Separation and detection of compounds in Honeysuckle by integration of ion-exchange chromatography fractionation with reversed-phase liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometer and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis

A hyphenated method for the isolation and identification of components in a traditional Chinese medicine of Honeysuckle was developed. Ion-exchange chromatography (IEC) was chosen for the fractionation of Honeysuckle extract, and then followed by concentration of all the fractions with rotary vacuum evaporator. Each of the enriched fractions was then further analyzed by reversed-phase liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometer (RPLC-APCI/MS) and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) with matrix of oxidized carbon nanotubes, respectively. It can be noted totally more than 117 components were detected by UV detector, APCI/MS and MALDI-TOF/MS in Honeysuckle extract except the, 145 components identified by MALDI-TOF/MS alone with this integrated approach, and 7 of them were preliminary identified according to their UV spectra and mass spectra performed by APCI/MS and MALDI-TOF/MS, respectively. The obtained analytical results not only indicated the approach of integration IEC fractionation with RPLC-APCI/MS and MALDI-TOF/MS is capable of analyzing complex samples, but also exhibited the potential power of the mass spectrometer in detection of low-mass compounds, such as traditional Chinese medicines (TCMs) and complex biological samples. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

Liquid Chromatography-Electrospray Linear Ion Trap Mass Spectrometry Analysis of Targeted Neuropeptides in Tac1-/- Mouse Spinal Cords Reveal Significant Lower Concentration of Opioid Peptides.

Tachykinin and opioid peptides play a central role in pain transmission, modulation and inhibition. The treatment of pain is very important in medicine and many studies using NK1 receptor antagonists failed to show significant analgesic effects in humans. Recent investigations suggest that both pronociceptive tachykinins and the analgesic opioid systems are important for normal pain sensation. The analysis of opioid peptides in Tac1-/- spinal cord tissues offers a great opportunity to verify the influence of the tachykinin system on specific opioid peptides. The objectives of this study were to develop a HPLC–MS/MRM assay to quantify targeted peptides in spinal cord tissues. Secondly, we wanted to verify if the Tac1-/- mouse endogenous opioid system is hampered and therefore affect significantly the pain modulatory pathways. Targeted neuropeptides were analyzed by high performance liquid chromatography linear ion trap mass spectrometry. Our results reveal that EM-2, Leu-Enk and Dyn A were down-regulated in Tac1-/- spinal cord tissues. Interestingly, Dyn A was almost 3 fold down-regulated (p < 0.0001). No significant concentration differences were observed in mouse Tac1-/- spinal cords for Met-Enk and CGRP. The analysis of Tac1-/- mouse spinal cords revealed noteworthy decreases of EM-2, Leu-Enk and Dyn A concentrations which strongly suggest a significant impact on the endogenous pain-relieving mechanisms. These observations may have insightful impact on future analgesic drug developments and therapeutic strategies.

Combined affinity labelling and mass spectrometry analysis of differential cell surface protein expression in normal and prostate cancer cells

Differences in the expression of cell surface proteins between a normal prostate epithelial (1542-NP2TX) and a prostate cancer cell line (1542-CP3TX) derived from the same patient were investigated. A combination of affinity chromatographic purification of biotin-tagged surface proteins with mass spectrometry analysis identified 26 integral membrane proteins and 14 peripheral surface proteins. The findings confirm earlier reports of altered expression in prostate cancer for several cell surface proteins, including ALCAM/CD166, the Ephrin type A receptor, EGFR and the prostaglandin F2 receptor regulatory protein. In addition, several novel findings of differential expression were made, including the voltage-dependent anion selective channel proteins Porin 1 and 2, ecto-5'-nucleotidase (CD73) and Scavenger receptor B1. Cell surface protein expression changed both qualitatively and quantitatively when the cells were grown in the presence of either or both interferon INFalpha and INFgamma. Costimulation with type I and II interferons had additive or synergistic effects on the membrane density of several, mainly peripherally attached surface proteins. Concerted upregulation of surface exposed antigens may be of benefit in immuno-adjuvant-based treatment of interferon-responsive prostate cancer. In conclusion, this study demonstrates that differences in the expression of membrane proteins between normal and prostate cancer cells are reproducibly detectable following vectorial labelling with biotin, and that detailed analysis of extracellular-induced surface changes can be achieved by combining surface-specific labelling with high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.

Combined affinity labelling and mass spectrometry analysis of differential cell surface protein expression in normal and prostate cancer cells

Differences in the expression of cell surface proteins between a normal prostate epithelial (1542-NP2TX) and a prostate cancer cell line (1542-CP3TX) derived from the same patient were investigated. A combination of affinity chromatographic purification of biotin-tagged surface proteins with mass spectrometry analysis identified 26 integral membrane proteins and 14 peripheral surface proteins. The findings confirm earlier reports of altered expression in prostate cancer for several cell surface proteins, including ALCAM/CD166, the Ephrin type A receptor, EGFR and the prostaglandin F2 receptor regulatory protein. In addition, several novel findings of differential expression were made, including the voltage-dependent anion selective channel proteins Porin 1 and 2, ecto-5'-nucleotidase (CD73) and Scavenger receptor B1. Cell surface protein expression changed both qualitatively and quantitatively when the cells were grown in the presence of either or both interferon INF alpha and INF gamma. Costimulation with type I and II interferons had additive or synergistic effects on the membrane density of several, mainly peripherally attached surface proteins. Concerted upregulation of surface exposed antigens may be of benefit in immuno-adjuvant-based treatment of interferon-responsive prostate cancer. In conclusion, this study demonstrates that differences in the expression of membrane proteins between normal and prostate cancer cells are reproducibly detectable following vectorial labelling with biotin, and that detailed analysis of extracellular-induced surface changes can be achieved by combining surface-specific labelling with high-resolution two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry.

Electrospray ionization mass spectrometry analysis of changes in phospholipids in RBL-2H3 mastocytoma cells during degranulation

Biological membranes contain an extraordinary diversity of lipids. Phospholipids function as major structural elements of cellular membranes, and analysis of changes in the highly heterogeneous mixtures of lipids found in eukaryotic cells is central to understanding the complex functions in which lipids participate. Phospholipase-catalyzed hydrolysis of phospholipids often follows cell surface receptor activation. Recently, we demonstrated that granule fusion is initiated by addition of exogenous, nonmammalian phospholipases to permeabilized mast cells. To pursue this finding, we use positive and negative mode Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS) to measure changes in the glycerophospholipid composition of total lipid extracts of intact and permeabilized RBL-2H3 (mucosal mast cell line) cells. The low energy of the electrospray ionization results in efficient production of molecular ions of phospholipids uncomplicated by further fragmentation, and changes were observed that eluded conventional detection methods. From these analyses we have spectrally resolved more than 130 glycerophospholipids and determined changes initiated by introduction of exogenous phospholipase C, phospholipase D, or phospholipase A2. These exogenous phospholipases have a preference for phosphatidylcholine with long polyunsaturated alkyl chains as substrates and, when added to permeabilized mast cells, produce multiple species of mono- and polyunsaturated diacylglycerols, phosphatidic acids, and lysophosphatidylcholines, respectively. The patterns of changes of these lipids provide an extraordinarily rich source of data for evaluating the effects of specific lipid species generated during cellular processes, such as exocytosis.

Development of Imaging Mass Spectrometry Analysis of Lipids in Biological and Clinically Relevant Applications

La spectrométrie de masse mesure la masse des ions selon leur rapport masse sur charge. Cette technique est employée dans plusieurs domaines et peut analyser des mélanges complexes. L’imagerie par spectrométrie de masse (Imaging Mass Spectrometry en anglais, IMS), une branche de la spectrométrie de masse, permet l’analyse des ions sur une surface, tout en conservant l’organisation spatiale des ions détectés. Jusqu’à présent, les échantillons les plus étudiés en IMS sont des sections tissulaires végétales ou animales. Parmi les molécules couramment analysées par l’IMS, les lipides ont suscité beaucoup d'intérêt. Les lipides sont impliqués dans les maladies et le fonctionnement normal des cellules; ils forment la membrane cellulaire et ont plusieurs rôles, comme celui de réguler des événements cellulaires. Considérant l’implication des lipides dans la biologie et la capacité du MALDI IMS à les analyser, nous avons développé des stratégies analytiques pour la manipulation des échantillons et l’analyse de larges ensembles de données lipidiques. La dégradation des lipides est très importante dans l’industrie alimentaire. De la même façon, les lipides des sections tissulaires risquent de se dégrader. Leurs produits de dégradation peuvent donc introduire des artefacts dans l’analyse IMS ainsi que la perte d’espèces lipidiques pouvant nuire à la précision des mesures d’abondance. Puisque les lipides oxydés sont aussi des médiateurs importants dans le développement de plusieurs maladies, leur réelle préservation devient donc critique. Dans les études multi-institutionnelles où les échantillons sont souvent transportés d’un emplacement à l’autre, des protocoles adaptés et validés, et des mesures de dégradation sont nécessaires. Nos principaux résultats sont les suivants : un accroissement en fonction du temps des phospholipides oxydés et des lysophospholipides dans des conditions ambiantes, une diminution de la présence des lipides ayant des acides gras insaturés et un effet inhibitoire sur ses phénomènes de la conservation des sections au froid sous N2. A température et atmosphère ambiantes, les phospholipides sont oxydés sur une échelle de temps typique d’une préparation IMS normale (~30 minutes). Les phospholipides sont aussi décomposés en lysophospholipides sur une échelle de temps de plusieurs jours. La validation d’une méthode de manipulation d’échantillon est d’autant plus importante lorsqu’il s’agit d’analyser un plus grand nombre d’échantillons. L’athérosclérose est une maladie cardiovasculaire induite par l’accumulation de matériel cellulaire sur la paroi artérielle. Puisque l’athérosclérose est un phénomène en trois dimension (3D), l'IMS 3D en série devient donc utile, d'une part, car elle a la capacité à localiser les molécules sur la longueur totale d’une plaque athéromateuse et, d'autre part, car elle peut identifier des mécanismes moléculaires du développement ou de la rupture des plaques. l'IMS 3D en série fait face à certains défis spécifiques, dont beaucoup se rapportent simplement à la reconstruction en 3D et à l’interprétation de la reconstruction moléculaire en temps réel. En tenant compte de ces objectifs et en utilisant l’IMS des lipides pour l’étude des plaques d’athérosclérose d’une carotide humaine et d’un modèle murin d’athérosclérose, nous avons élaboré des méthodes «open-source» pour la reconstruction des données de l’IMS en 3D. Notre méthodologie fournit un moyen d’obtenir des visualisations de haute qualité et démontre une stratégie pour l’interprétation rapide des données de l’IMS 3D par la segmentation multivariée. L’analyse d’aortes d’un modèle murin a été le point de départ pour le développement des méthodes car ce sont des échantillons mieux contrôlés. En corrélant les données acquises en mode d’ionisation positive et négative, l’IMS en 3D a permis de démontrer une accumulation des phospholipides dans les sinus aortiques. De plus, l’IMS par AgLDI a mis en évidence une localisation différentielle des acides gras libres, du cholestérol, des esters du cholestérol et des triglycérides. La segmentation multivariée des signaux lipidiques suite à l’analyse par IMS d’une carotide humaine démontre une histologie moléculaire corrélée avec le degré de sténose de l’artère. Ces recherches aident à mieux comprendre la complexité biologique de l’athérosclérose et peuvent possiblement prédire le développement de certains cas cliniques. La métastase au foie du cancer colorectal (Colorectal cancer liver metastasis en anglais, CRCLM) est la maladie métastatique du cancer colorectal primaire, un des cancers le plus fréquent au monde. L’évaluation et le pronostic des tumeurs CRCLM sont effectués avec l’histopathologie avec une marge d’erreur. Nous avons utilisé l’IMS des lipides pour identifier les compartiments histologiques du CRCLM et extraire leurs signatures lipidiques. En exploitant ces signatures moléculaires, nous avons pu déterminer un score histopathologique quantitatif et objectif et qui corrèle avec le pronostic. De plus, par la dissection des signatures lipidiques, nous avons identifié des espèces lipidiques individuelles qui sont discriminants des différentes histologies du CRCLM et qui peuvent potentiellement être utilisées comme des biomarqueurs pour la détermination de la réponse à la thérapie. Plus spécifiquement, nous avons trouvé une série de plasmalogènes et sphingolipides qui permettent de distinguer deux différents types de nécrose (infarct-like necrosis et usual necrosis en anglais, ILN et UN, respectivement). L’ILN est associé avec la réponse aux traitements chimiothérapiques, alors que l’UN est associé au fonctionnement normal de la tumeur.

Development of Imaging Mass Spectrometry Analysis of Lipids in Biological and Clinically Relevant Applications

La spectrométrie de masse mesure la masse des ions selon leur rapport masse sur charge. Cette technique est employée dans plusieurs domaines et peut analyser des mélanges complexes. L’imagerie par spectrométrie de masse (Imaging Mass Spectrometry en anglais, IMS), une branche de la spectrométrie de masse, permet l’analyse des ions sur une surface, tout en conservant l’organisation spatiale des ions détectés. Jusqu’à présent, les échantillons les plus étudiés en IMS sont des sections tissulaires végétales ou animales. Parmi les molécules couramment analysées par l’IMS, les lipides ont suscité beaucoup d'intérêt. Les lipides sont impliqués dans les maladies et le fonctionnement normal des cellules; ils forment la membrane cellulaire et ont plusieurs rôles, comme celui de réguler des événements cellulaires. Considérant l’implication des lipides dans la biologie et la capacité du MALDI IMS à les analyser, nous avons développé des stratégies analytiques pour la manipulation des échantillons et l’analyse de larges ensembles de données lipidiques. La dégradation des lipides est très importante dans l’industrie alimentaire. De la même façon, les lipides des sections tissulaires risquent de se dégrader. Leurs produits de dégradation peuvent donc introduire des artefacts dans l’analyse IMS ainsi que la perte d’espèces lipidiques pouvant nuire à la précision des mesures d’abondance. Puisque les lipides oxydés sont aussi des médiateurs importants dans le développement de plusieurs maladies, leur réelle préservation devient donc critique. Dans les études multi-institutionnelles où les échantillons sont souvent transportés d’un emplacement à l’autre, des protocoles adaptés et validés, et des mesures de dégradation sont nécessaires. Nos principaux résultats sont les suivants : un accroissement en fonction du temps des phospholipides oxydés et des lysophospholipides dans des conditions ambiantes, une diminution de la présence des lipides ayant des acides gras insaturés et un effet inhibitoire sur ses phénomènes de la conservation des sections au froid sous N2. A température et atmosphère ambiantes, les phospholipides sont oxydés sur une échelle de temps typique d’une préparation IMS normale (~30 minutes). Les phospholipides sont aussi décomposés en lysophospholipides sur une échelle de temps de plusieurs jours. La validation d’une méthode de manipulation d’échantillon est d’autant plus importante lorsqu’il s’agit d’analyser un plus grand nombre d’échantillons. L’athérosclérose est une maladie cardiovasculaire induite par l’accumulation de matériel cellulaire sur la paroi artérielle. Puisque l’athérosclérose est un phénomène en trois dimension (3D), l'IMS 3D en série devient donc utile, d'une part, car elle a la capacité à localiser les molécules sur la longueur totale d’une plaque athéromateuse et, d'autre part, car elle peut identifier des mécanismes moléculaires du développement ou de la rupture des plaques. l'IMS 3D en série fait face à certains défis spécifiques, dont beaucoup se rapportent simplement à la reconstruction en 3D et à l’interprétation de la reconstruction moléculaire en temps réel. En tenant compte de ces objectifs et en utilisant l’IMS des lipides pour l’étude des plaques d’athérosclérose d’une carotide humaine et d’un modèle murin d’athérosclérose, nous avons élaboré des méthodes «open-source» pour la reconstruction des données de l’IMS en 3D. Notre méthodologie fournit un moyen d’obtenir des visualisations de haute qualité et démontre une stratégie pour l’interprétation rapide des données de l’IMS 3D par la segmentation multivariée. L’analyse d’aortes d’un modèle murin a été le point de départ pour le développement des méthodes car ce sont des échantillons mieux contrôlés. En corrélant les données acquises en mode d’ionisation positive et négative, l’IMS en 3D a permis de démontrer une accumulation des phospholipides dans les sinus aortiques. De plus, l’IMS par AgLDI a mis en évidence une localisation différentielle des acides gras libres, du cholestérol, des esters du cholestérol et des triglycérides. La segmentation multivariée des signaux lipidiques suite à l’analyse par IMS d’une carotide humaine démontre une histologie moléculaire corrélée avec le degré de sténose de l’artère. Ces recherches aident à mieux comprendre la complexité biologique de l’athérosclérose et peuvent possiblement prédire le développement de certains cas cliniques. La métastase au foie du cancer colorectal (Colorectal cancer liver metastasis en anglais, CRCLM) est la maladie métastatique du cancer colorectal primaire, un des cancers le plus fréquent au monde. L’évaluation et le pronostic des tumeurs CRCLM sont effectués avec l’histopathologie avec une marge d’erreur. Nous avons utilisé l’IMS des lipides pour identifier les compartiments histologiques du CRCLM et extraire leurs signatures lipidiques. En exploitant ces signatures moléculaires, nous avons pu déterminer un score histopathologique quantitatif et objectif et qui corrèle avec le pronostic. De plus, par la dissection des signatures lipidiques, nous avons identifié des espèces lipidiques individuelles qui sont discriminants des différentes histologies du CRCLM et qui peuvent potentiellement être utilisées comme des biomarqueurs pour la détermination de la réponse à la thérapie. Plus spécifiquement, nous avons trouvé une série de plasmalogènes et sphingolipides qui permettent de distinguer deux différents types de nécrose (infarct-like necrosis et usual necrosis en anglais, ILN et UN, respectivement). L’ILN est associé avec la réponse aux traitements chimiothérapiques, alors que l’UN est associé au fonctionnement normal de la tumeur.

Characterization of proanthocyanidins from Parkia biglobosa (Jacq.) G. Don. (Fabaceae) by flow injection analysis - Electrospray ionization ion trap tandem mass spectrometry and liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry

The present study investigates the chemical composition of the African plant Parkia biglobosa (Fabaceae) roots and barks by Liquid Chromatography - Electrospray Ionization and Direct Injection Tandem Mass Spectrometry analysis. Mass spectral data indicated that B-type oligomers are present, namely procyanidins and prodelphinidins, with their gallate and glucuronide derivatives, some of them in different isomeric forms. The analysis evidenced the presence of up to 40 proanthocyanidins, some of which are reported for the first time. In this study, the antiradical activity of extracts of roots and barks from Parkia biglobosa was evaluated using DPPH method and they showed satisfactory activities.

Matrix Effects on Water Analysis for Alkylphenols Using Solid Phase Extraction Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Gas chromatography with mass spectrometry is frequently used for the quantification of many classes of substances, including alkylphenols. Alkylphenol polyethoxylates are nonionic surfactants used in a wide variety of industrial and consumer applications. Alkylphenol polyethoxylates can degrade to alkylphenols, which are endocrine disruptors. In analytical validation procedures, the most common parameters studied are the detection and quantification limits, linearity, and recovery; however, the matrix effects are sometimes neglected. Although some investigators have evaluated matrix effects, there is no consensus on how to evaluate them during method validation. In this study, the matrix effects of alkylphenol polyethoxylates (nonylphenol monoethoxylate, nonylphenol diethoxylate, octylphenol monoethoxylate, octylphenol diethoxylate) and alkylphenols (nonylphenol and octylphenol) were studied using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry analysis. For alkylphenol polyethoxylates, the matrix effects ranged from 16 to 4692%, whereas for alkylphenols (nonylphenol and octylphenol), the effects were insignificant. Therefore, constructing an analytical curve in the matrix for alkylphenol polyethoxylates is essential. © 2013 Copyright Taylor and Francis Group, LLC.

Challenges in mass spectrometry-based quantification of bioactive peptides: A case study exploring the neuropeptide Y family

The study of biologically active peptides is critical to the understanding of physiological pathways, especially those involved in the development of disease. Historically, the measurement of biologically active endogenous peptides has been undertaken by radioimmunoassay, a highly sensitive and robust technique that permits the detection of physiological concentrations in different biofluid and tissue extracts. Over recent years, a range of mass spectrometric approaches have been applied to peptide quantification with limited degrees of success. Neuropeptide Y (NPY), peptide YY (PYY), and pancreatic polypeptide (PP) belong to the NPY family exhibiting regulatory effects on appetite and feeding behavior. The physiological significance of these peptides depends on their molecular forms and in vivo concentrations systemically and at local sites within tissues. In this report, we describe an approach for quantification of individual peptides within mixtures using high-performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry analysis of the NPY family peptides. Aspects of quantification including sample preparation, the use of matrix-matched calibration curves, and internal standards will be discussed. This method for the simultaneous determination of NPY, PYY, and PP was accurate and reproducible but lacks the sensitivity required for measurement of their endogenous concentration in plasma. The advantages of mass spectrometric quantification will be discussed alongside the current obstacles and challenges. © 2012 Wiley Periodicals, Inc. Biopolymers (Pept Sci) 98: 357–366, 2012.

Observation of an intact noncovalent homotrimer of detergent-solubilized rat microsomal glutathione transferase-1 by electrospray mass spectrometry

Microsomal glutathione transferase-1 (MGST1) is a membrane-bound enzyme involved in the detoxification of xenobiotics and the protection of cells against oxidative stress. The proposed active form of the enzyme is a noncovalently associated homotrimer that binds one substrate glutathione molecule/trimer. In this study, this complex has been directly observed by electrospray mass spectrometry analysis of active rat liver MGST1 reconstituted in a minimum amount of detergent. The measured mass of the homotrimer is 53 kDa, allowing for the mass of three MGST molecules in complex with one glutathione molecule. Collision-induced dissociation of the trimer complex resulted in the formation of monomer and homodimer ion species. Two distinct species of homodimer were observed, one unliganded and one identified as a homodimer.glutathione complex. Activation of the enzyme by N-ethylmaleimide through modification of Cys(49) (Svensson, R., Rinaldi, R., Swedmark, S., and Morgenstern, R. (2000) Biochemistry 39, 15144-15149) was monitored by the observation of an appropriate increase in mass in both the denatured monomeric and native trimeric forms of MGST1. Together, the data correspond well with the proposed functional organization of MGST1. These results also represent the first example of direct electrospray mass spectrometry analysis of a detergent-solubilized multimeric membrane protein complex in its native state.

Liquid matrices for analyses by UV-MALDI mass spectrometry

Data are presented for a pH-adjustable liquid UV-matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) matrix for mass spectrometry analysis. The liquid matrix system possesses high analytical sensitivity within the same order of magnitude as that achievable by the commonly used solid UV-MALDI matrices such as 2,5-dihydroxybenzoic acid but with improved spot homogeneity and reproducibility. The pH of the matrix has been adjusted by the addition of up to 0.35% trifluoroacetic acid and up to 200 mM ammonium bicarbonate, achieving an on-target pH range of 3.5-8.6. Alteration of the pH does not seem to affect the overall sample signal intensity or signal-to-noise ratio achievable, nor does it affect the individual peptide ion signals from a mixture of peptides with varying isoelectric points (p1). In addition, the pH adjustment has allowed for the performance of a tryptic digest within the diluted pH-optimized liquid matrix.