Identification of genes regulated by mir-363*, a regulator of bone marrow endothelial cell properties

As células estaminais hematopoiéticas residem na medula óssea e possuem capacidade para se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de células sanguíneas. O endotélio da medula óssea é constituído por células endoteliais de medula óssea (BMEC) e compreende dois nichos com funções distintas: o nicho osteoblástico e o nicho vascular. O nicho osteoblásctico proporciona condições para a quiescência de células estaminais hematopoiéticas, enquanto no nicho vascular ocorre proliferação e diferenciação das mesmas. Quando ocorre um desequilíbrio na expressão de genes que codificam para proteínas envolvidas na mobilização de células do nicho osteoblástico para o nicho vascular – factores angiócrinos – ocorre uma desestabilização do microambiente medular, que se pode traduzir num processo tumoral. Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes, de cadeia simples, que regula a expressão génica. Os miRNAs são sequências endógenas de RNA que possuem entre 19 e 25 nucleótidos de tamanho. Os miRNAs são reguladores da expressão genica, induzindo o silenciamento a nível da pós-transcrição, através da sua ligação com uma sequência específica para a qual possuem afinidade, na região 3’ não traduzida (3’ UTR) dos seus mRNA alvo, conduzindo à inibição da tradução ou à sua degradação. Os miRNAs estão envolvidos na regulação de genes de diversas vias afectando processos fundamentais como hematopoiese, apoptose, proliferação celular e tumorigénese. Os níveis de expressão dos miRNAs estão alterados no cancro, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Os perfis dos níveis de expressão de vários miRNAs foram estudados, tendo-se verificado que se alteram durante o processo de carcinogénese, podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso denominados de oncomirs. Apesar do miR-363* estar envolvido na regulação da expressão de genes que regulam propriedades das células endoteliais e medula óssea, os genes sobre os quais exerce a sua função ainda não foram identificados.O objectivo do presente estudo é a identificação dos genes directamente regulados pelo miR-363* (genes alvo) e a sua relevância para a disfunção medular e a sua caracterização nos síndromes mielodisplásicos. A estratégia usada baseou-se na redução ou aumento forçados dos níveis de miR-363* em células endoteliais e subsequente análise da expressão génica através de microarrays de cDNA do genoma humano. A redução do miR-363* vai implicar o aumento da expressão dos seus genes alvo, assim como o aumento dos níveis do miR-363* vai induzir a degradação e consequente redução dos seus genes alvos. A intersecção dos dados gerados através do estudo da expressão com bases de dados que possuem algoritmos para previsão de genes alvo directos dos miRNAs (miRBase e MicroCosm Targets) permitiu restringir os genes a analisar a sete genes, nomeadamente BST1, ESAM, FCER1G, IKBKG, SELE, THBS3 e TIMP1. A interacção directa destes candidatos a alvos directos do miR-363* foi posteriormente validada. Para tal, as 3’UTR dos genes foram clonadas num vector que contém o gene da luciferase. Uma vez as clonagens realizadas, efectuaram-se ensaios funcionais em células endoteliais, nomeadamente HUVEC, nas quais se co-transfectaram os vectores gerados, anti-miRs ou pre-miRs (para diminuir ou aumentar o nível de miRNA) e o plasmídeo controlo da Renilla para normalização dos ensaios de luciferase. A variação da luminescência obtida em presença do aumento ou redução do miR-363* deu uma forte indicação da regulação directa do miR-363* nesses alvos. No entanto, a confirmação desta interacção directa foi efectuada através de ensaios de mutagénese, nos quais de induziram mutações na 3’UTR nos locais de ligação do miRNA, seguidos dos ensaios funcionais como acima descritos. Esta estratégia sugere que o TIMP1, inibidor da metaloprotease-9 (MMP-9), é regulado directamente pelo miR-363*. Adicionalmente, os níveis de expressão dos alvos directos do miR-363* foram estudados em 17 amostras de aspirados de medula óssea de doentes com síndromes mielodisplásicos. Os síndromes mielodisplásicos são caracterizados como um grupo heterogéneo de condições, que apresentam citopenias (produção deficiente de eritrócitos, leucócitos e/ou megacariócitos) e medula óssea displástica e hipercelular. A escalonagem dos doentes foi feita de acordo com o sistema de prognóstico IPSS elaborado pela Organização Mundial de Saúde, e que consiste numa tabela de risco de progressão de síndromes mielodisplásicos para leucemia mielóide aguda (LMA) e que agrupa os doentes em baixo risco – que compreende os níveis baixo e intermédio 1 – e em alto risco – que compreende os níveis intermédio 2 e alto. Dos genes regulados pelo miR-363*, o destacam-se o TIMP1, estando aumentando em doentes com mau prognóstico, e o THBS3 que apresenta um aumento nos doentes com prognóstico intermédio. Em suma, os estudos realizados permitiram a identificação de genes regulados pelo miR-363* e contribuiram para o conhecimento de como o miR-363* contribui para a disfunção medular, particularmente em síndromes mielodisplásicos, pela desregulação das propriedades endoteliais.

Molecular characterization of Gla-rich protein (GRP) gene expression and function

Gla-rich protein (GRP) is a vitamin K-dependent protein related to bone and cartilage recently described. This protein is characterized by a large number of Gla (γ-carboxyglutamic acid) residues being the protein with the highest Gla content of any known protein. It was found in a widely variety of tissues but highest levels was found in skeletal and cartilaginous tissues. This small secreted protein was also expressed and accumulated in soft tissues and it was clearly associated with calcification pathologies in the same tissues. Although the biological importance of GRP remains to be elucidated, it was suggested a physiological role in cartilage development and calcification process during vertebrate skeleton formation. Using zebrafish, an accepted model to study skeletal development, we have described two grp paralog genes, grp1 and grp2, which exhibited distinct patterns of expression, suggesting different regulatory pathways for each gene. Gene synteny analysis showed that grp2 gene is more closely related to tetrapod grp, although grp1 gene was proposed to be the vertebrate ortholog by sequence comparison. In addition, we identified a functional promoter of grp2 gene and using a functional approach we confirmed the involvement of transcription factors from Sox family (Sox9b and Sox10) in the regulation of grp2 expression. In an effort to provide more information about the function of grp isoforms, we generated two zebrafish transgenic lines capable to overexpress conditionally grp genes and possible roles in the skeleton development were studied. To better understand GRP function a mammalian system was used and the analysis of knockout mice showed that GRP is involved in chondrocyte maturation and the absence of GRP is associated to proteoglycans loss in calcified articular cartilage. In addition, we detected differences in chondrogenesis markers in articular chondrocyte primary culture. Overall, our data suggest a main role for GRP on chondrocyte differentiation.

Identification and molecular characterization of bone-related micrornas: functional implications

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Identification of regulatory polymorphisms associated with breast cancer risk

Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014

Transport in the blood of an anti-tumor water-soluble rutheniun cyclopentadienyl complex: a fluorescence study on albumin binding

Dissertação de mestrado, Qualidade em Análises, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2014

Remoção de metais pesados de soluções usando um biopolímero

Comunicação seleccionada e artigo em Livro de Actas

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Anestésicos locais

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

A história regional e local —contributos para o estudo das identidades locais

Esta comunicação tem por objectivos levantar questões que se prendam com a ligação da História Regional e Local às identidades locais, reflectindo sobre os possíveis contributos da primeira para o estudo e definição duma identidade local. Ressalta-se também a importância da transdisciplinaridade como metodologia, e o papel activo da museologia como impulsionadora e difusora da História Regional e Local. Faz-se igualmente uma breve panorâmica historiográfica como contextualização e ligação à situação actual da história local. O interesse pela História Local em Portugal tem sido despertado em diversas ocasiões e diferentes contextos ao longo dos tempos. Fazendo uma resenha sucinta sobre a historiografia local podemos recuar até 1720, ano da criação da Academia Real da História. Com ela se iniciaram as primeiras tentativas de valorizar estes estudos, com o enunciar dum inquérito feito pelo académico Manuel Caetano de Sousa, relativo à história eclesiástica, dirigido aos arcebispados, bispados, câmaras e provedorias de comarca, com o intuito de se recolherem notícias extraídas de cartórios e arquivos.

Análise de ligação do gene de resistência Zym-2 com marcadores microssatélites e reação de acessos de meloeiro ao Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV)

As viroses causam perdas significativas na cultura do melão. Dentre essas, o vírus do mosaico amarelo da abobrinha-de-moita (Zucchini yellow mosaic virus- ZYMV) possui grande importância para a cultura e é encontrado em todos os locais de plantio de cucurbitáceas. O controle desse vírus através da resistência genética é a forma mais eficiente de manejo. O acesso PI414723 é a única fonte de resistência de meloeiro ao ZYMV. Essa resistência é oligogênica e supostamente condicionada por três genes dominantes: Zym-1, Zym-2 e Zym-3. A localização cromossômica do gene Zym-1 já foi confirmada no grupo de ligação 2, próximo ao marcador CMAG36. Entretanto, a localização de Zym-2 ainda carece de confirmação experimental, muito embora existam evidências de sua localização no grupo de ligação 10 (LGX). Sendo assim, um dos objetivos do presente trabalho foi confirmar a localização do gene Zym-2 através de análises de ligação com marcadores microssatélites (SSRs). Para tanto, foi utilizada uma população F2 derivada do cruzamento PI414723 x \'Védrantais\'. As plantas foram inoculadas mecanicamente com o isolado RN6-F, patótipo 0, duas vezes em um intervalo de 24 h. A confirmação da infecção e a quantificação dos títulos virais nas plantas F2 foram realizadas através do teste PTA-ELISA. O DNA genômico das plantas foi extraído da primeira folha verdadeira e utilizado nas reações de PCR com primers específicos para SSRs selecionados pertencentes ao LGX. Observou-se uma distribuição assimétrica de classes de absorbância e maior frequência de indivíduos F2 na classe com menor valor (0,1 a 0,2), sugerindo a existência de um gene de efeito maior. O teste chi-quadrado mostrou que todos os marcadores segregaram na frequência esperada (1:2:1), exceto o marcador CMCT134b. A ligação do Zym-2 aos marcadores foi confirmada por meio de regressão linear simples. Dos marcadores analisados, a regressão linear foi significativa para MU6549 e CMBR55, com p-valores de 0,011 e 0,0054, respectivamente. As análises de ligação mostraram que as ordens e as distâncias entre os marcadores condizem com os mapas presentes na literatura. Um segundo objetivo do estudo foi o de avaliar a reação ao ZYMV de 42 acessos de meloeiro oriundos da região Nordeste do Brasil, com o intuito de explorar novas fontes de resistência. Foram realizados dois experimentos utilizando a mesma metodologia citada anteriormente. O título viral médio entre os acessos variou de 0,123 a 0,621 no experimento 1 e de 0,019 a 0,368 no experimento 2. Alguns acessos apresentaram consistentemente baixos títulos virais, próximos aos do acesso resistente PI414723 e dos controles negativos (plantas não inoculadas da cultivar \'Védrantais\'). Portanto, estes acessos mostram-se como potenciais fontes de resistência ao vírus para o emprego em programas de melhoramento.

Estudo numérico experimental de treliças espaciais feitas com tubos de aço com ponta amassada e espaçadores de madeira para corrigir as excentricidades nos nós de ligação

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Tecnologia, 2015.

Mecanismos federais de coordenação de políticas sociais e capacidades institucionais locais : o caso do Programa Bolsa Família

Este trabalho analisa o Programa Bolsa Família (PBF), tratando de sua evolução ao longo do governo Lula, tanto no que diz respeito ao seu escopo quanto a seu desenho institucional e as alterações que foi sofrendo em seus objetivos. Tendo em vista a natureza federativa do Estado brasileiro, o objetivo do trabalho é mostrar os desafios enfrentados pelo poder central para garantir a implementação homogênea de um programa nacional de transferência condicionada de renda a ser gerido pelos municípios. Para tanto, são analisados, de um lado, os recursos institucionais e as estratégias de que dispunha o governo federal para alcançar os seus objetivos para o PBF, e de outro, os resultados e a dinâmica da gestão municipal do programa em dois grandes centros urbanos, São Paulo e Salvador. São analisadas informações relativas ao desempenho nacional do programa e também referentes à implementação municipal do PBF nos casos escolhidos, por meio de dados de surveys realizados com a população de baixa renda e de entrevistas semi-estruturadas com gestores municipais do programa nessas duas cidades. A tese identifica os mecanismos que asseguram o crescente poder de coordenação do governo federal no sentido de fazer com que suas principais diretrizes para o programa sejam de fato implementadas no plano municipal. Mostra também que o processo de implementação do PBF é afetado não só por seu desenho institucional, definido no plano federal, mas também pelas diferentes capacidades institucionais disponíveis no plano local recursos humanos, capacidade de gestão e articulação entre diversos serviços e políticas, infra-estrutura disponível, entre outros aspectos e pelos diferentes interesses políticos na maior ou menor coordenação dos programas locais de transferência com o programa nacional. Finalmente, o trabalho examina ainda os limites e possibilidades para a articulação do PBF com uma política mais ampla de assistência social.

A demanda por deuses: religião, globalização e culturas locais

Nesta tese serão discutidas as principais interseções entre a expansão do pentecostalismo protestante e as culturas locais que são alvo de sua ação evangelizadora. Mais especificamente, pretendemos demonstrar, a partir de estudos realizados em algumas regiões do estado de Minas Gerais e Norte de Portugal, de que forma certas conformações culturais mostram-se extremamente refratárias à implantação e limitam o crescimento das igrejas pentecostais. Nesse sentido, procuramos relativizar algumas vertentes teóricas que têm sido chamadas de paradigma da escolha racional em religião, que em um salto para fora da teoria sociológica de entendimento da religião busca na Economia seus principais fundamentos. De forma diversa, nesta tese defender-se-á que processos histórico-estruturais influenciam a demanda por religião e que a produção e principalmente o consumo dos bens religiosos estão imersos nas relações sociais face-a-face. Desta maneira, não acreditamos serem as regulações estatais a principal variável quando se trata de diversidade religiosa. Outros sim, pensamos que este papel cabe às relações societais, que limitam e regulam o trânsito dos indivíduos entre as denominações religiosas.

Uma abordagem integrativa do conceito de Eco-eficiência: elementos para a concepção de Sistemas de Gestão de Resíduos Sólidos Industriais em Arranjos Produtivos Locais Têxtil-Vestuário

A identificação e avaliação das vulnerabilidades e potencialidades socioambientais e socioecológicas, ao considerar as múltiplas realidades de ecossistemas, territórios e lugares, podem revelar novos caminhos, ações coletivas, solidárias, bem como auxiliar na tomada de decisão estratégica em sistemas de gestão de resíduos sólidos. Tal perspectiva, qualificaria princípios e conceitos metodológicos e técnicos, como aqueles direcionados a responder aos problemas que surgem da interação Humanidade-Sociedade-Natureza, com vistas à sustentabilidade. A Eco-eficiência, ao final do século XX, apresentou-se como solução para os problemas ambientais corporativos. Idealizada para ser aplicada em um empresas isolada, evoluiu para uma categoria central da Ecologia Industrial, ganhou contornos de Princípio e Filosofia para a Gestão Ambiental Empresarial, passando a orientar a geopolítica das nações no trato das questões ambientais supranacionais e políticas públicas das nações. A recente Política Nacional de Resíduos Sólidos apresenta a Eco-eficiência como um de seus princípios que deverão orientar gestores públicos e privados na elaboração de seus sistemas de gestão de resíduos sólidos. Devido aos impactos sociais, ambientais e ecológicos resultantes da geração e destinação inadequada dos resíduos sólidos, estes sistemas de gestão apresentam interfaces com outras políticas e sistemas de gestão públicos e privados nacionais. Estas interações conferem ao sistema de gestão de resíduos sólidos um caráter complexo, aberto, dinâmico e inclusivo, no qual o conceito de Eco-eficiência, baseado na alocação de recursos naturais, pode ser ressignificado em um outro nível de realidade, o nível coletivo, apresentando-se, como um conceito potencial voltado para a criação de recursos. Para corroborar esta hipótese apresenta-se uma abordagem integrativa com base na perspectiva socioecológica e no pensamento e metodologia transdisciplinar, na qual o conceito será contextualizado, problematizado e complexificado em seis níveis de realidade: Nível Genus-Global, Nível Político, Nível Acadêmico, Nível do Ecossistema, Território e Lugares, Nível Operacional e Nível Coletivo. Considera-se nesta abordagem os Arranjos Produtivos (indústrias e a Cadeia de Reciclagem), Arranjos Sociais (Comunidade localizadas e áreas de risco e precárias), Ecossistemas e Territórios, como Teia de Lugares, como Unidade Transdisciplinar perceptiva, cognitiva e analítica. A aplicação desta metodologia no Arranjo Produtivo Local Têxtil- Vestuário de Petrópolis, localizado na Região Serrana Fluminense, que se insere em um Ecossistema de Montanha, permitiu revelar outro Arranjo, invisível ao sistema de gestão público. Neste Arranjo de Retalhos e Estopas, cerca de 240 mulheres, residentes em comunidades precárias e de risco, beneficiam os resíduos sólidos gerados pelas indústrias do arranjo formal, conhecidos como retalhos, com os quais fabricam estopas. Conclui-se que esta abordagem integrativa, como proposta de ressignificação do conceito de Eco-eficiência, permitiu revelar, não somente uma nova realidade conceitual para a sua adoção e prática, como novos aspectos e variáveis para a construção de sistemas de gestão de resíduos sólidos industriais que tenham por foco a inclusão social, produtiva, cientifica e tecnológica de novos atores e recursos ao sistema.

Growth and characterization of ZnO films on (0 0 1), (1 0 0) and (0 1 0) LiGaO2 substrates

ZnO films were fabricated on LiGaO2 (0 0 1), (10 0) and (0 10) planes by RF magnetron sputtering. The structural, morphological and optical properties of as-grown ZnO films were investigated by X-ray diffraction (XRD), atomic force microscopy (AFM), Raman spectra and photoluminescence (PL) spectra. It is found that the orientation of ZnO films is strongly dependent on the substrate plane. [0 0 0 11, [1 (1) over bar 00] and [11 (2) over bar0] oriented ZnO films are deposited on LiGaO2 (001), (100) and (010), respectively. AFM shows the (0001) ZnO film consists of well-aligned regular hexagonal grains. Raman spectra reveal a tensile stress in the (0 0 0 1) ZnO film and a compressive stress in (110 0) and (112 0) ZnO films. PL spectra of all ZnO films exhibit only a near-band-edge UV emission peak. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.