La Tècnica FISH i el microscopi confocal aplicats a la determinació de fraccions de biomassa en un reactor aerobi nitrificant

Vegeu el resum del projecte de final de carrera en el document adjunt ResumPFCMarsol

Estudio comparativo entre microscopía confocal y microscopía especular en la valoración del endotelio en córneas con distrofia de Fuchs

La distròfia endotelial de Fuchs es caracteritza per la formació de guttas endotelials i en estadis avançats pot induir edema corneal i pèrdua d’agudesa visual. A diferència del microscopi especular, el microscopi confocal té un disseny que permet evitar la llum aberrant causada per l’edema corneal o opacitats estromals. Comparant ambdues probes en la valoració de l’endoteli corneal en pacients amb distròfia de Fuchs, s’observa millor qualitat d’imatge per microscòpia confocal tot i que no es podia valorar la fiabilitat de l’esmentada proba en la determinació de la densitat cel•lular endotelial en les còrnies afectades.

A Comparative Study of Desktop, Fishtank, and Cave Systems for the Exploration of Volume Rendered Confocal Data Sets

We present a participant study that compares biological data exploration tasks using volume renderings of laser confocal microscopy data across three environments that vary in level of immersion: a desktop, fishtank, and cave system. For the tasks, data, and visualization approach used in our study, we found that subjects qualitatively preferred and quantitatively performed better in the cave compared with the fishtank and desktop. Subjects performed real-world biological data analysis tasks that emphasized understanding spatial relationships including characterizing the general features in a volume, identifying colocated features, and reporting geometric relationships such as whether clusters of cells were coplanar. After analyzing data in each environment, subjects were asked to choose which environment they wanted to analyze additional data sets in - subjects uniformly selected the cave environment.

Sistema informàtic de gestió, processament i anàlisi d'imatges confocals per a l'ajuda en la diagnosi del càncer de pell

El càncer de pell es considera un dels tipus de càncer més freqüents actualment, entre d'altres factors degut a l'augment en l'exposició a la radiació ultraviolada (UV). Recentment la utilització de la Microscòpia Confocal (MCF) per a l'avaluació i diagnosi del càncer de pell ha rebut un important interès. El principal avantatge és la capacitat de visualitzar en temps real la regió d'interès a nivell cel·lular, similar a la informació obtinguda en una biòpsia, sense el patiment que suposa per al pacient. El principal inconvenient però, és que les imatges obtingudes amb MCF són difícils d'interpretar per als metges en el format actual (conjunt de talls 2D a diferents profunditats de la pell).El microscopi confocal és una de les tècniques més actuals de diagnòstic, i s'ha establert com a una eina per obtenir imatges d'alta resolució i reconstruccions 3-D d'una gran varietat de mostres biològiques. És capaç d'escombrar diferents plans en l'eix Z, obtenint imatges 2D de diferent profunditat juntament amb la informació dels paràmetres de captura (com ara la profunditat, potència del làser, posicionament en x,y,z, etc). Mitjançant eines informàtiques es pot integrar aquesta informació en un model 3D de la regió d'interès. L'objectiu principal d'aquest projecte és el desenvolupament d'una eina per a l'ajuda en la interpretació de les imatges MCF i així poder millorar el diagnosi del càncer de pell

Advanced light microscopy techniques

This article summarizes the basic principles of light microscopy, with examples of applications in biomedicine that illustrate the capabilities of thetechnique.

Sistema informàtic de gestió, processament i anàlisi d'imatges confocals per a l'ajuda en la diagnosi del càncer de pell

El càncer de pell es considera un dels tipus de càncer més freqüents actualment, entre d'altres factors degut a l'augment en l'exposició a la radiació ultraviolada (UV). Recentment la utilització de la Microscòpia Confocal (MCF) per a l'avaluació i diagnosi del càncer de pell ha rebut un important interès. El principal avantatge és la capacitat de visualitzar en temps real la regió d'interès a nivell cel·lular, similar a la informació obtinguda en una biòpsia, sense el patiment que suposa per al pacient. El principal inconvenient però, és que les imatges obtingudes amb MCF són difícils d'interpretar per als metges en el format actual (conjunt de talls 2D a diferents profunditats de la pell). El microscopi confocal és una de les tècniques més actuals de diagnòstic, i s'ha establert com a una eina per obtenir imatges d'alta resolució i reconstruccions 3-D d'una gran varietat de mostres biològiques. És capaç d'escombrar diferents plans en l'eix Z, obtenint imatges 2D de diferent profunditat juntament amb la informació dels paràmetres de captura (com ara la profunditat, potència del làser, posicionament en x,y,z, etc). Mitjançant eines informàtiques es pot integrar aquesta informació en un model 3D de la regió d'interès. L'objectiu principal d'aquest projecte és el desenvolupament d'una eina per a l'ajuda en la interpretació de les imatges MCF i així poder millorar el diagnosi del càncer de pell

Producció i caracterització de variants de la ribonucleasa pancreàtica humana dissenyades per a adquirir propietats citotòxiques

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI. L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques. Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació. Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal. Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI. Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització.

Producció de material docent per a ciència de materials mitjançant microscòpia electrònica de rastreig i làser confocal

Aquest projecte s'ha realitzat al Servei de Microscòpia de la Universitat Autònoma de Barcelona, i ha tingut una durada de dos anys (2006-2008). La finalitat d’aquest projecte ha estat l’elaboració de material didàctic basat en la captació d’imatges i l’edició de recursos pedagògics de suport digital aplicats a la ciència de materials. Es pretén millorar així la qualitat docent de les pràctiques de diverses assignatures dels ensenyaments de Física i d’Enginyeria de Materials utilitzant tècniques d’anàlisi actuals com són la Microscòpia Electrònica de Rastreig (MER) i la Microscòpia Optica (MO). Amb aquest projecte es vol fomentar també el treball interdisciplinari en equip entre professionals (docents i tècnics superiors de recerca) i acostar la teoria de les assignatures a la realització pràctica, facilitant el suport digital necessari per aconseguir un màxim aprofitament a les aules. Les imatges de MER i MO ajudaran als alumnes a familiaritzar-se amb el món de la recerca i la indústria.

Elaboració de nous recursos docents en el camp de la biologia vegetal, mitjançant l'ús de noves tecnologies de microscòpia com làser confocal i multifotó

Aquest projecte s'ha realitzat al Servei de Microscòpia de la Universitat Autònoma de Barcelona, i ha tingut una durada de dos anys (2007-2009). Els objectius concrets d'aquest projecte assolits per a les diferents assignatures ha estat l'anàlisi de característiques citològiques, característiques morfològiques i anatòmiques de les estructures vegetatives dels diferents nivells d’organització, característiques morfològiques i anatòmiques de les estructures reproductores. El material docent obtingut en aquest projecte està sent utilitzat en les assignatures següents: Botànica Farmacèutica, Biodiversitat vegetal marina, Recursos vegetals aquàtics: les algues, Plantes d'ús alimentari, Conserv. i gestió de poblacions i comunitats marines, Usos i cultius de recursos algals marins, B. i diversitat de criptògames, Biologia II, Tècniques Exp. de biologia II, Botànica, Biologia animal i vegetal. Per a la realització de l’estudi, s'ha obtingut una col·lecció d’imatges al MLC, MER i MET per aclarir els criteris sistemàtics. Durant el primer any s’han adquirit totes les imatges necessàries, per tal de poder elaborar el material didàctic en suport digital. Durant el segon any s’ha implementat aquest material a les respectives classes pràctiques i s’ha avaluat la seva importància en la millora de la formació dels alumnes i del suport al professor. L’aplicació del material elaborat a la docència pràctica durant el tot segon any ha permès fer un primer estudi per valorar la seva eficàcia i fer-hi les correccions oportunes. Durant tot el projecte, el treball conjunt de professors i tècnics ha estat bàsic per a l’obtenció de material didàctic adequat a la realitat dels estudis actuals i a la docència pràctica.

Microscòpia d'alta resolució aplicada a anàlisis traceològiques, tafonòmiques i zooarqueològiques

El projecte Microscòpia d'alta resolució aplicada a anàlisis traceològiques, tafonòmiques y zooarqueològiques ha permès donar continuïtat i ampliar la xarxa científica posada en marxa gràcies a dos projectes PBR anteriors entre l’IPHES i quatre centres anglesos: l’Institute of Archaeology del University College of London, el Dept of Prehistory and Europe del British Museum, el Dept of Palaeontology del Natural History Museum, i el Lithic Microwear Research Laboratory de la University of Bradford. El tema tractat ha estat l’avaluació de la resolució i de la possible complementarietat de diferents tècniques avançades de microscòpia per a l’anàlisi de les superfícies d’ossos i eines de pedra prehistòriques: microscòpia òptica, electrònica (SEM i ESEM), microscòpia làser confocal (LSCM) i el sistema Alicona 3D Infinite Imaging. Les diverses accions de mobilitat entre Catalunya i el Regne Unit realitzades han permès satisfactòriament posar en comú els procediments emprats pels diferents especialistes de cada centre. Les proves realitzades sobre materials de jaciments arqueològics clau tant britànics com de l’estat espanyol han permès avaluar els avantatges i limitacions que cada tècnica presentava segons la mostra estudiada (eines de pedra, ossos, dents...) i segons els requeriments específics de l’estudi plantejat. En termes generals, s’ha posat en evidència que les diferents tècniques explorades són força complementàries. És a dir, la gran capacitat d’augments i de resolució d’imatge dels microscopis electrònics es complementa amb unes meravelloses prestacions quant anàlisi de textures, de perfils i de reconstrucció 3D dels altres aparells. La principal conclusió que podem extreure, doncs, és que l’estudi d’aquest tipus d’objectes arqueològics requereix de l’ús combinat de diferents aparells de microscòpia. Tant els treballs realitzats com els contactes entre especialistes establerts al llarg del projecte s’han plasmat ja en treballs concrets, alguns d’ells ja publicats o en fase final de publicació.

Influence Of Fluorescent Dye On Physical-mechanical Properties Of Luting Cements For Confocal Microscopy Analysis.

To evaluate the influence of a fluorescent dye (rhodamine B) on the physical and mechanical properties of three different luting cements: a conventional adhesive luting cement (RelyX ARC, 3M/ESPE), a self-adhesive luting cement (RelyX U-200, 3M/ESPE), and a self-etching and self-adhesive luting cement (SeT PP, SDI). The cements were mixed with 0.03 wt% rhodamine B, formed into bar-shaped specimens (n = 10), and light cured using an LED curing unit (Radii, SDI) with a radiant exposure of 32 J/cm(2) . The Knoop hardness (KHN), flexural strength (FS), and Young's modulus (YM) analyses were evaluated after storage for 24 h. Outcomes were subjected to two-way ANOVA and Tukey's test (P = 0.05) for multiple comparisons. No significant differences in FS or YM were observed among the tested groups (P ≥ 0.05); the addition of rhodamine B increased the hardness of the luting cements tested. The addition of a fluorescent agent at 0.03 wt% concentration does not negatively affect the physical-mechanical properties of the luting cement polymerization behavior.

Tubular system volume changes in twitch fibres from toad and rat skeletal muscle assessed by confocal microscopy

The volume of the extracellular compartment (tubular system) within intact muscle fibres from cane toad and rat was measured under various conditions using confocal microscopy. Under physiological conditions at rest, the fractional volume of the tubular system (t-sys(Vol)) was 1.38 +/- 0.09% (n = 17),1.41 +/- 0.09% (n = 12) and 0.83 +/- 0.07% (n = 12) of the total fibre volume in the twitch fibres from toad iliofibularis muscle, rat extensor digitorum longus muscle and rat soleus muscle, respectively. In toad muscle fibres, the t-sys(Vol) decreased by 30% when the tubular system was fully depolarized and decreased by 15% when membrane cholesterol was depleted from the tubular system with methyl-beta-cyclodextrin but did not change as the sarcomere length was changed from 1.93 to 3.30 mum. There was also an increase by 30% and a decrease by 25% in t-sys(Vol) when toad fibres were equilibrated in solutions that were 2.5-fold hypertonic and 50% hypotonic, respectively. When the changes in total fibre volume were taken into consideration, the t-sys(Vol) expressed as a percentage of the isotonic fibre volume did actually decrease as tonicity increased, revealing that the tubular system in intact fibres cannot be compressed below 0.9% of the isotonic fibre volume. The results can be explained in terms of forces acting at the level of the tubular wall. These observations have important physiological implications showing that the tubular system is a dynamic membrane structure capable of changing its volume in response to the membrane potential, cholesterol depletion and osmotic stress but not when the sarcomere length is changed in resting muscle.

Micromorphology of Resin-Dentin Interfaces Using One-Bottle Etch&Rinse and Self-Etching Adhesive Systems on Laser-Treated Dentin Surfaces: A Confocal Laser Scanning Microscope Analysis

Background and Objectives: This study evaluated the hybrid layer (HL) morphology created by three adhesive systems (AS) on dentin surfaces treated with Er:YAG laser using two irradiation parameters. Study Design: Occlusal flat dentin surfaces of 36 human third molars were assigned into nine groups (n = 4) according to the following ASs: one bottle etch&rinse Single Bond Plus (3M ESPE), two-step Clearfil Protect Bond (Kuraray), and all-in-one S3 Bond (Kuraray) self-etching, which were labeled with rhodamine B or fluorescein isothiocyanate dextran and were applied to dentin surfaces that were irradiated with Er:YAG laser at either 120 (38.7 J/cm(2)) or 200 mJ/pulse (64.5 J/cm(2)), or were applied to untreated dentin surfaces (control group). The ASs were light-activated following MI and the bonded surfaces were restored with resin composite Z250 (3M ESPE). After 24 hours of storage in vegetable oil, the restored teeth were vertically, serially sectioned into 1-mm thick slabs, which had the adhesive interfaces analyzed with confocal laser microscope (CLSM-LSM 510 Meta). CLSM images were recorded in the fluorescent mode from three different regions along each bonded interface. Results: Non-uniform HL was created on laser-irradiated dentin surfaces regardless of laser irradiation protocol for all AS, while regular and uniform HL was observed in the control groups. ""Stretch mark""-like red lines were found within the HL as a result of resin infiltration into dentin microfissures, which were predominantly observed in 200 mJ/pulse groups regardless of AS. Poor resin infiltration into peritubular dentin was observed in most regions of adhesive interfaces created by all ASs on laser-irradiated dentin, resulting in thin resin tags with neither funnel-shaped morphology nor lateral resin projections. Conclusion: Laser irradiation of dentin surfaces at 120 or 200 mJ/pulse resulted in morphological changes in HL and resin tags for all ASs evaluated in the study. Lasers Surg. Med. 42:662-670, 2010. (C) 2010 Wiley-Liss, Inc.

Depth and percentage of penetration of endodontic sealers into dentinal tubules after root canal obturation using a lateral compaction technique: A confocal laser scanning microscopy study

Objective. The aim was to compare the percentage and depth of sealer penetration into dentinal tubules during obturation using Sealer 26, GuttaFlow, or Sealapex in root canals filled with the lateral compaction technique. Study design. Thirty root canals filled with the lateral compaction technique using GuttaFlow (n = 10), Sealapex (n = 10), or Sealer 26 (n = 10) were analyzed using confocal microscopy. The teeth were sectioned at 3 and 5 mm from the apex, and statistical analyses was performed using analysis of variance-Tukey test (P < .05). Results. Sealapex showed the deepest sealer penetration at both levels evaluated (P < .05). No statistically significance was found between Sealer 26 and GuttaFlow at the 3 mm and 5 mm levels. No statistical significance was found in the percentage of penetration around the root canal wall among the 3 sealers evaluated at both levels. Conclusions. Although Sealapex displayed deeper penetration into the dentinal tubules there was no difference in the percentage of adaptation to the root canal walls among the 3 sealers evaluated. (Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009; 108: 450-457)

Confocal laser scanning microscopy is appropriate to detect viability of Enterococcus faecalis in infected dentin

The purpose of this study was to explore the potential of confocal laser scanning microscopy (CLSM) for in situ identification of live and dead Enterococcus faecalis in infected dentin. Eight cylindrical dentin specimens were infected with Enterococcus faecalis in BHI for 21 days. After the experimental period, the specimens were stained with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI) or acridine orange (0.01 %) and analyzed by CLSM. Two noninfected dentin specimens were used as negative controls. CLSM analysis shows that the discrimination between viable (green) and dead (red) bacteria in infected dentinal tubules could be observed after staining with FDA/PI. Acridine orange was able to show metabolic activity of the E. faecalis cells inside the dentinal tubules showed by its red fluorescence. The viability of bacteria in infected dentin can be determined in situ by CLSM. FDA/PI and acricline orange are useful for this technique.