Expressão gênica das interleucinas IL-4, IL-10, IL-12 e de interferon gama no baço de gatos infectados por Leishmania infantum chagasi

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Identification of Leishmania infantum chagasi proteins in urine of patients with visceral leishmaniasis: a promising antigen discovery approach of vaccine candidates

Visceral leishmaniasis (VL) is a serious lethal parasitic disease caused by Leishmania donovani in Asia and by Leishmania infantum chagasi in southern Europe and South America. VL is endemic in 47 countries with an annual incidence estimated to be 500 000 cases. This high incidence is due in part to the lack of an efficacious vaccine. Here, we introduce an innovative approach to directly identify parasite vaccine candidate antigens that are abundantly produced in vivo in humans with VL. We combined RP-HPLC and mass spectrometry and categorized three L. infantum chagasi proteins, presumably produced in spleen, liver and bone marrow lesions and excreted in the patients urine. Specifically, these proteins were the following: Li-isd1 (XP_001467866.1), Li-txn1 (XP_001466642.1) and Li-ntf2 (XP_001463738.1). Initial vaccine validation studies were performed with the rLi-ntf2 protein produced in Escherichia coli mixed with the adjuvant BpMPLA-SE. This formulation stimulated potent Th1 response in BALB/c mice. Compared to control animals, mice immunized with Li-ntf2+ BpMPLA-SE had a marked parasite burden reduction in spleens at 40 days post-challenge with virulent L. infantum chagasi. These results strongly support the proposed antigen discovery strategy of vaccine candidates to VL and opens novel possibilities for vaccine development to other serious infectious diseases.

A infecção por Leishmania infantum chagasi altera o metabolismo lipídico do hospedeiro

American visceral leishmaniasis (AVL), caused by Leishmania infantum chagasi (L.i.chagasi), stands as a public health problem in Brazil, with human and canine cases related in all states..Lipid metabolism can be modified in several status of infection. For example, experimental studies show that the cholesterol is necessary to internalization and replication of L.i.chagasi in macrophages through caveolar domains. Patients with AVL present low levels of cholesterol and a visible triglycerides increase. This work aimed to evaluate the lipid metabolism in several post-infection status by L.i.chagasi, including individuals with symptomatic infection (AVL), and asymptomatic. The levels of cholesterol, triglycerides, HDL and reactive C protein, were measured. Individuals with AVL were compared with individuals with assymptomatic infection and presented low levels of total cholesterol (128 ± 6.180 mg/dL vs. 158 ±5.733 mg/dL, p=0.0001), HDL (29 ± 1.746 mg/dL vs. 37 ± 1.647 mg/dL, p=0.0001), increased levels of triglycerides (149.5 mg/dL ± 12.72 vs. 78.00 ± 10.43 mg/dL, p=0.0095) and higher levels of reactive C protein (1.750± 0.4939 mg/dL vs. 0.40 ± 0.1707 mg/dL; p=0.0001). The expression of genes related to lipid metabolism, such as LXR-a, LXR-b, PPAR-a, PPAR-d, PPAR-g and APOE was evaluated by real time PCR. A reduction in the expression of those genes was found in the group of AVL patients corroborating the serum levels of the metabolites earlier quantified. Our findings suggest a modulation of metabolism of lipids, in the chronic phase of AVL, this could facilitate the survival of leishmania, due to the known reduction on the ability of macrophages in presenting antigens efficiently to the T cells due to the reduction in the cholesterol available, it results in a subversion of the host immunity.

Canine visceral leishmaniasis due to Leishmania (L.) infantum chagasi in Amazonian Brazil: comparison of the parasite density from the skin, lymph node and visceral tissues between symptomatic and asymptomatic, seropositive dogs

A leishmaniose visceral canina (LVC) é reconhecida pelas características clínicas da doença e é altamente letal. A infecção, entretanto, pode ser totalmente assintomática em alguns cães soropositivos, o que tem levantado questão polêmica sobre a possibilidade desses animais, serem ou não uma fonte importante da infecção para o flebotomíneo, Lutzomyia longipalpis, o principal vetor da leishmaniose visceral americana (LVA). Neste estudo foram examinados 51 cães com LVC aguda, provenientes de área endêmica de LVA no Estado do Pará, Brasil, e a carga parasitária, formas amastigotas de, na pele, linfonodo poplíteo e vísceras (fígado e baço) foi comparada com a de nove cães assintomáticos soropositivos (IFAT-IgG). Fragmentos de biópsia desses tecidos obtidos post-mortem foram processados para análise através de imunohistoquímica, usando um anticorpo policlonal contra Leishmania sp. Os testes do Qui-quadrado (X²) e Mann Whitney foram usados para avaliar as médias da densidade de macrófagos infectados (p < 0,05). Os resultados mostraram que não houve diferença (p > 0,05) na densidade de macrófagos infectados da pele (10,7/mm² x 15,5/mm²) e do linfonodo (6,3/mm² x 8,3/mm²) entre cães assintomáticos e sintomáticos. Entretanto, a densidade de macrófagos infectados da víscera de cães sintomáticos (5,3/mm²) foi maior (p < 0,05) que a de cães assintomáticos (1,4/mm²). Estes resultados sugerem, fortemente, que cães naturalmente infectados por L. (L.) i. chagasi, assintomáticos ou sintomáticos, podem servir como fonte de infecção, principalmente, considerando-se que a densidade de macrófagos infectados da pele (10,7/mm² x 15,5/mm²), local onde o flebotomíneo vetor Lu. longipalpis realiza a hematofagia, foi maior (p < 0,05) que as do linfonodo (6,3/mm² x 8.3/mm²) e vísceras (1,4/mm2x 5,3/mm2).

Recuperação e purificação do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli e remoção de endotoxina utilizando adsorção em leito expandido

The growing interest and applications of biotechnology products have increased the development of new processes for recovery and purification of proteins. The expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In the second design, the only significant factor for elution was the concentration of imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and 0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E. coli unclarified feedstock in just one step.

Validation of a Leishmania infantum ELISA rapid test for serological diagnosis of Leishmania chagasi in dogs

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Detecção de anticorpos anti-leishmania infantum syn chagasi em cães de São José do Rio Preto, São Paulo

Visceral leishmaniasis (VL) has been a widespread zoonosis in São Paulo since 1998, when the first autochthonous canine case was identified in Araçatuba. The aim of this study was to determine the occurrence of anti-Leishmania infantum syn chagasi antibodies in serum samples of 584 dogs from São José do Rio Preto, São Paulo, a non endemic area for the disease. Five dogs (0.86%) seroconverted by ELISA and one (0.17%) by immunochromatography. The indirect immunofluorescent reaction, carried out in 138 animals whose optical densities were above or close to ELISA's cutt-off point, evidenced two dogs (1.45%) with titers above 1:40. Only one dog was serum-reactive on the three techniques. Although there was not a history of displacing this animal to endemic areas, the dog had been acquired in a region with canine and human cases of VL. These results suggests that there were no autochthonous cases of canine VL in this population.

Necessidade de vigilância epidemiológica para Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) e Leishmania (Viannia) braziliensis em flebotomíneos e gatos errantes no Bosque Municipal de Marília-SP

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Atividade anti-leishmania e imunomodulatória in vitro da melitina natural na infecção experimental por Leishmania (L.) infantum chagasi

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Susceptibility of peritoneal macrophage from different species of neotropical primates to Ex vivo Leishmania (L.) infantum chagasi-infection

Este estudo examinou a susceptibilidade do macrófago peritoneal (PM) dos primatas neotropicais: Callithrix jacchus, Callithrix penicillata, Saimiri sciureus, Aotus azarae infulatus e Callimico goeldii para a infecção ex vivo por Leishmania (L.) infantum chagasi, o agente etiológico da leishmaniose visceral americana (LVA), como método de triagem para avaliar o potencial desses primatas como modelo de estudo da LVA. A susceptibilidade do PM para a infecção foi investigada através do índice de infecção do PM (PMI) a intervalos de 24, 72 horas e, ainda, pela média dessas taxas (FPMI), assim como, pelas respostas do TNF-α, IL-2 (ELISA de captura) e óxido nítrico (NO) (método de Griess). Às 24hs da infecção experimental, o PMI do primata A. azarae infulatus (128) foi maior que aqueles de C. penicillata (83), C. goeldii (78), S. sciureus (77) e C. jacchus (55). Às 72hs, houve uma redução significativa do PMI de quatro primatas: A. azarae infulatus (128/37), C. penicillata (83/38), S. sciureus (77/38) e C. jacchus (55/12), com exceção de C. goeldii (78/54). O FPMI dos primatas A. azarae infulatus (82.5) e C. goeldii (66) foi maior que do primata C. jacchus (33.5), porém, não foi maior que dos primatas C. penicillata (60.5) e S. sciureus (57.5). A resposta do TNF-α foi mais regular nos quatro primatas que reduziram o PMI no intervalo de 24-72hs: C. jacchus (145/122 pg/µL), C. penicillata (154/130 pg/µL), S. sciureus (164/104 pg/µL) e A. azarae infulatus (154/104 pg/µL), com exceção de C. goeldii (38/83 pg/µL). A resposta de IL-12 foi, principalmente, marcante nos primatas A. azarae infulatus e C. goeldii, os quais apresentaram as maiores taxas do FPMI, e a resposta do NO foi maior no primata C. goeldii, em especial no intervalo de 72hs. Estes achados sugerem, fortemente, que estes primatas neotropicais parecem ter desenvolvido mecanismos resistentes de resposta imune inata capaz de controlar o crescimento intracelular da infecção por L. (L.) i. chagasi no macrófago, o que não encoraja o uso destes primatas como modelo de estudo da LVA.

Susceptibility of Cebus apella monkey (Primates: Cebidae) to experimental Leishmania (L.) infantum chagasi-infection

Na Amazônia Brasileira, o macaco Cebus apella (Primata: Cebidae) tem sido associado com o ciclo enzoótico da Leishmania (V.) shawi, um parasito dermotrópico causador da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Ele tem sido também empregado com sucesso como modelo experimental para estudo da leishmaniose tegumentar. Neste trabalho, foi investigada sua susceptibilidade à infecção experimental por Leishmania (L.) infantum chagasi, o agente etiológico da Leishmaniose Visceral Americana (LVA). Foram usados dez espécimes de C. apella oito adultos e dois jovens, quatro machos e seis fêmeas, todos nascidos e criados em cativeiro. Dois protocolos de infecção experimental foram feitos: i) seis macacos foram inoculados por via intradérmica (ID), na base da cauda com 2x106 formas promastigotas em fase estacionária de crescimento; ii) outros quatro macacos foram inoculados com 3x107 formas amastigotas de infecção visceral de hamsteres por duas vias diferentes: a) dois por via intravenosa (IV) e, b) outros dois pela via intraperitoneal (IP). A avaliação da infecção incluiu parâmetros: clínico: exame físico do abdômen, peso e temperatura corporal; b) parasitológico: aspirado de medula óssea por agulha para procura de amastigotas (esfregaço corado por Giemsa) e formas promastigotas (meio de cultura); c) imunológico: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e, resposta de hipersensibilidade tardia (DTH). Nos seis macacos inoculados ID (formas promastigotas) todos os parâmetros de avaliação da infecção foram negativos durante o período de 12 meses. Entre os quatro macacos inoculados com formas amastigotas, dois inoculados IV mostraram parasitos na medula óssea do primeiro ao sexto mês p.i. e em seguida houve a resolução da infecção, no entanto os outros dois inoculados IP foram totalmente negativos. Esses quatro macacos apresentaram resposta específica de anticorpo IgG desde o terceiro mês p.i. (IP: 1/80 e IV: 1/320) até o décimo segundo mês (IP: 1/160 e IV: 1/5120). A conversão DTH ocorreu em apenas um macaco inoculado IV com uma forte reação na pele (30 mm). Considerando esses resultados, nós não recomendamos o uso do macaco C. apella como modelo animal para estudo da LVA.

Atividade in vitro da fosfolipases A2 e da fração peptídica extraídas do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre formas amastogotas e promastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi

Pós-graduação em Doenças Tropicais - FMB

Serological evidence of Infection by Leishmania (Leishmania) infantum (Synonym: Leishmania (Leishmania) chagasi) in free-ranging wild mammals in a nonendemic region of the state of São Paulo, Brazil

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

A cross-sectional study on canine Leishmania (L.) infantum chagasi infection in Amazonian Brazil ratifies a higher prevalence of specific IgG-antibody response than delayed-type hypersensitivity in symptomatic and asymptomatic dogs

This was a cross-sectional study which analyzed the prevalence and the clinical and immunological spectrum of canine Leishmania (L.) infantum chagasi infection in a cohort of 320 mongrel dogs living in an endemic area of American visceral leishmaniasis in the Amazonian Brazil by using, mainly, the indirect fluorescence antibody test (IFAT-IgG) and the delayed-type hypersensitivity (DTH), and the parasite research by the popliteal lymph node aspiration. The IFAT and DTH reactivity recognized three different immune response profiles: (1) IFAT((+))/DTH(-) (107 dogs), (2) IFAT((-))/DTH(+) (18 dogs), and (3) IFAT((+))/DTH(+) (13 dogs), providing an overall prevalence of infection of 43 % (138/320). Thus, the specific prevalence of IFAT ((+)) /DTH ((-)) 33.4 % (107/320) was higher than those of IFAT ((-)) /DTH ((+)) 5.6 % (18/320) and IFAT ((+)) /DTH ((+)) 4.0 % (13/320). Moreover, the frequency of these profiles among 138 infected dogs showed that the IFAT ((+)) /DTH ((-)) rate of 77.5 % (107/138) was also higher than those of 13.0 % (18/138) of IFAT ((-)) /DTH ((+)) and 9.5 % (13/138) of IFAT ((+)) /DTH ((+)) rates. The frequency of asymptomatic dogs (76 %-105) was higher than those of symptomatic (16.6 %-23) and oligosymptomatic ones (7.4 %-10). A total of 16 (11.6 %) L. (L.) i. chagasi isolates were obtained from infected dogs, all from the IFAT ((+)) /DTH ((-)) profile: 41 % (9/22) from symptomatic, 33.3 % (3/9) from oligosymptomatic, and 5.2 % (4/76) from asymptomatic dogs. These findings strongly suggested that despite the higher frequency of asymptomatic dogs (76 %-105), the majority (72.4 %-76) was characterized by the IFAT ((+)) /DTH ((-)) profile with a doubtful immunogenetic resistance against infection.

Molecular and serological detection of tick-borne pathogens in dogs from an area endemic for Leishmania infantum in Mato Grosso do Sul, Brazil

Patógenos transmitidos por carrapatos atingem uma variedade de hospedeiros vertebrados. Para identificar os agentes patogênicos transmitidos por carrapatos entre cães soropositivos para Leishmania infantum no município Campo Grande-MS, foi realizado um estudo sorológico e molecular para a detecção de Ehrlichia canis, Anaplasma platys e Babesia vogeli em 60 amostras de soro e baço, respectivamente. Adicionalmente, foi realizado o diagnóstico confirmatório de L. infantum por meio de técnicas sorológicas e moleculares. Também foi realizado o alinhamento e análise filogenética das sequências para indicar a identidade das espécies de parasitas que infectam esses animais. Anticorpos IgG anti-Ehrlichia spp., anti-B. vogeli e anti-L. infantum foram detectados em 39 (65%), 49 (81,6%) e 60 (100%) dos cães amostrados, respectivamente. Vinte e sete (45%), cinquenta e quatro (90%), cinquenta e três (88,3%), dois (3,3%) e um (1,6%) cães mostraram-se positivos na PCR para E. canis, Leishmania spp., Leishmania donovani complex, Babesia sp. e Anaplasma sp., respectivamente. Após o seqüenciamento, os amplicons mostraram 99% de similaridade com isolados de E. canis, B. vogeli e A. platys e Leishmania chagasi. Os resultados deste estudo indicaram que os cães soropositivos para L. infantum de Campo Grande, MS, são expostos a vários agentes transmitidos por carrapatos, e, portanto, devem ser incluídos no diagnóstico diferencial em cães com suspeita clínica de leishmaniose.