Caractérisation de l’interaction entre la protéine Lin28 et le précurseur du microARN let-7g

La régulation de l’expression des gènes est ce qui permet à nos cellules de s’adapter à leur environnement, de combattre les infections ou, plus généralement, de produire la quantité exacte de protéine nécessaire pour répondre à un besoin spécifique. Parmi les joueurs les plus importants dans cette régulation de l’expression des gènes on retrouve les microARN (miARN). Ces petits ARN de 22 nucléotides sont présents chez la majorité des espèces multicellulaires et sont responsables du contrôle direct de plus de 30% des gènes exprimant des protéines chez les vertébrés. La famille de miARN lethal-7 (let-7) est composée de miARN parmi les plus connus et ayant des fonctions cruciales pour la cellule. La régulation du niveau des miARN let-7 est essentielle au bon développement cellulaire. La biogenèse de ces miARN, du transcrit primaire jusqu’à leur forme mature, est régulée principalement par Lin28, une protéine pluripotente très conservée. Cette protéine est composée d’un domaine cold shock (CSD) et de deux domaines de liaison au zinc. C’est grâce à ces domaines de liaison à l’ARN que Lin28 peut lier et inhiber la maturation des miARN let-7. L’objectif de cette thèse est de caractériser l’interaction entre Lin28 et le microARN précurseur let-7g afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’inhibition de la biogenèse du miARN. À l’aide de techniques biochimiques et biophysiques, nous avons d’abord défini les principaux déterminants de l’interaction entre Lin28 et la boucle terminale du miARN précurseur let-7g (TL-let-7g). Nous avons conclu que le domaine C-terminal de Lin28, composé d’un motif riche en lysines et arginines ainsi que de deux motifs de liaison au zinc, permet à la protéine de lier spécifiquement et avec haute affinité un renflement riche en guanine conservé chez les précurseurs de la famille let-7. Aussi, parce que la séquence et la spécificité de liaison à l’ARN de ce domaine C-terminal sont semblables à celles de la protéine NCp7 du VIH, nous avons défini ce dernier comme le domaine NCp7-like de Lin28. Par la suite, nous avons caractérisé la multimérisation de trois protéines Lin28 sur la boucle terminale de pre-let-7g. Ceci a permis de réconcilier d’apparentes contradictions retrouvées dans la littérature actuelle concernant les sites de liaison de Lin28 lors de sa liaison aux miARN précurseurs. Nous avons identifié trois sites de liaison à haute affinité sur TL-let-7g qui sont liés dans un ordre précis par trois protéines Lin28. Lors de la formation du complexe multimérique, le CSD permet une déstabilisation de l’ARN, ce qui rend accessible plusieurs sites de liaison. Le domaine NCp7-like permet plutôt un assemblage ordonné de la protéine et facilite la liaison initiale de cette dernière. Ces nouveaux résultats rendent possible la mise au point d’un nouveau modèle de l’interaction entre Lin28 et le miARN précurseur let-7g. En conclusion, les études réalisées dans cette thèse apportent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation post-transcriptionnelle d’une importante famille de miARN et permettront de guider les futures études dans le domaine de recherche en pleine effervescence qu’est celui de la biogenèse des miARN.

Isolation of novel multipotent neural crest-derived stem cells from adult human inferior turbinate

Adult human neural crest-derived stem cells (NCSCs) are of extraordinary high plasticity and promising candidates for the use in regenerative medicine. Here we describe for the first time a novel neural crest-derived stem cell population within the respiratory epithelium of human adult inferior turbinate. In contrast to superior and middle turbinates, high amounts of source material could be isolated from human inferior turbinates. Using minimally-invasive surgery methods isolation is efficient even in older patients. Within their endogenous niche, inferior turbinate stem cells (ITSCs) expressed high levels of nestin, p75(NTR), and S100. Immunoelectron microscopy using anti-p75 antibodies displayed that ITSCs are of glial origin and closely related to nonmyelinating Schwann cells. Cultivated ITSCs were positive for nestin and S100 and the neural crest markers Slug and SOX10. Whole genome microarray analysis showed pronounced differences to human ES cells in respect to pluripotency markers OCT4, SOX2, LIN28, and NANOG, whereas expression of WDR5, KLF4, and c-MYC was nearly similar. ITSCs were able to differentiate into cells with neuro-ectodermal and mesodermal phenotype. Additionally ITSCs are able to survive and perform neural crest typical chain migration in vivo when transplanted into chicken embryos. However ITSCs do not form teratomas in severe combined immunodeficient mice. Finally, we developed a separation strategy based on magnetic cell sorting of p75(NTR) positive ITSCs that formed larger neurospheres and proliferated faster than p75(NTR) negative ITSCs. Taken together our study describes a novel, readily accessible source of multipotent human NCSCs for potential cell-replacement therapy.

Expression analysis of stem cell-related genes reveal OCT4 as a predictor of poor clinical outcome in medulloblastoma

Aberrant expression of stem cell-related genes in tumors may confer more primitive and aggressive traits affecting clinical outcome. Here, we investigated expression and prognostic value of the neural stem cell marker CD133, as well as of the pluripotency genes LIN28 and OCT4 in 37 samples of pediatric medulloblastoma, the most common and challenging type of embryonal tumor. While most medulloblastoma samples expressed CD133 and LIN28, OCT4 expression was found to be more sporadic, with detectable levels occurring in 48% of tumors. Expression levels of OCT4, but not CD133 or LIN28, were significantly correlated with shorter survival (P <= 0.0001). Median survival time of patients with tumors hyperexpressing OCT4 and tumors displaying low/undetectable OCT4 expression were 6 and 153 months, respectively. More importantly, when patients were clinically stratified according to their risk of tumor recurrence, positive OCT4 expression in primary tumor specimens could discriminate patients classified as average risk but which further deceased within 5 years of diagnosis (median survival time of 28 months), a poor clinical outcome typical of high risk patients. Our findings reveal a previously unknown prognostic value for OCT4 expression status in medulloblastoma, which might be used as a further indicator of poor survival and aid postoperative treatment selection, with a particular potential benefit for clinically average risk patients.

Reprogramming of prostate cancer-associated stromal cells to embryonic stem-like

BACKGROUND CD90+ prostate cancer-associated (CP) stromal cells represent a diseased cell type found only in tumor tissue. They differ from their normal counterpart in gene expression and inductive signaling. Genetic reprogramming by induced pluripotent stem (iPS) cell technology can effectively change adult cells into stem-like cells through wholesale alteration of the gene expression program. This technology might be used to erase the abnormal gene expression of diseased cells. The resultant iPS cells would no longer express the disease phenotype, and behave like stem cells. METHODS CP stromal cells, isolated from tumor tissue of a surgically resected prostate by anti-CD90-mediated sorting and cultured in vitro, were transfected with in vitro packaged lentiviral expression vectors containing stem cell transcription factor genes POU5F1, LIN28, NANOG, and SOX2. RESULTS Alkaline phosphatase-positive iPS cells were obtained in about 3 weeks post-transfection at a frequency of 10-4. Their colony morphology was indistinguishable from that of human embryonic stem (ES) cells. Transcriptome analysis showed a virtually complete match in gene expression between the iPS and ES cells. CONCLUSIONS Genes of CP stromal cells could be fully inactivated by genetic reprogramming. As a consequence, the disease phenotype was cured. Prostate 72:14531463, 2012. (c) 2012 Wiley Periodicals, Inc.