Implementação de métodos moleculares para o diagnóstico precoce de leptospirose humana

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para a obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

Teste imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos circulantes da classe IgM na leptospirose humana

Foi avaliado o teste imunoenzimático (ELISA), para detecção de anticorpos da classe IgM na leptospirose humana. Nas amostras de soros analisadas, o teste ELISA demonstrou ser mais sensível, específico e precoce, quando comparado ao teste de soroaglutinação microscópica. A análise dos resultados obtidos nesta avaliação demonstra que o teste ELISA permite detectar níveis baixos de anticorpos circulantes, e também anticorpos não aglutinantes. não detectáveis através do teste de soroaglutinação microscópica.

Imunodiagnóstico da leptospirose humana através do teste ELISA-IgM, empregando-se diferentes preparações antigênicas a partir de sorotipos prevalentes de Leptospira interrogans

Realizou-se estudo comparativo de diferentes sorotipos de Leptospira interrogans utilizados na preparação de antígenos empregados no teste ELISA, para a detecção de anticorpos da classe IgM, em amostras de soro na fase precoce e tardia da leptospirose humana. Foram utilizados dez sorotipos, escolhidos entre os que apresentaram maior reatividade na soroaglutinação microscópica (SAM), na cidade de São Paulo. Os cinco sorotipos que apresentaram melhores resultados individualmente no teste ELISA-IgM (canicola, hebdomadis, icterohaemorrhagiae, cynopteri e brasiliensis), foram também estudados em mistura antigênica. Os antígenos não tratados apresentaram maior reatividade do que os antígenos tratados com Triton X - 100 (4%) à temperatura de 50ºC, durante 4 horas. O teste ELISA-IgM empregando os sorotipos não tratados, isoladamente, e em mistura antigênica, mostrou-se altamente sensível, podendo ser empregado como teste de triagem para o diagnóstico precoce da leptospirose humana. Outra aplicação do teste é permitir a detecção do início de situações epidêmicas ou de surtos, possibilitando acionar medidas de vigilância epidemiológica.

Surto de leptospirose humana por atividade recreacional no município de José dos Campos, São Paulo: estudo soroepidemiológico

Um surto de leptospirose humana por atividade recreacional ocorreu no município de São José dos Campos em novembro de 1987, envolvendo um grupo de pessoas que, ao participarem de uma festa de confraternização em um clube na periferia da cidade, banharam-se em uma piscina de água natural. Após a realização da investigação epidemiológica e laboratorial, observou-se alta prevalência do sorotipo pomona na análise sorológica (91%) e não se conseguiu isolar o agente etiológico nas amostras de água da piscina do clube. Os dados epidemiológicos e laboratoriais sugerem que a fonte de infecção tenha sido a água da piscina contaminada por dejetos de suínos e de outros animais domésticos dos locais adjacentes a água do córrego que alimentava a piscina do clube.

Avaliação da contraimunoeletroforese com antígenos dos sorovars icterohaemorrhagiae E patoc no diagnóstico sorológico da leptospirose humana

Avaliou-se o desempenho da contraimunoeletroforese (CIE) no diagnóstico sorológico da leptospirose humana utilizando três tipos de antígenos derivados da L. interrogans sorovar icterohaemorrhagiae e do sorovar patoc da L. biflexa. Comparou-se os resultados obtidos na CIE com a prova de referência a soroaglutinação microscópica (SAM). Soros pareados de 135 pacientes com leptospirose foram subdivididos em 4 grupos de acordo com os resultados da SAM. Como controle coletou-se sangue de 69 indivíduos sadios. A concordância entre as duas técnicas variou de 92,64 a 94,11%. Os resultados obtidos pela CIE com os antígenos do sorovar icterohaemorrhagiae foram mais favoráveis do que aqueles derivados do patoc. Ressaltam-se as características de elevada sensibilidade detectando anticorpos antileptospiras mais precocemente do que a microaglutinação. As características encontradas no presente estudo credenciam o emprego da CIE como um método útil e prático para o diagnóstico da leptospirose humana na fase aguda da doença.

Sorovares de Leptospira interrogans isolados de casos de leptospirose humana em São Paulo, Brasil

Sorovares de Leptospira interrogans isolados de pacientes hospitalizados na cidade de São Paulo no período de 1986 a 1989, foram identificados pela técnica de absorção de aglutininas no Setor de Leptospirose do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo. Das 18 cepas sorotipadas, 14 foram idênticas ao sorovar copenhageni (sorogrupo Icterohaemorrhagiae), 2 ao canicoia (sorogrupo Canicola), 1 ao castellonis (sorogrupo Ballum) e 1 ao sorogrupo Pomona (sorovar ainda não definido). Os autores ressaltam a freqüência do sorovar copenhageni em 100% das cepas dentro do sorogrupo Icterohaemorrhagiae e sugerem mais estudos sobre os sorovares prevalentes em nosso meio como subsídio à epidemiologia desta zoonose

Avaliação do teste ELISA-lgM no diagnóstico precoce da leptospirose humana

Foram estudadas 37 amostras de sangue de pacientes com leptospirose, forma icterohemorrágica, com intervalo de tempo de 2 a 12 dias entre o início dos sintomas e a coleta do material. Isolou-se leptospiras por hemocultura de 5 (13,5%) pacientes e em 4 destes, o agente etiológico pertencia ao sorogrupo Icterohaemorrhagiae sorovar copenhageni. O teste imunoenzimático ELISA-IgM apresentou reatividade em 35 (94,6%) pacientes, incluindo os 4 pacientes dos quais o agente etiológico foi isolado. Este teste demonstrou ser um importante recurso laboratorial para o diagnóstico da letospirose humana, mesmo no início da doença quando ainda na fase de leptospiremia.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose humana na região do Lobito (Angola): aplicação de métodos de diagnóstico serológico e molecular

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Contribuição para o conhecimento da Leptospirose Humana na Região do Lobito (Angola)

A Leptospirose é um problema emergente na Saúde Pública, devido às suas proporções epidemiológicas e pelo aumento da incidência da doença em países industrializados e em desenvolvimento (Meites et al., 2004). A doença tem uma ampla distribuição geográfica e ocorre com maior frequência nas zonas tropicais, subtropicais e temperadas (Vijayachari et al., 2008). Contudo, em algumas regiões desconhece-se a verdadeira prevalência, sendo reportada através de surtos esporádicos (Pappas et al., 2007). As manifestações clínicas inespecíficas da infecção podem ser subdiagnosticadas nas regiões tropicais, onde as doenças febris são comuns e onde podem ser confundidas com doenças mais conhecidas como a Malária, Hepatite Viral, Dengue e outras. Em Angola, o diagnóstico é realizado apenas através da história do paciente e suspeita clínica, dando origem a diagnósticos pouco precisos. Deste modo, é importante o uso de métodos laboratoriais, especialmente testes serológicos específicos, para a confirmação do diagnóstico clínico (Levett, 2001). O objectivo principal deste estudo foi investigar a ocorrência de Leptospirose humana em Lobito (Província de Benguela) e identificar os serovares circulantes de Leptospira interrogans sensu lato (s.l.), utilizando técnicas serológicas e moleculares. Entre Abril e Junho de 2011, após o necessário consentimento informado, fez-se um inquérito clínico-epidemiológico a 141 pacientes (64 homens e 77 mulheres) assistidos no Hospital Geral do Lobito, por cefaleias e febre com diagnóstico desconhecido, dos quais se colheram 141 amostras séricas e 36 amostras de urina. A avaliação serológica foi inicialmente feita no laboratório local através da Técnica de Aglutinação Macroscópica sobre Lâmina (MACROLepto) – teste de rastreio - e, posteriormente confirmada pela Técnica de Aglutinação Microscópica (TAM) - teste de referência - realizado no Laboratório de Leptospirose (IHMT, em Lisboa). Para a detecção de DNA de Leptospira utilizou-se a Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR) com primers baseados no gene hap 1. Procedeu-se ainda à sequenciação dos produtos da PCR. As principais manifestações clínicas foram: cefaleias (73,8%), febre (65,2%), mialgias (41,1%) e náuseas (33,3%). Dos dados epidemiológicos observou-se que 131 dos pacientes tiveram contacto com os principais reservatórios de leptospiras, os roedores, e 76 ingeriram água não potável. Os resultados serológicos revelaram no teste MACROLepto: 14 (10%) amostras positivas e 18 (13%) não-conclusivas, sendo os serogrupos Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Australis (Bratislava) e Sejroe os mais comuns. Destas amostras, cinco, foram confirmadas pela TAM (presença de aglutininas anti – L. interrogans s.l.). Paralelamente, o DNA de Leptospira foi detectado em 13+/81 (16%) das amostras séricas e numa amostra de urina. A sequenciação identificou os serovares Copenhageni e Lai, ambos pertencentes ao serogrupo Icterohaemorrhagiae da espécie genómica L. interrogans. Os resultados obtidos mostraram que a maioria dos pacientes, mesmo aqueles que praticavam actividades de menor risco epidemiológico, tiveram contacto com roedores e com águas não potáveis. O estudo também provou que a Leptospirose afectou sobretudo as mulheres adultas, admitindo-se que este achado possa ser comum noutras regiões do País. Por último, ficou demonstrada a existência de Leptospirose na região, o que poderá contribuir para a inclusão da doença na lista de doenças febris em Angola e noutros países tropicais.

Leptospirose humana no município de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil: uma abordagem geográfica

Uma análise retrospectiva da leptospirose humana no município de Belo Horizonte em 1995 foi realizada usando recursos de geoprocessamento.Trinta casos suspeitos e 19 casos confirmados foram localizados na área. A predominância de casos confirmados foi registrada nas regiões norte, nordeste e oeste (68,4 ± 13%). Nas áreas de favelas e bolsões de pobreza foram identificados os principais focos da doença, 73,7 ± 12% dos casos confirmados e 26,7 ± 12% dos casos suspeitos. Na periferia, onde ocorreu um aumento populacional, localizaram-se 95 ± 6% dos casos confirmados, sendo o local com maior carência de infra-estrutura básica. Na distribuição espacial dos principais cursos d'água do município, observou-se que 50 ± 14% dos casos suspeitos e 42 ± 14% dos casos confirmados estavam localizados nas áreas com maior concentração de redes fluviais. Casos suspeitos (83,3 ± 10%) e confirmados (79 ± 11%) ocorreram em partes altimétricas mais baixas da cidade (750 a 1.000m) e 78 ± 12% dos indivíduos tiveram contato com água e / ou animais contaminados.

Evidência do cão como reservatório da leptospirose humana: isolamento de um sorovar, caracterização molecular e utilização em inquérito sorológico

A leptospirose canina é conhecida como enfermidade de Stuttgard desde 1898, sendo os cães, depois dos roedores, considerados como a segunda principal fonte de infecção para o homem. O isolamento de um sorovar patogênico da urina de um cão, laboratorial e clinicamente identificado como tendo leptospirose, e sua utilização para testar amostras de soro de casos de leptospirose humana e canina, evidenciou a sua importância no ecossistema da região sul do Brasil. Os resultados do teste de soroaglutinação microscópica indicaram que 100% das amostras de soro humano de 12 pacientes do banco de soro de 2001 do Centro de Controle de Zoonoses, que haviam reagido com títulos que variaram de 25 a 3.200 para o sorovar canicola, e 72% das amostras de 105 soros caninos do mesmo banco de soro, também reagiram contra o novo isolado. O título médio e mediana dos soros humanos testados com a bateria de antígenos recomendada pela OMS, foi respectivamente 630 e 100, ao passo que os testados com o isolado foi de 1.823 e 400. Nos soros caninos, os títulos foram respectivamente de 347 e 100 para a bateria e de 1.088 e 200 para o isolado.

Leptospirose humana na Província da Huíla: rastreio serológico e molecular de doentes assistidos no Hospital Central Dr. António Agostinho Neto, Lubango (Angola)

A Leptospirose é uma doença infecciosa causada por bactérias patogénicas do género Leptospira. Ocorre sobretudo nos países em desenvolvimento, em regiões tropicais e subtropicais. Nos últimos anos tem-se tornado um problema emergente de Saúde Pública, afectando uma grande diversidade de mamíferos (hospedeiros), incluindo os humanos. Actualmente observa-se um aumento do número de casos com alterações do padrão epidemiológico, assim como o ressurgimento de surtos epidémicos devido a alterações climáticas. No entanto, devido aos sintomas inespecíficos, o diagnóstico clínico é confundível com outras doenças e o laboratorial é difícil e dispendioso, requerendo recursos e técnicos especializados. Em Angola (Lubango), o diagnóstico laboratorial não é praticado devido à indisponibilidade de testes específicos, resultando no desconhecimento da sua prevalência. Assim, de modo, a determinar a sero-ocorrência da Leptospirose humana em doentes febris assistidos no Hospital Central do Lubango, contribuindo para: i) a possível inclusão desta doença no diagnóstico diferencial de doentes com síndromes febris indeterminados; e ii) implementar medidas de prevenção e controlo. Foram analisadas 300 amostras séricas obtidas em igual número de doentes febris que recorreram ao referido hospital, no período de Setembro a Dezembro de 2012, aos quais também se aplicou um inquérito clínico-epidemiológico. Foi realizada uma avaliação serológica usando a técnica de rastreio (MACROLepto), e a técnica de referência (Técnica de Aglutinação Microscópica; TAM). Para a análise molecular usou-se a Reacção em Cadeia de Polimerase (PCR), em soro utilizando primers baseados no gene hap1 (para leptospiras patogénicas). Os produtos amplificados foram sequenciados para determinação de espécies genómicas de Leptospira. A amostra populacional foi constituída por indivíduos do género masculino (111; 37%) e (189; 63%) do género feminino. A suspeita clínica de Leptospirose foi confirmada serologicamente pela TAM em (120+/300; 40%) dos doentes, e a análise por PCR foi positiva em (30+/193; 16%) das amostras analisadas. A sequenciação do DNA obtido permitiu identificar três espécies genómicas: L. borgpetersenii, L. interrogans e L. kirschneri. Os participantes no estudo foram distribuídos por grupos etários, e a média de idade foi de 30 anos, sendo os grupos (11-20 e 21- 30 anos) os mais representados, e o género feminino o mais afectado (61%). As principais manifestações clínicas foram a febre (91%), cefaleias (84%) e mialgias (59%). Em relação as variáveis de risco de infecção por Leptospira spp., verificou-se que a ausência de saneamento básico, exposição aos lixos, presença de roedores próximos das populações e o consumo de água não tratada, foram as situações mais referidas. O contacto com os roedores, seguido dos canídeos, foi referido por 97% e 41% dos doentes com resultado positivo. Quanto à proveniência, a maioria dos doentes veio de áreas suburbanas. No que respeita à ocupação destacaram-se as mulheres camponesas, estudantes e domésticas. Os soros com resultado positivo mostraram reactividade específica para leptospiras de 19 serogrupos (serovares) com maior destaque, Icterohaemorrhagiae (Copenhageni), Hebdomadis, Javanica (Poi) Australis (Bratislava) e Sejroe (Hardjobovis). O título mais elevado foi de 1:800 observado para os serovares Copenhageni, Ballum (Arborea), Panama e Pyrogenes. Os resultados obtidos mostraram que a Leptospirose está presente entre os doentes febris na província da Huíla, sendo importante incluir esta zoonose no diagnóstico diferencial e promover medidas de prevenção e controlo, especialmente nos grupos de risco agora identificados.

Aspectos funcionais respiratórios na leptospirose humana

INTRODUÇÃO: O comprometimento respiratório da leptospirose humana pode ser sua principal manifestação clínica e comumente está associado a maior morbimortalidade. MÉTODOS: Objetivando descrever aspectos funcionais respiratórios nessa doença, foram analisados 21 pacientes com oximetrias de pulso e espirometrias em dois momentos: em avaliação inicial e após cerca de 28 dias. RESULTADOS: Dois (9,5%) doentes tinham saturação periférica de oxigênio menor que 95%. Padrões espirométricos normais foram observados em 8 (38,1%) casos; distúrbios ventilatórios restritivos foram inferidos em 7 (33,3%), obstrutivos com capacidade vital forçada reduzida em 4 (19%), e inespecíficos em 2 (9,5%). Espirometrias anormais se associaram a pior escore APACHE II (p=0,02) e anormalidades na radiografia de tórax (p=0,05). Após resolução clínica, verificou-se ganho funcional significativo (p<0,05) no grupo de pacientes com espirometria alterada. CONCLUSÕES: Alterações espirométricas foram detectadas no curso da enfermidade e estiveram associadas a pior gravidade clínica e maior freqüência de anormalidades radiológicas torácicas.

Contribuição do conhecimento da epidemiologia da leptospirose humana, com especial referência ao Grande Rio, Brasil, no período de 1970 a 1982

Com o intuito de fornecer dados ao estudo da leptospirose humana, foram analisados 884 pacientes diagnosticados sorologicamente no Laboratório de Leptospirose da Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, no período de 1970 a 1982. Deste total, 775 estiveram internados em hospitais da cidade do Rio de Janeiro e 109 eram oriundos de outras cidades do Brasil. Sorologicamente, Icterohaemorrhagiae foi o sorogrupo mais freqüente, tanto para os pacientes do Grande Rio (76,4%), como para os demais (41,3%). No decorrer dos 13 anos, foram isoladas duas cepas de Icterohaemorrhagiae. Com relação ao Grande Rio, observou-se uma freqüência maior da doença entre janeiro e abril (53,7%); o sexo masculino concorreu para 89,9% dos casos; e a faixa etária mais atingida compôs-se de indivíduos entre 16 e 45 anos (74,9%).