente no grupo A, imunizado e reestimulado com antígenos solúveis de S. mutans. Neste grupo, os resultados do Western Blot mostraram reatividade com miosina cardíaca e uma banda de 35 kDa. A análise histológica dos corações dos animais do grupo B, imunizado e reestimulado com antígenos de superfície do microrganismo, demonstrou a presença de degeneração celular, tipo hidrópica e hialina e focos inflamatórios constituídos de linfócitos e macrófagos no miocárdio e pericárdio. Os resultados deste trabalho reforçam a hipótese da existência de mimetismo antigênico entre tecido cardíaco e S. mutans e chamam a atenção para o risco de desenvolvimento de anticorpos reativos com antígenos próprios induzidos por vacina anticárie com componentes estreptocócicos.

Tipos de miosinas de linhagens de frangos de corte criados em sistemas de confinamento e semiconfinamento

O objetivo neste trabalho foi avaliar o peso vivo, o peso de pernas, os aspectos morfológicos das fibras musculares do músculo flexor longo do hálux e o perfil eletroforético das miosinas de cadeia pesada de quatro linhagens de frangos de corte criados nos sistemas de confinamento e semiconfinamento. Foram utilizados 1.440 pintos distribuídos em delineamento inteiramente casualisado em esquema fatorial 4 × 2, composto de quatro linhagens (Ross 305, Máster Gris, Label Rouge e Vermelhão Pesado) e dois sistemas de criação (confinamento e semiconfinamento), cada combinação avaliada com quatro repetições. Aos 28 e 84 dias de idade, foram abatidas quatro aves por tratamento, totalizando 64 aves. A eletroforese identificou a presença das três isoformas de miosinas, tipo MyHC-I, MyHC-IIa e MyHC-IIb, no músculo flexor longo do hálux dos frangos de corte. Com aumento da idade, a isoforma de miosina MyHC-II aumenta, enquanto a MyHC-I diminui. Somente aos 84 dias de idade, a expressão das isoformas de miosina do tipo MyHC-II foram influenciadas pela linhagem, confirmando o reflexo da seleção na linhagem Ross no músculo mais glicolítico.A linhagem Ross apresenta maior peso vivo, peso de perna, peso e área do músculo flexor longo do hálux em comparação às linhagens tipo caipira.

Expressão dos fatores de regulação miogênica, composição das miosinas e trofismos no músculo esquelético periférico de ratos com insuficiência cardíaca crônica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Estudo do músculo diafragma em ratos com insuficiência cardíaca crônica: composição das miosinas e expressão dos fatores de regulação miogênica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização morfológica, bioquímica e molecular do músculo esquelético sóleo de ratos espontaneamente hipertensos com insuficiência cardíaca

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)